Postepy Hig Med Dosw. (online), 2012; 66: 33-40
Review
Full Text PDF  

Regulacja melanogenezy: rola cAMP i MITF
Regulation of melanogenesis: the role of cAMP and MITF
Michał Otręba, Jakub Rok, Ewa Buszman, Dorota Wrześniok
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Katedra i Zakład Chemii i Analizy Leków
Adres do korespondencji
prof. dr hab. Ewa Buszman, Katedra i Zakład Chemii i Analizy Leków, ul. Jagiellońska 4, 41-200 Sosnowiec; e-mail: ebuszman@sum.edu.pl

Otrzymano:  2011.11.18
Zaakceptowano:  2012.01.11
Opublikowano:  2012.01.30

Streszczenie
W artykule przedstawiono przebieg melanogenezy oraz udział cAMP i czynnika transkrypcyj­nego MITF w regulacji tego procesu. Produktami melanogenezy są eu- i/lub feomelaniny po­wstające w wyniku wieloetapowego procesu utleniania i polimeryzacji tyrozyny. W przemianach tych biorą udział następujące enzymy: tyrozynaza (TYR, główny enzym), izoforma I hydroksy­lazy tyrozynowej (THI) oraz białka związane z tyrozynazą (TRP1 i TRP2). W procesie regula­cji syntezy melaniny uczestniczą liczne białka sygnałowe oraz czynniki transkrypcyjne, spośród których najważniejsze znaczenie mają cAMP i MITF. cAMP jest przekaźnikiem drugiego rzędu w wewnątrzkomórkowej kaskadzie sygnalizacyjnej. Syntetyzowany jest z adenozynotrifosforanu (ATP) przez cyklazę adenylanową aktywowaną m.in. przez receptor melanokortynowy oraz pod­jednostkę αS białka G. Przekaźnik ten bierze udział w regulacji transkrypcji MITF, TYR, THI, GTP-cyklohydroksylazy I (GTP-CHI) oraz w fosforylacji Ser16 w hydroksylazie fenyloalaninowej (PAH) przez kinazę białkową A (PKA). Mutacje genów kodujących białka uczestniczące w ka­skadzie wykorzystującej cAMP mogą prowadzić do występowania zespołów McCune'a-Albrighta oraz Carneya. MITF jest jednym z najważniejszych jądrowych czynników transkrypcyjnych re­gulujących proces melanogenezy. Znanych jest 10 izoform MITF, przy czym w melanocytach występują tylko izoformy MITF-M, MITF-Mdel, MITF-A oraz MITF-H. Czynnik transkrypcyj­ny MITF reguluje melanogenezę poprzez aktywację transkrypcji genów TYR, TRP1 oraz TRP2. MITF wpływa ponadto na ekspresję innych czynników biorących udział w dojrzewaniu, bioge­nezie i transporcie melanosomów. MITF uczestniczy także w regulacji proliferacji melanocytów i ich ochronie przed apoptozą. Mutacje genu MITF mogą prowadzić do występowania dziedzicz­nych zespołów Waardenburga typu 2 oraz Tietza.
Słowa kluczowe: melanogeneza • cAMP • MITF • tyrozynaza • THI • TRP1 • TRP2


Summary
The article presents the melanogenesis pathway and the role of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and microphthalmia transcription factor (MITF) in regulation of this process. Products of melanogenesis are eu- and/or pheomelanins synthesized in a multistage process of tyrosine oxidation and polymerization. The conversions require the presence of tyrosinase (TYR, key en­zyme), tyrosine hydroxylase isoform I (THI) and tyrosinase related proteins (TRP1 and TRP2). Many types of signal molecules and transcription factors participate in regulation of melanin synthesis, but the most important are cAMP and MITF. cAMP is the second messenger in the intracellular signal cascade, which is synthesized from adenosine triphosphate (ATP) by adeny­lyl cyclase, activated among others by the melanocortin receptor and the αS subunit of G prote­in. The signal molecule cAMP regulates MITF, TYR, THI, GTP-cyclohydroxylase I (GTP-CHI) transcription and phenylalanine hydroxylase (PAH) phosphorylation at Ser16 by protein kina­se A (PKA). Mutations of genes encoding proteins belonging to the cAMP signal cascade may lead to McCune-Albright and Carney syndromes. MITF is one of the most important nuclear transcription factors regulating melanogenesis. Currently 10 isoforms of human MITF are known, but in melanocytes only MITF-M, MITF-Mdel, MITF-A and MITF-H occur. MITF transcription factor regulates melanogenesis by activation of tyrosinase, TRP1 and TRP2 transcription. It also affects expression of other factors regulating melanosome maturation, biogenesis and transport. Moreover, it regulates melanocyte proliferation and protection against apoptosis. Mutations of the MITF gene may lead to hereditary diseases: Waardenburg type II and Tietz syndromes.
