Postepy Hig Med Dosw. (online), 2012; 66: 322-329
Review
Full Text PDF  

Renaturacja in vitro białek zakumulowanych w ciałach inkluzyjnych
In vitro renaturation of proteins from inclusion bodies
Dorota Porowińska, Ewelina Marszałek, Paulina Wardęcka, Michał Komoszyński
Zakład Biochemii, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu
Adres do korespondencji
prof. dr hab. Michał Komoszyński, Zakład Biochemii, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu, ul. Gagarina 9, 87-100 Toruń; e-mail: michkom@chem.uni.torun.pl

Otrzymano:  2011.11.03
Zaakceptowano:  2012.04.25
Opublikowano:  2012.06.11

Streszczenie
Rekombinowane białka i enzymy dzięki ich heterologicznej ekspresji w prokariotycznych sys­temach ekspresyjnych są powszechnie wykorzystywane w diagnostyce, medycynie i przemyśle. Wysoki poziom ekspresji obcych białek w komórkach bakteryjnych prowadzi jednak do tworze­nia nieaktywnych i nierozpuszczalnych agregatów - ciał inkluzyjnych.
Przywracanie zagregowanym białkom aktywności biologicznej jest procesem skomplikowanym i czasochłonnym. Każde reaktywowane białko wymaga eksperymentalnego ustalenia optymal­nych warunków. Wybór procedury i czas jej trwania zależą od rodzaju rekombinowanego białka, jego właściwości oraz czystości ciał inkluzyjnych.
Do reaktywacji białek zakumulowanym w ciałach inkluzyjnych niezbędne są 4 etapy: 1) izolacja ciał inkluzyjnych, 2) rozpuszczenie agregatów, 3) renaturacja i 4) oczyszczanie aktywnych kata­litycznie cząsteczek.
Wydajność procesu renaturacji zależy od wielu czynników: fizycznych, chemicznych i biologicz­nych. Parametry te determinują szybkość procesu, zapobiegają agregacji, wpływają na rozpusz­czalność i ułatwiają fałdowanie łańcuchów peptydowych oraz stabilizację fałdowanych cząsteczek.
Do najpowszechniej stosowanych metod renaturacji białek należą: rozcieńczenie, dializa oraz me­tody chromatograficzne.
Słowa kluczowe: ciała inkluzyjne • refałdowanie • renaturacja • chaperony


Summary
Recombinant proteins and enzymes are commonly used in many areas of our life, such as dia­gnostics, industry and medicine, due to heterologous synthesis in prokaryotic expression systems. However, a high expression level of foreign protein in bacteria cells results in formation of inac­tive and insoluble aggregates - inclusion bodies.
Reactivation of aggregated proteins is a complex and time-consuming process. Every protein re­quires experimental optimization of the process conditions. The choice of the refolding method depends on the type of recombinant protein and its physical, chemical and biological properties.
Recovery of the activity of proteins accumulated in inclusion bodies can be divided into 4 steps: 1) inclusion bodies isolation, 2) solubilization of aggregates, 3) renaturation, 4) purification of catalytically active molecules.
Efficiency of the refolding process depends on many physical factors and chemical and biologi­cal agents. The above parameters determine the time of the folding and prevent protein aggrega­tion. They also assist the folding and have an influence on the solubility and stability of native molecules.
To date, dilution, dialysis and chromatography are the most often used methods for protein refolding.
Key words: inclusion body • refolding • renaturation • chaperones




Wykaz skrótów:
BMC - bis-merkaptoacetamidocykloheksan; Chaps - 3-[(3-Cholamidopropyl)dimetyloamonio]-1-propanosiarczan; DsbA - oksydoreduktaza disiarczkowa; DsbC - izomeraza disiarczkowa; DTE - 1,4-ditioerytrytol; DTT - 1,4-ditiotreitol; EDTA - kwas wersenowy; EGTA - kwas etylenoglikol-O-O'-bis(2-aminoetyl)-N,N,N',N'-tetraoctowy; GSH - zredukowany glutation; GSSH - utleniony glutation; GuHCl - chlorowodorek guanidyny; IB - ciała inkluzyjne (inclusion body); NDSB - sulfobetaina (pozbawiona detergentów); PDI - izomeraza disiarczkowa białek; PEG - glikol polietylenowy; PPI - izomeraza prolinowa cis/trans; SDS - dodecylosiarczan sodu; TCEP - tris-(2-karboksyetylofosfina).
1. Wstęp
Obecnie stosuje się ponad 100 leków, których źródłem są komórki organizmów żywych, a ponad 1000 takich prepa­ratów jest w fazie badań klinicznych. Przeważająca więk­szość to białka rekombinowane, które stanowić mogą nową postać leków wykorzystywanych do leczenia chorób, na które jak dotąd nie ma skutecznego lekarstwa. Wśród nich są schorzenia związane z zaburzeniami genetycznymi, rak, nadciśnienie, czy AIDS. Ponadto ogromnie wzrosło wy­korzystanie białek oraz enzymów w diagnostyce, a także w przemyśle spożywczym, tekstylnym, skórzanym i che­micznym [7,29,39]. Wykorzystywanie tych cząsteczek w tak wielu dziedzinach życia jest możliwe dzięki ich syntezie w prokariotycznych i eukariotycznych systemach ekspre­syjnych [27,29,41,43]. Komórki ssaków i owadów pozwa­lają na uzyskanie aktywnych katalitycznie białek mających wszystkie niezbędne modyfikacje potranslacyjne. Jednakże hodowla tych komórek jest czasochłonna i bardzo kosztow­na, a ilość uzyskanego produktu jest przeważnie niewielka. Zastosowanie tego rodzaju systemów ogranicza się więc głównie do badań laboratoryjnych. W przeciwieństwie do komórek eukariotycznych, hodowla bakterii jest tania i po­zwala uzyskać, w krótkim czasie, duże ilości rekombino­wanych białek [4,27,30,31,34,38,39,41,43]. Dużą zaletą komórek prokariotycznych jest bardzo dobrze poznany me­chanizm transkrypcyji i translacji oraz możliwość zastoso­wania wielu różnych mutantów [7,27,29,39]. Z tego powo­du do produkcji białek, które do aktywności biologicznej nie wymagają potranslacyjnych modyfikacji, najczęściej wykorzystywane są mikroorganizmy (głównie Escherichia coli i Bacillus subtilis). Jednak w wielu przypadkach wy­soki poziom ekspresji heterologicznych białek w komór­kach bakteryjnych prowadzi do ich akumulacji w ciałach inkluzyjnych (inclusion bodies - IB) [4,27,29,31,39,41,43]. Przywrócenie aktywności (reaktywacja, renaturacja, refał­dowanie) białkom zgromadzonym w ciałach inkluzyjnych jest procesem skomplikowanym i ustalenie optymalnych warunków tego procesu wymaga przeprowadzenia wielu eksperymentów.
2. Ciała inkluzyjne
Ciała inkluzyjne to nierozpuszczalne i nieaktywne agrega­ty niesfałdowanych i/lub częściowo sfałdowanych białek. W komórce IB zwykle obecne są w cytoplazmie, w niewiel­kiej liczbie (przeważnie 1/kom.) [5,33,42]. Powstają w wy­niku nieswoistych oddziaływań hydrofobowych i/lub jono­wych między łańcuchami białkowymi [11,33,42]. Jednak, wbrew pozorom, są to struktury charakteryzujące się wy­sokim stopniem organizacji. Zagregowane w ciałach inklu­zyjnych białka tworzą liczne, ciasno upakowane struktu­ry β. Powstają zarówno w obrębie pojedynczego łańcucha polipeptydowego, jak również między łańcuchami różnych polipeptydów [11,45,46]. Jest to prawdopodobnie główna przyczyna nierozpuszczalności białek IB, a także ich od­porności na proteolityczną degradację [20,33,42]. Ciała in­kluzyjne charakteryzują się dużą jednorodnością [5,11,20]. Zawierają 40-90% rekombinowanego białka [3,33,42]. Resztę stanowią zanieczyszczenia, które możemy podzie­lić na dwie grupy. Pierwszą stanowią białka bakteryjne od­działujące z nowo syntetyzowanymi polipeptydami. Drugą grupą zanieczyszczeń są lipidy i białka błon zasocjowane z powierzchnią ciał inkluzyjnych [5,11,20,33].
Tworzenie ciał inkluzyjnych jest procesem złożonym i za­leżnym od wielu warunków środowiskowych oraz rodza­ju eksprymowanych białek. Do najważniejszych czynni­ków, które zwiększają prawdopodobieństwo tworzenia agregatów należą:
• lokalne wysokie stężenie syntetyzowanego białka,
• przejściowa akumulacja białek o całkowicie lub czę­ściowo nieprawidłowej konformacji,
• gromadzenie się fragmentów łańcuchów polipeptydo­wych powstałych w wyniku proteolitycznej degradacji białek,
• nieprawidłowy proces fałdowania białek,
• brak modyfikacji potranslacyjnych niezbędnych do uzyskania rozpuszczalności przez niektóre białka eukariotyczne,
• hamowanie tworzenia i/lub nieprawidłowe rozmieszcze­nie mostków disiarczkowych w redukcyjnym środowi­sku cytosolu bakteryjnego,
• toksyczny wpływ rekombinowanego białka na komór­ki bakteryjne.
Tworzenie ciał inkluzyjnych jest z pozoru procesem nie­pożądanym, ale ma także pewne zalety. Agregaty można łatwo i z dużą wydajnością wyizolować z lizatu komórko­wego, a to stanowi prostą drogę do oczyszczenia interesu­jącego nas białka [4,33].
3. Reaktywacja białek (refałdowanie)
Renaturacja jest procesem mającym na celu przywrócenie prawidłowej konformacji i aktywności biologicznej zdena­turowanym białkom z ciał inkluzyjnych. Badania dowiodły, że proces ten przebiega wieloetapowo, poprzez tworzenie struktur pośrednich. Motorem napędzającym proces refał­dowania są oddziaływania hydrofobowe. W pierwszym eta­pie tworzone są struktury drugorzędowe, które następnie tworzą bardziej skomplikowane konformacje przestrzenne.
Nie ma uniwersalnej metody reaktywacji. Każde białko wymaga eksperymentalnego ustalenia optymalnych wa­runków tego procesu. Wybór procedury i czas jej trwania zależy od rodzaju rekombinowanego białka, jego właści­wości oraz czystości ciał inkluzyjnych. Wydajność proce­su reaktywacji białek jest różna, jednak przeważnie wyno­si zaledwie 15-25% całkowitego zagregowanego białka.
Przywracanie aktywności białkom z ciał inkluzyjnych obejmuje 4 etapy:
1. Izolację ciał inkluzyjnych z komórek bakteryjnych i ich oczyszczanie.
2. Rozpuszczenie zagregowanych białek.
3. Renaturację peptydów.
4. Oczyszczanie aktywnych katalitycznie białek.
Najważniejszy jest etap trzeci bowiem od niego zależy sku­teczność całego procesu [5,33,47].
3.1. Izolacja i oczyszczanie ciał inkluzyjnych
Duża gęstość ciał inkluzyjnych (większa niż organelli ko­mórkowych) umożliwia ich łatwe izolowanie z lizatów bakteryjnych poprzez wirowanie. Dla wydajności tego procesu bardzo ważne jest, aby struktura komórek uległa pełnej dezintegracji. W przeciwnym razie podczas wiro­wania nieuszkodzone komórki będą sedymentowały wraz z ciałami inkluzyjnymi [17,20,30,31,35]. Proces dezinte­gracji komórek może być prowadzony metodami mecha­nicznymi, chemicznymi, enzymatycznymi lub ich kombi­nacjami. Najczęściej stosowane są sposoby mechaniczne: sonifikacja, prasa Frencha i wysokociśnieniowa homogeni­zacja dla dużych hodowli przemysłowych. Wydajność tych procesów można zwiększyć dodając do zawiesiny bakterii lizozym i EDTA [17,20,30,31,33].