Key words: melanogenesis • cAMP • MITF • tyrosinase • THI • TRP1 • TRP2




Wykaz skrótów:
ACTH - hormon adrenokortykotropowy (adrenocorticotropic hormone); ATP - adenozynotrifosforan (adenosine triphosphate); cAMP - cykliczny adenozynomonofosforan (cyclic adenosine monophosphate); CBP - białko wiążące CREB (CREB-binding protein); CRE - element odpowiedzi na cAMP (cAMP responsive element); CREB - białko wiążące CRE (CRE-binding protein); DAG - diacyloglicerol (diacylglycerol); DCoH - kofaktor odpowiedzialny za dimeryzację HNF-1α (dimerisation cofactor of HNF-1α); DCT - tautomeraza DOPAchromu (DOPAchrome tautomerase); DHI - 5,6-dihydroksyindol (5,6-dihydroxyindole); DHICA - kwas 5,6-dihydroksyindolo-2-karboksylowy (5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid); L-DOPA - 3,4-dihydroksy-L-fenyloalanina (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine); ERK - kinaza regulowana sygnałem zewnątrzkomórkowym (extracellular signal-regulated kinase); GDP - guanozynodifosforan (guanosine diphosphate); GPCR - receptory związane z białkiem G (G protein-coupled receptors); GSK-3β - kinaza syntazy glikogenu 3β (glycogen synthase kinase 3b); GTP - guanozynotrifosforan (guanosine triphosphate); GTP-CHI - GTP-cyklohydroksylaza I (GTP-cyclohydroxylase I); HNF-1α - czynnik jądrowy hepatocytów 1α (hepatocyte nuclear factor 1α); LAT1 - transporter dużych aminokwasów 1 (large amino acid transporter 1); MAPK - kinaza białkowa aktywowana przez mitogen (mitogen activated protein kinase); MC1R - receptor melanokortynowy typu 1 (melanocortin 1 receptor); MITF - czynnik transkrypcyjny związany z mikroftalmią (microphthalmia associated transcription factor); MSH - hormon stymulujący melanocyty (melanocyte stimulating hormone); NADPH4- dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (nicotinamide adenine dinucleotide); NF-κB - czynnik jądrowy kappa B (nuclear factor kappa B); p53RE - element odpowiedzi na p53 (p53 responsive element); PAH - hydroksylaza fenyloalaninowa (phenylalanine hydroxylase); PK - kinaza białkowa (protein kinase); RACK-I - receptor aktywowanej kinazy C I (receptor for activated C kinase I); ROS - reaktywne formy tlenu (reactive oxygen species); RPE - nabłonek barwnikowy siatkówki (retinal pigment epithelium); RSK - kinaza rybosomalna R6 (ribosomal R6 kinase); RTK - kinaza receptora tyrozyny (receptor tyrosine kinase); THI - izoforma I hydroksylazy tyrozynowej (tyrosine hydroxylase isoform I); TRP - białko związane z tyrozynazą (tyrosinase related protein); TYR - tyrozynaza (tyrosinase); hUBC9 - ludzki enzym sprzęgający ubikwitynę (human ubiquitin conjugating enzyme 9).
Wstęp
Melaniny są barwnikami występującymi w organizmach żywych, mającymi zdolność absorbowania i rozpraszania promieniowania UV. Dzięki temu ograniczają powstawa­nie reaktywnych form tlenu (ROS - reactive oxygen spe­cies), chroniąc komórki przed uszkodzeniami DNA, bia­łek i lipidów [12,20]. Melaniny mają ponadto zdolność neutralizacji wolnych rodników, czym przypominają wła­ściwości dysmutazy ponadtlenkowej [12]. Synteza mela­nin odbywa się w wyniku procesu melanogenezy, który zachodzi w wyspecjalizowanych organellach - melanoso­mach, znajdujących się w komórkach barwnikowych zwa­nych melanocytami. Regulacja procesu melanogenezy jest niezwykle złożona i obejmuje udział czynników fizycznych (np. promieniowanie UV), biochemicznych: endokrynnych (np. hormon melanotropowy, adrenokortykotropina, estro­geny), parakrynnych (np. epinefryna, endotelina 1, prosta­glandyna F) i autokrynnych (np. interleukina 1α i 1β, leu­kotrien B4) [1,5,23,26]. Wszystkie te czynniki wpływają na aktywność wewnątrzkomórkowych kaskad sygnaliza­cyjnych prowadząc do regulacji syntezy melaniny w me­lanocytach. Najważniejsze z punku widzenia regulacji melanogenezy są kaskady z udziałem cyklicznego adeno­zynomonofosforanu (cAMP) oraz czynnika transkrypcyj­nego związanego z mikroftalmią (MITF).