W celu usunięcia zanieczyszczeń z powierzchni ciał inklu­zyjnych wyizolowane IB przemywa się kilkakrotnie bufo­rem zawierającym detergenty (np. Triton X-100, SDS) lub niskie stężenia związków chaotropowych (np. chlorowo­dorek guanidyny, mocznik). Zbyt wysokie stężenie tych związków może doprowadzić do rozpuszczenia również agregatów [17,30,35,41].
Alternatywnym sposobem izolacji ciał inkluzyjnych z ko­mórek bakteryjnych jest metoda chemiczna opisana przez Falconera i wsp. [17]. Polega na ekstrakcji białek bakteryj­nych przez zwiększenie przepuszczalności błony komór­kowej z użyciem roztworu mocznika, EDTA i związków ułatwiających tworzenie mostków disiarczkowych. W tych warunkach powierzchnia IB ulega utlenieniu, dzięki cze­mu nie ulegają one rozpuszczeniu. Istotną wadą tej metody jest to, iż może być stosowana tylko do białek zawierają­cych duże ilości reszt cysteinowych. Niewielka modyfi­kacja procedury, polegająca na użyciu mieszaniny Triton X-100 i EDTA, pozwala na jej wykorzystanie do izolacji większej liczby białek. Metoda ta jest najczęściej stoso­wana w preparatyce ciał inkluzyjnych na skalę przemy­słową. Umożliwia bowiem wyizolowanie zagregowanych białek bezpośrednio z zawiesiny bakteryjnej. W procesie tym uwalniane są jednak znaczne ilości DNA, co prowadzi do wzrostu lepkości preparatu. Skutkiem tego są problemy z otrzymaniem czystego produktu. Precypitacja DNA za pomocą sperminy lub innych czynników strącających lub degradujących kwas dezoksyrybonukleinowy może roz­wiązać ten problem [17].
3.2. Rozpuszczanie ciał inkluzyjnych
Do rozpuszczania ciał inkluzyjnych zwykle stosuje się wy­sokie stężenia związków denaturujących, takich jak 6M chlorowodorek guanidyny czy 8M mocznik [17,30,31,43]. Częściej stosowany jest GuHCl ze względu na silniejsze właściwości chaotropowe. Roztwory mocznika mogą być zanieczyszczone cyjanianem, który podczas długiej inku­bacji w alkalicznym środowisku karbamoiluje wolne gru­py aminowe w łańcuchu polipeptydowym. Dodatkowo roz­puszczalność ciał inkluzyjnych w moczniku zależy od pH. Dla każdego białka optimum pH tego procesu ustala się doświadczalnie [30,31,33, 41,43]. W wyniku denaturacji przez chlorowodorek guanidyny lub mocznik zagregowa­ne białka ulegają rozfałdowaniu eksponując hydrofobowe fragmenty łańcucha na zewnątrz cząsteczki. Alternatywną techniką jest tzw. metoda łagodnego rozpuszczania, której celem jest solubilizacja zagregowanych białek bez utraty ich struktury drugorzędowej. Efekt ten uzyskuje się sto­sując bufory zawierające niewielkie stężenia związków denaturujących, detergenty (SDS, CTAB, sarkozyl) i/lub argininę, która zapobiega agregacji. Metoda ta pozwala uzyskać w pełni lub częściowo aktywne cząsteczki bia­łek. Dalsze etapy renaturacji są wówczas znacznie łatwiej­sze lub w ogóle nie są konieczne. Podobny efekt rozpusz­czenia dają bufory o ekstremalnym pH zawierające (lub nie) niskie stężenia związków denaturujących. Takie po­stępowanie może jednak prowadzić do nieodwracalnych zmian w strukturze białek prowadzących do ich denatu­racji [20,31,33].
W procesie rozpuszczania ciał inkluzyjnych stosuje się również związki chelatujące jony metali (EDTA, EGTA) oraz niskocząsteczkowe związki tiolowe (b-merkaptoeta­nol, 1,4-ditiotreitol (DTT), 1,4-ditioerytrytol (DTE), cyste­ina). Pierwsze z nich pozwalają uniknąć utleniania cysteiny z udziałem metali. Natomiast związki redukujące rozry­wają nieprawidłowo utworzone wiązania disiarczkowe we­wnątrz cząsteczek i między łańcuchami. Wiązania te mogą tworzyć się podczas dezintegracji komórek bakteryjnych. Ponadto obecność w ciałach inkluzyjnych proteaz wyma­ga dodania do mieszaniny ekstrakcyjnej inhibitorów tych enzymów. Zapobiega to lub ogranicza proteolityczną de­gradację białek podczas procesu rozpuszczania [20,30,41].
Jeśli rekombinowane białko stanowi mniej niż 2-5% cał­kowitej ilości białek bakteryjnych lub mniej niż 2/3 białek ciał inkluzyjnych zalecane jest przeprowadzenie procesu oczyszczania zdenaturowanych agregatów przed rozpoczę­ciem renaturacji [41]. Do oczyszczania IB wykorzystuje się różne rodzaje chronografii (powinowactwa, jonowymien­ną, sączenie molekularne w warunkach denaturujących), które pozwalają na selektywne wyizolowanie interesują­cego nas rekombinowanego białka. Oczyszczanie rozpusz­czonych polipeptydów przed rozpoczęciem renaturacji nie jest konieczne w przypadku stosowania sączenia moleku­larnego, jako metody reaktywacji, ponieważ pozwala ona na jednoczesną renaturację i oczyszczanie białka [4,41].
3.3. Renaturacja białek ciał inkluzyjnych
W zależności od rodzaju białka renaturacja in vitro może trwać od kilku sekund do kilku dni. Proces prawidłowego zwijania łańcucha polipeptydowego konkuruje z procesa­mi denaturacji białek oraz ich agregacją. Przyczyną są od­działywania międzycząsteczkowe występujące między wy­eksponowanymi hydrofobowymi fragmentami łańcuchów polipeptydowych pozbawionych struktury drugo- i trzecio­rzędowej. Jest to główny powód niskiej wydajności refał­dowania [13,30,32,40]. Ograniczenie agregacji jest więc głównym zadaniem w procesie reaktywacji białek.
Proces renaturacji składa się z dwu zachodzących jedno­cześnie etapów. Pierwszy polega na usunięciu nadmiaru związków denaturujących i tiolowych stosowanych podczas rozpuszczania ciał inkluzyjnych. Związki te mogą nega­tywnie wpływać na proces ponownego fałdowania białek [32,41,43,44]. Przed ich usunięciem należy jednak obni­żyć pH mieszaniny. Zapobiega to formowaniu się nowych, nieprawidłowych wiązań [5]. Drugi etap to tworzenie opty­malnych warunków środowiska (m.in. temperatura, pH, siła jonowa, stężenie białka) do prawidłowego fałdowa­nia łańcucha polipeptydowego [32,40,44]. Optymalizacja warunków renaturacji jest konieczna do przywrócenia prawidłowej konformacji białkom i odzyskania ich aktyw­ności biologicznej [8,17]. Właściwe parametry fizyczne re­naturacji, czynniki chemiczne i biologiczne należy dobie­rać indywidualnie dla każdego białka. Wpływ na to ma: długość łańcucha, punkt izoelektryczny, obecność wiązań disiarczkowych oraz inne właściwości fizyko-chemiczne polipeptydów.
3.3.1. Czynniki fizyczne wpływające na refałdowanie
Podstawowym parametrem, odgrywającym znaczącą rolę w procesie fałdowania jest stężenie białka w środowisku renaturacyjnym. Utworzenie prawidłowo zwiniętego łańcu­cha maleje wraz ze wzrostem stężenia białka. Najczęściej stosuje się stężenia w zakresie 10-100 µg/ml [13,17,41]. Ogranicza to w znacznym stopniu agregację cząsteczek białka i zwiększa wydajność prowadzonego procesu.
Każde białko ma inne optimum temperatury, w którym jest termodynamicznie stabilne [41]. Parametr ten reguluje szybkość procesu renaturacji, a także wpływa na intensyw­ność agregacji białek. Niska temperatura ogranicza two­rzenie oddziaływań hydrofobowych między cząsteczkami. Sprzyja to prawidłowemu fałdowaniu łańcuchów polipep­tydowych. Spowalnia jednak cały proces i przez to wydłu­ża czas jego trwania [41].
Wydajność reaktywacji w istotny sposób zależy również od pH środowiska, ze względu na jego wpływ na ładu­nek białek. Od niego zależy stabilność, rozpuszczalność oraz kinetyka tworzenia wiązań disiarczkowych. pH roz­tworu do renaturacji powinno być o 1-2 jednostki wyższe od punktu izoelektrycznego fałdowanego białka. W tych warunkach zwiększa się rozpuszczalność polipeptydów i tym samym zmniejsza ryzyko ich agregacji. Jeśli białko w swojej strukturze zawiera mostki disiarczkowe, optymal­ne pH powinno zawierać się między 7,5 a 10. Środowisko alkaliczne ułatwia bowiem tworzenie poprawnych wiązań typu -S-S-. Długi czas działania pH niższego od 3,5 lub wyższego od 10,5 może spowodować chemiczne modyfi­kacje białek [28].
Istotnym czynnikiem wpływającym na poprawność fałdo­wania jest ciśnienie hydrostatyczne. Renaturacja prowa­dzona przy wysokim ciśnieniu (ok. 3 kbar) w obecności niedenaturujących stężeń GuHCl ogranicza akumulację białek i niszczy już utworzone agregaty. Powstałe w ten sposób monomery utrzymują swoją strukturę drugorzę­dową, a stopniowe zmniejszanie ciśnienia do 1,5-2 kbar pozwala na przyjmowanie natywnych konformacji nawet przy wysokim stężeniu białka [10,17,41].
3.3.2. Czynniki chemiczne wpływające na refałdowanie
W procesie renaturacji białek stosowane są następujące związki chemiczne: aceton, acetamid, cukry i ich pochod­ne, alkohole o krótkich łańcuchach, rozpuszczalniki orga­niczne, DMSO, jony (najczęściej Zn2+, Ca2+) i inne kofak­tory, detergenty jonowe i niejonowe (Chaps, SDS, Tween 80, Triton X-100, NDBS 201), denaturanty (GuHCl i mocz­nik) w niskich stężeniach, PEG oraz substraty enzymów. Powyższe związki wpływają na rozpuszczalność zdenaturo­wanych białek oraz stabilność stanów przejściowych i pra­widłowo zwiniętych łańcuchów polipeptydowych. Zwiększa to wydajność procesu renaturacji. Zaletą stosowania ww. związków jest łatwość ich usunięcia ze środowiska używa­nego w procesie reaktywacji białek [17,21,32,35].
Związkiem najczęściej używanym do ochrony białek przed agregacją jest 0,4 do 1M L-arginina. Aminokwas ten był stosowany w renaturacji większości dotychczas analizowa­nych białek. Mechanizm działania Arg nie został jeszcze w pełni poznany. Sądzi się, że arginina ogranicza oddzia­ływania białko-białko i białko-powierzchnia, co zmniej­sza agregację polipeptydów i ułatwia ich oczyszczanie [6,8,20]. Zmiana rozpuszczalności zdenaturowanego biał­ka w obecności argininy wynika z hydrofobowego oddzia­ływania tego związku z aminokwasami łańcucha polipep­tydowego [1,6]. Grupa guanidynowa argininy oddziałuje z resztami tryptofanu łańcucha polipeptydowego, co praw­dopodobnie zwiększa rozpuszczalność białek i zmniejsza ryzyko tworzenia agregatów [1,33].
Detergenty znajdujące się w roztworach do renaturacji rów­nież skutecznie zmniejszają agregację białka. NDBS 201, to związek pozbawiony hydrofobowego łańcucha, charak­terystycznego dla detergentów, co jest powodem jego uży­wania w renaturacji białek w wysokim stężeniu.
Kofaktory, takie jak jony cynku i miedzi, mogą stabilizować białka już na poziomie intermediatów ich fałdowania [20].