Melanogeneza
Biosynteza tyrozyny
Substratem w biosyntezie eu- i feomelaniny jest tyrozy­na, która powstaje z L-fenyloalaniny. L-fenyloalanina do­staje się do wnętrza melanocytu z udziałem transportera LAT1 (large amino acid transporter) i Ca2+/ATP-azy [26]. Aminokwas ten ulega utlenieniu do L-tyrozyny w obec­ności hydroksylazy fenyloalaninowej (PAH - phenylalani­ne hydroxylase). PAH jest cytoplazmatycznym enzymem, którego aktywność wymaga obecności kofaktora (6R)-L-erytro-5,6,7,8-tetrahydrobiopteryny (6BH4) i tlenu cząstecz­kowego. Aktywacja PAH następuje w wyniku fosforylacji Ser16 przez kinazę białkową A (PKA - protein kinase A), co przedstawiono na ryc. 1A [23,26,30]. Kofaktor 6BH4 powstaje de novo z udziałem GTP-cyklohydroksylazy I (GTP-CHI - GTP-cyclohydroxylase I) i pełni funkcję donora elektronu podczas hydroksylacji aminokwasów aromatycznych. W wyniku reakcji powstaje 4a-OH-tetra­hydrobiopteryna (4a-OH-BH4), która ulega nieenzyma­tycznemu przekształceniu do kofaktora (7R)-L-erytro-5,6,7,8-tetrahydrobiopteryny (7BH4) lub pod wpływem dehydratazy 4a-OH-BH4 do chinonoidu dihydrobioptery­ny (qBH2). qBH2 w obecności dinukleotydu nikotynamido­adeninowego (NADPH) ulega następnie redukcji do wyj­ściowej postaci kofaktora 6BH4, który razem z L-tyrozyną zostaje przetransportowany do melanosomu na zasadzie dy­fuzji ułatwionej [28]. Warto w tym miejscu zwrócić uwagę, że 6BH4 jest jednym z czynników regulujących zabarwie­nie skóry, czego potwierdzeniem jest korelacja poziomu 6BH4 w skórze z fototypami skóry I-VI [9,27].
Tyrozynaza
L-tyrozyna ulega w melanosomie przekształceniu do 3,4-di­hydroksy-L-fenyloalaniny (L-DOPA) z udziałem tyrozyna­zy (TYR). Enzym ten, zwany także oksydazą tyrozynową, oksydazą DOPA, oksydazą monofenolową lub tlenową oksy­doreduktazą L-DOPA, jest glikoproteiną, zbudowaną z 511 aminokwasów o masie 60-75 kDa [17,20,26,35]. Proces trans­lacji mRNA tyrozynazy w melanocytach przebiega z udzia­łem rybosomów szorstkiego retikulum endoplazmatyczne­go. Powstałe białko jest następnie transportowane do aparatu Golgiego. Tam ulega glikozylacji, co pozwala tyrozynazie uzyskać prawidłową strukturę i funkcję. W kolejnym etapie tyrozynaza zostaje przetransportowana do melanosomów, gdzie uczestniczy w procesie biosyntezy melaniny [35].
W budowie tyrozynazy wyróżnić można trzy główne do­meny [2,4,35]:
• N-końcowa, umiejscowiona wewnątrz melanosomu, któ­ra stanowi około 90% białka i jest odpowiedzialna za aktywność katalityczną enzymu oraz syntezę melaniny w melanosomie,
• C-końcowa, znajdująca się w cytoplazmie melanocytu, zbudowana z 30 aminokwasów, w tym 17 cystein, odpo­wiedzialna za wewnątrzkomórkowy transport tyrozynazy,
• transbłonowa o helikalnej strukturze łącząca domeny N- i C-końcowe.
W domenie C-końcowej znajduje się charakterystyczna dla tyrozynazy sekwencja: kwas glutaminowy-X-X-glutamina-prolina-leucyna-leucyna (X-dowolny aminokwas), która odpowiada za lokalizację oraz aktywność enzymu [23].
W centrum aktywnym enzymu w domenie N-końcowej znajdują się dwa atomy miedzi, które są związane koordy­nacyjnie z trzema resztami histydyny [23,26]. W procesie melanogenezy uczestniczą trzy różne formy tyrozynazy [2]:
• oksytyrozynaza, z dwoma atomami miedzi Cu(II), któ­re wiążą cząsteczkę tlenu tworząc mostek nadtlenkowy,
• mettyrozynaza, z dwoma atomami miedzi Cu(II) połą­czonymi ligandem zawierającym grupę hydroksylową,
• deoksytyrozynaza, z dwoma atomami miedzi Cu(I).
Aktywacja enzymu wymaga fosforylacji dwóch reszt sery­nowych (Ser505, Ser509) na końcu domeny C [26]. Proces ten zachodzi z udziałem kinazy białkowej Cβ (PKCβ) oraz re­ceptora aktywowanej kinazy C I (RACK-I - receptor for ac­tivated C kinase I). Kinaza PKCβ, aktywowana przez diacy­loglicerol (DAG), tworzy kompleks z receptorem RACK-I, który po przyłączeniu do błony melanosomu, fosforyluje reszty serynowe tyrozynazy [23]. Fosforylacja seryn po­zwala na przyłączenie cząsteczki L-tyrozyny do enzymu i rozpoczęcie procesu melanogenezy (ryc. 1A i 1B) [23,26]. Aktywność tyrozynazy jest także regulowana przez obecne w melanosomach kofaktory: 6BH4 oraz jego izomer 7BH4, które są zdolne do tworzenia z tyrozynazą kompleksu w sto­sunku 1:1, co powoduje zahamowanie jej aktywności [9,26]. Proces ten jest odwracalny dzięki obecnym w melanoso­mach hormonom α-MSH i β-MSH, które mogą spowodo­wać odłączenie wspomnianych wcześniej kofaktorów z wy­tworzeniem kompleksów: α-MSH - 6BH4 i β-MSH - 7BH4 i jednoczesnym przywróceniem aktywności enzymu [26].
Ryc. 1. Rola cAMP i MITF w regulacji melanogenezy; A - przebieg i regulacja melanogenezy w melanocycie, B - przebieg syntezy DOPAchinonu w melanosomie, C - regulacja ekspresji genów związanych z melanogenezą (wg [1,7, 23, 26] zmodyfikowano)

TRP1, TRP2
Poza tyrozynazą w procesie melanogenezy uczestniczą również takie enzymy jak białko związane z tyrozynazą 1 (TRP1 - tyrosinase related protein 1; oksydaza DHICA - oksydaza kwasu 5,6-dihydroksyindolo-2-karboksylowe­go) i tautomeraza DOPAchromu (DCT - dopachrome tau­tomerase; TRP2 - tyrosinase related protein 2). Enzymy te są białkami podobnymi strukturalnie do tyrozynazy, wspólnie z nią wykazują 40% homologię aminokwasową oraz podobnie jak tyrozynaza, są umiejscowione w błonie melanosomów [9,23]. TRP1 jest oksydazą biorącą udział w końcowym etapie melanogenezy; może zwiększać sto­sunek eumelaniny do feomelaniny, a ponadto uczestniczy w aktywacji i stabilizacji tyrozynazy w wyniku tworzenia z nią kompleksu. TRP2 jest tautomerazą odpowiedzialną za przekształcenie DOPAchromu do pochodnej kwasu kar­boksylowego. W melanosomie tworzy kompleksy z tyro­zynazą oraz TRP1. W przeciwieństwie do tyrozynazy, ak­tywność enzymatyczna TRP2 wymaga obecności głównie jonów Zn2+, a nie Cu2+ [23].
Przebieg melanogenezy
Melanogeneza rozpoczyna się przekształceniem L-tyrozyny do DOPAchinonu. Proces ten może zachodzić dwuetapo­wo z udziałem izoformy I hydroksylazy tyrozynowej THI (tyrosine hydroxylase isoform I) i tyrozynazy lub jedno­etapowo z udziałem tyrozynazy.