Równie istotnym procesem jak działania antyagregacyj­ne jest zapewnienie odpowiednich warunków do tworze­nia mostków disiarczkowych. Białka, które mają liczne wiązania typu -S-S- wymagają środowiska zawierającego związki utleniające i redukujące. Pozwala to na prawidło­we formowanie ww. wiązań w fałdujących cząsteczkach. Najprostszym sposobem utleniania białek jest wykorzysta­nie tlenu atmosferycznego w obecności metali, jako kata­lizatorów. Najczęściej stosowane są pary związków tiolo­wych, np. GSH/GSSH, DTT/GSSH oraz cysteina/cystyna w stężeniu 5-15 mM. Jednocześnie stosunek ilościowy po­staci zredukowanej do utlenionej nie powinien przekraczać 1:1 lub 5:1 [4,20,33,41]. Stwierdzono, że bardziej skutecz­nym od omawianych wyżej związków w tworzeniu natyw­nych mostków disiarczkowych jest BMC, który naśladuje działanie izomerazy disiarczkowej (PDI). W refałdowaniu białek niezawierających w cząsteczce wiązań typu -S-S- stosuje się TCEP. Związek ten jest nietiolowym redukto­rem działającym znacznie silniej niż powszechnie używa­ny DTT. Zapobiega on formowaniu wewnątrz cząsteczki nieswoistych wiązań disiarczkowych, które mogą zaburzać prawidłową konformację białka [36].
3.3.3. Zastosowanie czynników biologicznych do refałdowania in vitro
W laboratoriach coraz częściej tworzy się warunki, któ­re naśladują proces fałdowania białek in vivo. W tym celu wykorzystuje się białka opiekuńcze (chaperony) i inne białka wspomagające proces fałdowania (foldazy) [17,43]. W komórkach odgrywają one zasadniczą rolę w procesie fałdowania nowo syntetyzowanych białek, ułatwiając łań­cuchom polipeptydowym przyjęcie prawidłowej konforma­cji. Białka opiekuńcze ograniczają nieswoiste oddziaływa­nia w obrębie łańcuchów polipeptydowych i między nimi [15]. Uczestniczą również w właściwej dystrybucji białek w komórce oraz reaktywacji już zagregowanych polipep­tydów. Dodatkowo białka opiekuńcze uczestniczą w trans­lokacji białek poprzez membrany oraz chronią białka ko­mórkowe w sytuacjach stresowych poprzez hamowanie ich agregacji [2,14,15,20,24,25,26,49].
a) Białka opiekuńcze - chaperony
W procesie renaturacji białek najczęściej wykorzystywa­ne są chaperony bakteryjne: GroEL/GroES, DnaK/DnaJ/GrpE i ClpA/ClpB [4].
W zależności od pełnionej funkcji, białka opiekuńcze mo­żemy podzielić na dwie grupy. Pierwszą stanowią biał­ka, które wiążąc się do nieprawidłowo zwiniętych poli­peptydów, zapobiegają ich agregacji. Są to tzw. „holder chaperones", do których należą IbpA i IbpB. Do drugiej grupy należą „folder chaperones", m.in. systemy DnaK/J i GroEL/ES, które uczestniczą w formowaniu właściwej konformacji polipeptydów. Zastosowanie białek opiekuń­czych w procesie renaturacji ogranicza wysoki koszt (nie­zbędne jest ich wysokie stężenie) oraz konieczność ich usunięcia z roztworu po zakończeniu renaturacji. Dlatego stosowanie chaperonów w procesach na dużą skalę jest mało opłacalne [22,31]. Odmienne zestawy białek opie­kuńczych mogą w różny sposób wpływać na proces fał­dowania różnych białek, tak więc ich wybór należy usta­lić eksperymentalnie [22].
Wysoki koszt stosowania chaperonów można obniżać im­mobilizując je na stałych nośnikach i/lub wykorzystując tzw. sztuczne chaperony (np. cyklodekstrynę) [17,41]. Ułatwia to i przyspiesza izolację oraz oczyszczanie produktów re­naturacji, a także umożliwia ponowne użycie unierucho­mionych białek. Cyklodekstryny pozwalają na wykorzy­stanie detergentów do rozpuszczania ciał inkluzyjnych. Tworzą odwracalne kompleksy z hydrofobowymi łatka­mi na powierzchni zdenaturowanych białek, zapobiegając ich agregacji i zwiększając w ten sposób wydajność pro­cesu renaturacji. Mimo wyżej wymienionych zalet, reak­tywacja z zastosowaniem immobilizowanych sztucznych chaperonów jest mniej wydajna niż w przypadku rozpusz­czalnych form tych cząsteczek [37].
b) Inne białka wspomagające proces fałdowania - foldazy
Podczas gdy chaperony sprzyjają odpowiedniemu fał­dowaniu, foldazy mogą ułatwiać ten proces. Enzymy te wspomagają m.in. tworzenie i rozmieszczenie mostków disiarczkowych w obrębie fałdujących cząsteczek białka. Do najczęściej wykorzystywanych foldaz w refałdowa­niu należą: izomeraza prolinowa cis/trans (PPI), oksydo­reduktaza disiarczkowa (DsbA), izomeraza disiarczkowa (DsbC) oraz izomeraza disiarczkowa białek (PDI) [4,48].
c) Propeptydy
Innym sposobem zwiększania wydajności refałdowania jest wykorzystanie tzw. propeptydów. Są to fragmenty łańcucha białkowego zwykle umiejscowione między se­kwencją sygnałową, a dojrzałą częścią łańcucha białko­wego. In vivo propeptydy wspomagają proces prawidło­wego zwijania się białek. Badania in vitro wykazały, że propeptydy mogą zwiększać wydajność refałdowania za­równo, gdy są syntetyzowane wraz z łańcuchem polipep­tydowym, jak i wtedy, gdy są oddzielnie dodawane do bu­foru renaturacyjnego [41].
Podczas syntezy in vivo lub tuż po jej zakończeniu wiele białek jest transportowanych przez dwuwarstwową błonę. Proces ten można naśladować stosując trójfazowy system refałdowania. Fazę górną stanowi roztwór organiczny od­dzielony od buforu do renaturacji (faza dolna) za pomocą oleju parafinowego (faza środkowa), który pełni rolę „mem­brany". W takim układzie zdenaturowane białko dodaje się do fazy górnej i poprzez wirowanie zmusza do przejścia przez warstwę parafiny do fazy dolnej [41].
4. Techniki renaturacji
W ostatnich latach opracowano wiele metod renaturacji białek izolowanych z ciał inkluzyjnych. Do najpowszech­niej stosowanych należą:
• refałdowanie przez rozcieńczenie,
• metoda dializy,
• renaturacja białek związanych z fazą stałą.
Procesy te polegają na fizycznym oddzieleniu cząsteczek fałdowanych łańcuchów polipeptydowych. Pozwala to na redukcję oddziaływań białko-białko, co zmniejsza agre­gację i w efekcie zwiększa odzysk aktywnych cząsteczek [19,33]. Wybór metody zależy od skłonności białka do agregacji oraz kinetyki refałdowania [4].
4.1. Renaturacja metodą rozcieńczania
Jest to najprostsza i zarazem najczęściej stosowana meto­da renaturacji białek. Polega ona na silnym rozcieńczeniu roztworu zdenaturowanych ciał inkluzyjnych buforem do refałdowania. Umożliwia to prawidłowe fałdowanie łań­cuchów polipeptydowych i przyjęcie natywnej konforma­cji. Gwałtowne obniżenie stężenia związków denaturu­jących, w których rozpuszczone zostały ciała inkluzyjne oraz znaczne obniżenie stężenia renaturowanego białka (do 1-10 µg/ml) zapobiegają powstawaniu wewnątrz- i mię­dzycząsteczkowych oddziaływań i tym samym agrega­cji [17,19,44]. Odpowiednia temperatura oraz czas trwa­nia jego reaktywacji pozwalają na uzyskanie prawidłowo sfałdowanych i aktywnych katalitycznie białek.
Metoda ta jest czasochłonna, a ze względu na bardzo ni­skie stężenia białka mało wydajna. Wymaga użycia dużych zbiorników, ogromnej ilości buforu, a po renaturacji wie­lu dodatkowych etapów zagęszczania i oczyszczania biał­ka. Wiąże się to z wysokimi kosztami [19,31]. Z tych po­wodów reaktywacja przez rozcieńczanie z powodzeniem stosowana jest w warunkach laboratoryjnych, jednak nie stosuje się jej na skalę przemysłową [17,19,23,31].
Odmianą refałdowania przez rozcieńczanie jest tzw. re­naturacja pulsacyjna. Polega na dodawaniu do buforu re­naturacyjnego zdenaturowanych i rozpuszczonych IB nie jednorazowo, ale małymi porcjami [20,31,33]. Odstępy czasowe między kolejnymi porcjami dodawanego białka muszą być ustalone doświadczalnie. Zakłada się, że mała ilość zdenaturowanego białka łatwiej przyjmuje natywną konformację, a prawidłowo zwinięte cząsteczki nie tworzą agregatów z niesfałdowanymi peptydami. Ten sposób pro­wadzenia renaturacji umożliwia znaczne zwiększenie koń­cowego stężenia białka w buforze do refałdowania [41].
Alternatywną do wyżej opisanej metody jest tzw. odwrot­ne rozcieńczanie. W metodzie tej bufor renaturujący jest dodawany do zdenaturowanych białek. Prowadzi to do jed­noczesnego, stopniowego obniżania tak stężenia refoldo­wanych białek, jak i związków denaturujących [9].
4.2. Renaturacja metodą dializy
W metodzie tej zdenaturowane białko dializowane jest do buforu renaturującego zawierającego czynniki sprzyjają­ce prawidłowemu fałdowaniu łańcuchów polipeptydowych. Podczas tego procesu stężenie denaturanta jest stopniowo zmniejszane, co umożliwia przyjęcie przez białka właści­wej konformacji [4,40].
Dializa nie wymaga użycia dużych ilości buforów, a stoso­wane stężenia białka mogą być znacznie wyższe niż w przy­padku rozcieńczania. Przez to metoda ta może być znacz­nie wydajniejsza od omawianej poprzednio. Jednak zbyt szybkie usuwanie związków denaturujących i/lub zbyt wy­sokie stężenie denaturowanych białek mogą sprzyjać agre­gacji niesfałdowanych lub częściowo sfałdowanych cząste­czek [4,31,44]. Dobór parametrów zależy od rodzaju białka i powinien zostać wyznaczony eksperymentalnie. Ponadto wydajność renaturacji może obniżyć również nieswoista adsorpcja białek na membranie dializacyjnej [19,31,41].
Odmianą powyższej metody jest dializa roztworu białka do serii buforów o malejącym stężeniu składników dena­turujących [4]. Takie stopniowe i powolne obniżanie stę­żenia denaturantów zmniejsza ryzyko agregacji niesfał­dowanych łańcuchów polipeptydowych, jednak znacznie wydłuża czas prowadzonego procesu.
4.3. Renaturacja z zastosowaniem chromatografii kolumnowej
Do renaturacji rekombinowanych białek izolowanych z ciał inkluzyjnych stosuje się również chromatografię. Początkowo metoda ta była wykorzystywana tylko wtedy, gdy inne sposoby (rozcieńczenie lub dializa) były niesku­teczne. Obecnie ten sposób renaturacji białek jest stoso­wany coraz częściej. Istotą reaktywacji na kolumnie jest związanie zdenaturowanych polipeptydów z wybranym złożem chromatograficznym. Pozwala to na fizyczne od­dzielenie od siebie cząsteczek zdenaturowanego białka o wysokiej hydrofobowości. Następnie, w celu usunięcia substancji denaturującej z kolumny, przemywa się ją bufo­rem do renaturacji [17,31,43,44]. Modyfikacją tej metody jest zastosowanie chromatografii z malejącym gradientem stężenia denaturanta przy jednoczesnym rosnącym stęże­niu buforu renaturacyjnego. Stopniowe wymywanie sub­stancji chaotropowej zapobiega ponownej agregacji białek i sprawia, że renaturacja przebiega w łagodnych warunkach. Końcowym etapem procesu jest wymywanie sfałdowane­go białka z kolumny za pomocą czynników wykazujących wyższe powinowactwo do nośnika [4,16,41].