Przeprowadzone przez Marlesa i wsp. [21] badania wyka­zały, że utlenianie L-tyrozyny przez THI zachodzi w obec­ności kofaktora 6BH4 i tlenu cząsteczkowego w środowi­sku o pH=5,0. Produktem tej reakcji jest L-DOPA, która następnie ulega utlenieniu do DOPAchinonu z udziałem oksytyrozynazy. W wyniku tej reakcji forma oksyenzy­mu zostaje przekształcona do met-, która następnie utle­nia kolejną cząsteczkę L-DOPA przechodząc w deoksyty­rozynazę [2,24,26] (ryc. 1B).
L-tyrozyna może również zostać utleniona do DOPAchinonu w jednoetapowej reakcji katalizowanej przez tyrozynazę i przebiegającej w środowisku o pH=6,8. Reakcji tej towa­rzyszy przekształcenie enzymu z formy oksy- w deoksy- [2,24,26]. Powstała deoksytyrozynaza przyłącza następnie cząsteczkę tlenu i przechodzi w formę oksy-, zamykając tym samym cykl katalityczny [2,24] (ryc. 1B). Zmiana wartości pH=5,0 na pH=6,8 wewnątrz melanosomu moż­liwa jest dzięki obecności białka p, które należy do rodzi­ny błonowych transporterów Na+/SO42- - SLC13 [4,26].
Kolejne przekształcenia DOPAchinonu uzależnione są od obecności związków tiolowych np. cysteiny, czy glutatio­nu. Badania Ito i wsp. [14] wskazują, że głównym czyn­nikiem decydującym o przekształceniu DOPAchromu, a tym samym o syntezie feo- lub eumelaniny jest stę­żenie cysteiny wewnątrz melanosomów. Jeżeli wyno­si ono powyżej 0,13 µM, to z DOPAchinonu powstaje 3- lub 5-cysteinyloDOPA, których utlenienie z udzia­łem peroksydazy i polimeryzacja prowadzą do otrzy­mania żółtoczerwonej feomelaniny [14,31]. Natomiast w przypadku, gdy stężenie cysteiny jest poniżej 0,13 µM, to DOPAchinon z udziałem tyrozynazy przekształca się do DOPAchromu. W kolejnym etapie DOPAchrom może ulec nieenzymatycznej dekarboksylacji do 5,6-di­hydroksyindolu (DHI) lub tautomeryzacji z udziałem TRP2 do kwasu 5,6-dihydroksyindolo-2-karboksylowe­go (DHICA). Powstałe hydroksylowe pochodne indolu są następnie utleniane odpowiednio do indolo-5,6-chino­nu pod wpływem tyrozynazy i/lub peroksydazy oraz do kwasu indolo-5,6-chinono-2-karboksylowego pod wpły­wem TRP1 [6,19,30,31,39]. Powstałe produkty chinono­we ulegają następnie polimeryzacji, prowadząc do po­wstania brązowoczarnej eumelaniny [39].
Synteza cAMPi rola wregulacji melanogenezy
cAMP jest przekaźnikiem drugiego rzędu w sygnaliza­cji komórkowej, który powstaje z udziałem cyklazy ade­nylanowej. Enzym ten, umiejscowiony na wewnętrznej powierzchni błony komórkowej, katalizuje przekształce­nie ATP do cAMP. Aktywacja cyklazy adenylanowej na­stępuje m.in. za pośrednictwem transbłonowego recepto­ra melanokortynowego typu 1 (MC1R - melanocortin 1 receptor), co przedstawiono na ryc. 1A. MC1R należy do receptorów związanych z białkiem GS (GPCR) i może być aktywowany zarówno przez hormon a stymulujący melanocyty (α-MSH) jak i hormon adrenokortykotropo­wy (ACTH). Białko GS zbudowane jest z trzech podjed­nostek: αS, β i γ. Po związaniu liganda z receptorem na­stępuje zmiana konformacji receptora i aktywacja białka GS, co skutkuje odłączeniem nukleotydu GDP i zwią­zaniem GTP do podjednostki αS, która następnie zosta­je uwolniona z kompleksu i aktywuje cyklazę adenylano­wą [1,7,33]. Ważną rolę cAMP w regulacji melanogenezy podkreśla mutacja skutkująca aktywacją podjednostki αS u pacjentów z zespołem McCune'a-Albrighta, która obja­wia się m.in. występowaniem na skórze dużych obszarów hiperpigmentacyjnych [16].
Badania przeprowadzone przez Spencera i wsp. [34] wyka­zały możliwość regulacji melanogenezy przez cAMP w wy­niku oddziaływania hormonu β-MSH z receptorem MC4R.
cAMP jest istotnym czynnikiem stymulującym melano­genezę, co następuje poprzez aktywację kinazy białkowej A (PKA) i regulację transkrypcji genów MITF, GTP-CHI oraz THI [1]. Aktywacja PKA następuje przez przyłącze­nie się cAMP do dwóch podjednostek regulatorowych en­zymu, w wyniku czego dochodzi do uwolnienia i aktywa­cji dwóch podjednostek katalitycznych. Dzięki temu kinaza białkowa jest zdolna do fosforylacji m.in. białek regulato­rowych, innych enzymów i kanałów jonowych. Może ona również zostać przetransportowana z cytoplazmy do ją­dra komórkowego, gdzie fosforyluje czynniki transkryp­cyjne CREB (cAMP responsive element binding protein). Zaktywowane w ten sposób białka CREB wiążą się z do­meną CRE (cAMP responsive element) w obrębie pro­motora genu. PKA fosforyluje również białka CBP wią­żące CREB (CREB-binding protein), które są niezbędne w regulacji transkrypcji genów docelowych [1] (ryc. 1C). Istotne znaczenie PKA w melanogenezie podkreśla muta­cja aktywująca genu PKA występująca w zespole Carneya, który objawia się m.in. plamistymi zmianami barwniko­wymi skóry [16].
cAMP uczestniczy w regulacji procesu melanogenezy wpły­wając na transkrypcję genów TYR, THI oraz GTP-CHI, za pośrednictwem czynników transkrypcyjnych CBP i białek CREB [20,26]. cAMP ponadto bierze udział w aktywacji PAH poprzez PKA, która odpowiada za fosforylację Ser16 w tym enzymie [20].
Warto zaznaczyć, że wzrost wewnątrzkomórkowego stęże­nia cAMP prowadzi do aktywacji szlaku Ras/ERK (extra­cellular signal-regulated kinase). cAMP aktywuje białko Ras, które należy do rodziny białek G i podobnie jak pod­jednostka αS odłącza GDP i wiąże się z GTP. Białko Ras aktywuje następnie kinazę B-Raf odpowiedzialną za fos­forylację kinazy MAP (mitogen activated protein kinase), co prowadzi do aktywacji kinaz serynowo-treoninowych ERK1 i ERK2 [1,7]. Kinazy te fosforylują Ser73 w czyn­niku MITF, co umożliwia przyłączenie się ludzkiego en­zymu sprzęgającego ubikwitynę hUBC9 (human ubiquitin conjugating enzyme) i skierowanie MITF do proteasomów, gdzie zostaje on poddany degradacji [1]. Aktywacja szla­ku Ras/ERK przez cAMP prowadzi do zahamowania me­lanogenezy, a to stanowi mechanizm sprzężenia zwrotne­go i zapobiega nadmiernemu wytwarzaniu melanin, które mogą okazać się toksyczne dla komórek [16].
MITF - struktura i funkcje
Struktura i izoformy MITF
MITF jest czynnikiem transkrypcyjnym, w budowie któ­rego można wyróżnić następujące domeny [1,25]:
• C-końcową domenę zasadową, odpowiedzialną za wią­zanie z DNA i aktywację transkrypcji,
• sekwencję helisa-pętla-helisa z domeną zamka leucy­nowego (bHLH-LZ) odpowiedzialną za oddziaływania typu białko-białko i tworzenie homo- i heterodimerów,
• N-końcową domenę transaktywacyjną, znajdującą się powyżej domeny zasadowej.
Ze względu na to, że MITF wykazuje duże podobień­stwo strukturalne do innych czynników transkrypcyjnych np.TFE3, TFEB i TFEC, może z nimi tworzyć hetero­dimery [1]. Zdolność rozpoznawania sekwencji M-box (AGTCATGTGCT) i E-box (CATGTG) genów kodujących enzymy uczestniczące w procesie melanogenezy oraz re­gulowania transkrypcji genów TYR, TRP1, TRP2 i PKCβ wykazuje tylko ufosforylowana postać MITF. Fosforylacja MITF następuje poprzez kinazę MAPK oraz kinazę syn­tazy glikogenu (GSK-3β - glycogen synthase kinase-3β), których aktywacja jest zależna od receptorów RTK (recep­tor tyrosine kinase), np. C-Kit [10,23]. Fosforylacja, oprócz aktywacji czynnika MITF, prowadzi również do obniżenia jego stabilności i degradacji w proteasomach [23]. GSK-3β fosforyluje Ser298 białka MITF, co umożliwia wiązanie się MITF z DNA [10]. Z kolei fosforylacja Ser73 i Ser409 od­powiednio przez kinazę ERK oraz RSK (ribosomal R6 ki­nase) umożliwia oddziaływanie MITF z enzymem sprzę­gającym ubikwitynę hUBC9, co prowadzi do degradacji MITF w proteasomach. [1,16,17,18,20].