Podstawową zaletą renaturacji białek na kolumnie jest fi­zyczny rozdział niesfałdowanych i częściowo sfałdowanych cząsteczek związanych z nośnikiem [19,31,33,44]. Umożliwia to prowadzenie całego procesu przy znacznie wyższych stę­żeniach białka niż w przypadku wcześniej opisanych metod. Przestrzenna separacja poszczególnych intermediatów za­pobiega oddziaływaniom o charakterze białko-białko i tym samym zmniejsza agregację i zwiększa wydajność proce­su [16,19]. Dodatkowo poprawnie sfałdowane cząsteczki są oddzielane od agregatów, które mogą zostać poddane re­naturacji powtórnie, zwiększając końcowy odzysk zrena­turowanych białek [16]. Ponadto refałdowanie na kolumnie pozwala na jednoczesne oczyszczanie preparatu, dlatego możliwe jest nakładanie surowych, nieoczyszczonych ho­mogenatów komórkowych [12,17,41]. Dodatkowym atutem tej metody jest możliwość automatyzacji i łatwe zwiększe­nie skali całego procesu, co może mieć znaczący wpływ na jego wykorzystanie na skalę przemysłową.
Do najczęściej stosowanych technik renaturacji z udziałem chromatografii należą: sączenie molekularne oraz chro­matografie: jonowymienna, hydrofobowa i powinowac­twa. Najpowszechniej stosuje się nośniki jonowymienne, głównie ze względu na ich dużą pojemność wiązania bia­łek oraz możliwość dokładnej kontroli procesu.
5. Podsumowanie
Ciała inkluzyjne są bogatym źródłem wielu białek wyko­rzystywanych w medycynie i eksperymentach naukowych. Ograniczeniem szerokiego stosowania tych białek jest brak wydajnych i uniwersalnych metod ich renaturacji. Każde re­kombinowane białko wymaga indywidualnego określenia optymalnych parametrów renaturacji, które umożliwią pra­widłowe fałdowanie łańcucha polipeptydowego. Techniki skojarzone z „sztucznymi chaperonami" (cyklodekstryna­mi) pozwalają na stosunkowo szybkie i precyzyjne opra­cowanie metod formowania poprawnej struktury białek.
Naszym zdaniem z przedstawionych wyżej procedur re­naturacji najbardziej przyszłościowe są metody wykorzy­stujące chromatografię, które pozwalają na oczyszczenie w tym samym eksperymencie, poprzez separację, białek poprawnie zwiniętych od zdenaturowanych.
PIŚMIENNICTWO
[1] Arakawa T., Ejima D., Tsumoto K., Obeyama N., Tanaka Y., Kita Y., Timasheff S.N.: Suppression of protein interactions by arginine: a proposed mechanism of the arginine effects. Biophys. Chem., 2007; 127: 1-8
[PubMed]  
[2] Ben-Zvi A., De Los Rios P., Dietler G., Goloubinoff P.: Active solubilization and refolding of stable protein aggregates by cooperative unfolding action of individual Hsp70 chaperones. J. Biol. Chem., 2004; 279: 37298-37303
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[3] Cabrita L.D., Bottomley S.P.: Protein expression and refolding - a practical guide to getting the most out of inclusion bodies. Biotechnol. Annu. Rev., 2004; 10: 31-50
[PubMed]  
[4] Cabrita L.D., Chow M.K., Bottomley S.P.: A practical guide to protein expression and refolding from inclusion bodies. Biotechnology, 2004; 10: 1-15
[5] Carrió M.M., Villaverde A.: Construction and deconstruction of bacterial inclusion bodies. J. Biotechnol., 2002; 96: 3-12
[PubMed]  
[6] Chen J., Liu Y., Wang Y., Ding H., Su Z.: Different effects of L-arginine on protein refolding: Suppressing aggregates of hydrophobic interaction, not covalent binding. Biotechnol. Prog., 2008; 24: 1365-1372
[PubMed]  
[7] Chou C.P.: Engineering cell physiology to enhance recombinant protein production in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2007; 76: 521-532
[PubMed]  
[8] Chow M.K., Amin A.A., Fulton K.F., Whisstock J.C., Buckle A.M., Bottomley S.P.: REFOLD: an analytical database of protein refolding methods. Protein Expr. Purif., 2006; 46: 166-171
[PubMed]  
[9] Clark E.D.: Protein refolding for industrial processes. Curr. Opin. Biotechnol., 2001; 12: 202-207
[PubMed]  
[10] Crisman R.L., Randolph T.W.: Refolding of proteins from inclusion bodies is favored by a diminished hydrophobic effect at elevated pressures. Biotechnol. Bioeng., 2008; 102: 483-492
[PubMed]  
[11] Fahnert B., Lilie H., Neubauer P.: Inclusion bodies: formation and utilisation. Adv Biochem. Eng. Biotechnol., 2004; 89: 93-142
[PubMed]  
[12] Fan X., Xu D., Lu B., Xia J., Wei D.: Refolding and purification of rhNTA protein by chromatography. Biomed. Chromatogr., 2009; 23: 257-266
[PubMed]  
[13] Georgiou G., Valax P., Ostermeier M., Horowitz P.M.: Folding and aggregation of TEM β-lactamase: Analogies with the formation of inclusion bodies in Escherichia coli. Protein Sci., 1994; 11: 1953-1960
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[14] Goloubinoff P., Mogk A., Zvi A.P., Tomoyasu T., Bukau B.: Sequential mechanism of solubilization and refolding of stable protein aggregates by a bichaperone network. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999; 96: 13732-13737
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[15] Hendrick J.P., Hartl F.U.: The role of molecular chaperones in protein folding. FASEB J., 1995; 9: 1559-1569
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[16] Hutchinson M.H., Chase H.A.: Adsorptive refolding of histidine-tagged glutathione S-transferase using metal affinity chromatography. J. Chromatorg. A., 2006; 1128: 125-132
[PubMed]  
[17] Jungbauer A., Kaar W.: Current status of technical protein refolding. J. Biotechnol., 2007; 128: 587-596
[PubMed]  
[18] Kędzierska S.: Rola białek opiekuńczych Escherichia coli w ochronie komórki bakteryjnej przed nieodwracalną agregacją białek indukowaną termicznie. Postępy Biochem., 2005; 51: 146-153