Znanych jest 10 izoform czynnika MITF: MITF-A, MITF-B, MITF-C, MITF-D, MITF-E, MITF-H, MITF-J, MITF-M, MITF-Mdel i MITF-Mc, przy czym w melanocytach wystę­pują tylko izoformy MITF-M, MITF-Mdel, MITF-A oraz MITF-H. [24,26,39]. Izoformy te zawierają w regionie N-końcowym charakterystyczną dla siebie domenę odpo­wiednio M, A oraz H. Gen każdej z izoform, oprócz MITF-Mdel, ma charakterystyczną sekwencję promotorową, co sugeruje pełnienie różnych funkcji w zależności od rodza­ju komórek, w których ulegają ekspresji [25].
Izoforma MITF-M ulega ekspresji tylko w melanocytach prawidłowych wywodzących się z grzebienia nerwowego oraz w komórkach czerniaka. Spośród wszystkich izoform MITF jest najkrótsza, bo zbudowana z 419 aminokwasów i ma charakterystyczną domenę M zbudowaną z 10 ami­nokwasów [36]. Niedawno odkrytym wariantem MITF-M jest MITF-Mdel, który powstaje w wyniku alternatywne­go składania genu [38].
W odróżnieniu od MITF-M i MITF-Mdel, pozostałe izo­formy zawierają w domenie N-końcowej charakterystyczną domenę B1b zbudowaną z 83 aminokwasów [25].
MITF-A jest najdłuższą izoformą, zbudowaną z 520 ami­nokwasów. Najwyższy poziom ekspresji tej izoformy wy­stępuje w nabłonku barwnikowym siatkówki (RPE - reti­nal pigment epithelium). Ulega także ekspresji w innych typach komórek barwnikowych, m.in. w melanocytach prawidłowych i komórkach czerniaka. MITF-A ma cha­rakterystyczną domenę A zbudowaną z 35 aminokwa­sów [25,36].
MITF-H jest izoformą zbudowaną z 519 aminokwasów i ulega ekspresji wraz z MITF-A w melanocytach prawi­dłowych oraz komórkach czerniaka. Ma domenę H zbu­dowaną z 19 aminokwasów [25,36].
W komórkach RPE ekspresji ulega izoforma MITF-C, która nie występuje w melanocytach prawidłowych i ko­mórkach czerniaka. Jest zbudowana z 519 aminokwasów i ma charakterystyczną domenę C zbudowaną z 34 ami­nokwasów [25,36].
Funkcje MITF
Ekspresja czynnika transkrypcyjnego MITF regulowana jest bezpośrednio przez czynnik jądrowy HNF-1α (hepa­tocyte nuclear factor 1α) oraz białko CREB.
Czynnik jądrowy HNF-1α bierze bezpośrednio udział w in­dukcji ekspresji genów MITF i tyrozynazy [26]. Inicjacja transkrypcji HNF-1α jest zależna od białka p53, które przyłącza się do sekwencji p53RE (p53 responsive ele­ment) w genie HNF-1α [15,26]. Ekspresja genu p53 regu­lowana jest m.in. przez jądrowy czynnik NF-κB (nuclear factor kappa B). Powstały HNF-1α wiąże się z sekwencją E-box genu MITF i razem z CREB związanym z sekwen­cją M-box uczestniczy w transkrypcji MITF [26] (ryc. 1C).
Czynnik MITF pełni także funkcję głównego regulatora melanogenezy na poziomie transkrypcyjnym w odniesie­niu do melanosomów - poprzez możliwość indukcji eks­presji genów biorących udział w biogenezie, dojrzewaniu oraz transporcie melanosomów [21,38]. MITF może ponad­to aktywować transkrypcję receptora melanokortynowego typu 1 (MC1R), z którym wiąże się m.in. hormon α-MSH, odpowiedzialny za regulację procesu melanogenezy oraz proliferację i tworzenie wypustek melanocytów [25,35].