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[19] Li M., Su Z.G., Janson J.C.: In vitro protein refolding by chromatographic procedures. Protein Expr. Purif., 2004; 33: 1-10
[PubMed]  
[20] Lilie H., Schwarz E., Rudolph R.: Advances in refolding of proteins produced in E. coli. Curr. Opin. Biotechnol., 1998; 9: 497-501
[PubMed]  
[21] Mannall G.J., Titchener-Hooker N.J., Dalby P.A.: Factors affecting protein refolding yields in a fed-batch and batch-refolding system. Biotechnol. Bioeng., 2007; 97: 1523-1534
[PubMed]  
[22] Marco A., Deuerling E., Mogk A., Tomoyasu T., Bukau B.: Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli. BMC Biotechnol., 2007; 7: 32
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[23] Middelberg A.P.: Preparative protein refolding. Trends Biotechnol., 2002; 20: 437-443
[PubMed]  
[24] Mogk A., Schlieker C., Friedrich K.L., Schőnfeld H.J., Vierling E., Bukau B.: Refolding of substrates bound to small Hsps relies on a dissagregation reaction mediated most efficiently by ClpB/DnaK. J. Biol. Chem., 2003; 278: 31033-31042
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[25] Mogk A., Tomoyasu T., Goloubinoff P., Rűdiger S., Rőder D., Langen H., Bukau B.: Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. EMBO J., 1999; 18: 6934-6949
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[26] Nam S.H., Walsh M.K.: Characterization of interaction between Escherichia coli molecular chaperones and immobilized caseins. Prep. Biochem. Biotechnol., 2003; 33: 321-339
[PubMed]  
[27] Nuc P, Nuc K.: Produkcja rekombinowanych białek w Escherichia coli. Postępy Biochem., 2006; 52: 448-456
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[28] Qoronfleh M.W., Hesterberg L.K., Seefeldt M.B.: Confronting high-throughput protein refolding using high pressure and solution screens. Protein Expr. Purif., 2007; 55: 209-224
[PubMed]  
[29] Rai M., Padh H.: Expression systems for production of heterologous proteins. Curr. Sci., 2001; 80: 1121-1128
[PubMed]  
[30] Rudolph R., Lilie H.: In vitro folding of inclusion body proteins. FASEB J., 1996; 50: 49-56
[31] Sahdev S., Khattar S.K., Saini K.S.: Production of active eukaryotic proteins through bacterial expression systems: a review of the existing biotechnology strategies. Mol. Cell. Biochem., 2008; 307: 249-264
[PubMed]  
[32] Seckler R., Jaenicke R.: Protein folding and protein refolding. FASEB J., 1992; 6: 2545-2552
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[33] Singh S.M., Panda A.K.: Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J. Biosci. Bioeng., 2005; 99: 303-310
[PubMed]  
[34] Staroń A., Grabowska A., Jagusztyn-Krynicka E.K.: Nadprodukcja i oczyszczanie rekombinowanych, heterologicznych białek w komórkach Escherichia coli. Postępy Mikrobiol., 2008; 47: 83-95
[35] Swartz J.R.: Advances in Escherichia coli production of therapeutic proteins. Curr. Opin. Biotechnol., 2001; 12: 195-201
[PubMed]  
[36] Swope Willis M., Hogan J.K., Prabhakar P., Liu X., Tsai K., Wei Y., Fox T.: Investigation of protein refolding using a fractional factorial screen: A study of reagent effects and interactions. Protein Sci., 2005; 14: 1818-1826
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[37] Świętnicki W.: Folding aggregated proteins into functionally active forms. Curr. Opin. Biotechnol., 2006; 17: 367-372
[PubMed]  
[38] Tate C.G., Haase J., Baker C., Boorsma M., Magnani F., Vallis Y., Williams D.C.: Comparison of seven different heterologous protein expression systems for the production of the serotonin transporter. Biochim. Biophys. Acta, 2003; 1610: 141-153
[PubMed]  
[39] Terpe K.: Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2006; 72: 211-222
[PubMed]  
[40] Tsumoto K., Ejima D., Kumagai I., Arakawa T.: Practical considerations in refolding proteins from inclusion bodies. Protein Expr. Purif., 2003; 28: 1-8
[PubMed]  
[41] Vallejo L.F., Rinas U.: Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins. Micro. Cell. Fact., 2004; 3: 1-12
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[42] Ventura S., Villaverde A.: Protein quality in bacterial inclusion bodies. Trends Biotechnol., 2006; 24: 179-185
[PubMed]  
[43] Villaverde A., Carrió M.M.: Protein aggregation in recombinant bacteria: biological role of inclusion bodies. Biotechnol. Lett., 2003; 25: 1385-1395
[PubMed]  
[44] Vincentelli R., Canaan S., Campanacci V., Valencia C., Maurin D., Frassinetti R., Scappucini-Calvo L., Bourne Y., Cambillau C., Bignon C.: High-throughput automated refolding screening of inclusion bodies. Protein Sci., 2004; 13: 2782-2792
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[45] Wang L.: Towards revealing the structure of bacterial inclusion bodies. Prion, 19806034 [
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[46] Wang L., Maji S.K., Sawaya M.R., Eisenberg D., Riek R.: Bacterial inclusion bodies contain amyloid-like structure. PLoS Biol., 2008; 6: e195
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[47] Wulfson A.N., Tikhonov R.V., Pechenov S.E.: A general approach to renaturation of recombinant proteins produced as inclusion bodies. Dokl. Biochem. Biophys., 2001; 380: 329-331
[PubMed]  
[48] Zhao T.J., Ou W.B., Xie Q., Liu Y., Yan Y.B., Zhou H.M.: Catalysis of creatine kinase refolding by protein disulfide isomerase involves disulfide cross-link and dimer to tetramer switch. J. Biol. Chem., 2005; 280: 13470-13476
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[49] Ziętkiewicz S., Krzewska J., Liberek K.: Successive and synergistic action of the Hsp70 and Hsp100 chaperones in protein disaggregation. J. Biol. Chem., 2004; 279: 44376-44383
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.