W regulacji ekspresji genu tyrozynazy główną rolę odgry­wają czynniki transkrypcyjne MITF, HNF-1α oraz kofaktor odpowiedzialny za dimeryzację HNF-1α (DCoH - dimeri­sation cofactor of HNF-1α). HNF-1α wiąże się z sekwencją M-box genu kofaktora DCoH, powodując jego transkrypcję. Powstały z udziałem DCoH homodimer HNF-1α oraz czyn­nik MITF wiążą się z sekwencją M-box promotora genu ty­rozynazy w wyniku rozpoznania 16-zasadowej odwróconej sekwencji palindromowej, prowadząc do jego transkrypcji [26]. Możliwość regulacji ekspresji genów TRP1 oraz TRP2 przez czynnik MITF wynika z obecności sekwencji M-box i E-box w promotorach tych genów [1]. Transkrypcja genu GTP-cyklohydroksylazy I (GTP-CHI) jest możliwa dzięki związaniu się czynnika MITF i białka CREB odpowiednio z sekwencją E-box oraz M-box tego genu. Powstały w ten sposób GTP-CHI jest najważniejszym enzymem w synte­zie kofaktora 6BH4 [3,26] (ryc. 1C).
W stosunku do melanocytów MITF może wykazywać za­równo działanie pro-, jak i antyproliferacyjne. Czynnik transkrypcyjny MITF może brać udział w stymulacji proliferacji poprzez indukcję transkrypcji genu cykli­nozależnej kinazy 2 lub indukcję ekspresji genu białka Dia1, odpowiedzialnego za kontrolę polimeryzacji akty­ny. Aktywne białko Dia1 może także nasilać degradację cyklinozależnego inhibitora kinazy 1B, co z kolei prowa­dzi do stymulacji proliferacji komórkowej [26].
Czynnik MITF może także uczestniczyć w inhibicji proli­feracji w wyniku stymulacji ekspresji genu czynnika trans­krypcyjnego TBX2 (brachyury-related transcription factor) lub cyklinozależnego inhibitora kinazy 1A oraz cyklinoza­leżnego inhibitora kinazy 2A. Czynnik TBX2 odpowiada za hamowanie cyklu komórkowego w wyniku inhibicji eks­presji cyklinozależnego inhibitora kinazy 1A [13,25,26]. Czynnik transkrypcyjny MITF może również aktywować inhibitor cyklu komórkowego INK4A (inhibitor of cyc­lin-dependent kinase 4A), co zapobiega proliferacji ko­mórek i pozwala na ich dojrzewanie i różnicowanie [13]. Wykazano ponadto udział czynnika MITF w ochronie ko­mórek przed apoptozą przez indukcję ekspresji następu­jących białek: Bcl-2, inhibitorów apoptozy czerniaka (np. ML-IAP, BIRC7, LIPIN), receptora czynnika wzrostu he­patocytów, endonukleazy APEX1 (apurinic/apirymidinic endonuclease 1), czynnika transkrypcyjnego HIF1A (hypo­xia inducible factor 1A) oraz receptora endoteliny [15,25].
Mutacje MITF
Mutacje genu MITF związane są z występowaniem auto­somalnych i dominujących zespołów: Waardenburga typu 2 oraz Tietza. W zespole Waardenburga w wyniku muta­cji dochodzi do zamiany Ser298 na alaninę lub prolinę, co uniemożliwia opisaną wcześniej fosforylację MITF przez kinazę GSK-3β [11,16,37]. Objawy charakterystyczne dla zespołu Waardenburga (występowanie plam na skórze, zmiany w pigmentacji tęczówki oraz utrata słuchu zwią­zana z utratą melanocytów w prążku naczyniowym śli­maka) są konsekwencją zmniejszenia liczby melanocytów [18,25]. Z kolei w zespole Tietza zaobserwowano zamianę Lys210 na asparaginę oraz delecję Arg217 [32,36]. Objawami charakterystycznymi dla tego zespołu są: całkowita utrata słuchu, hipopigmentacja [36].
Podsumowanie
Proces melanogenezy zachodzi w wyspecjalizowanych or­ganellach - melanosomach, które znajdują się w komór­kach barwnikowych zwanych melanocytami. Substratem w syntezie melanin jest tyrozyna, która w wyniku wielo­etapowego procesu utleniania i polimeryzacji zostaje prze­kształcona do eu- i/lub feomelaniny. Przemiany te katali­zowane są przez następujące enzymy: tyrozynazę (TYR, enzym główny), THI, oraz TRP1 i TRP2. Do najważniej­szych czynników regulujących proces melanogenezy nale­żą cAMP oraz MITF, które uczestniczą w regulacji ekspre­sji genów enzymów biorących udział w syntezie melanin.
cAMP oraz MITF uczestniczą ponadto w dojrzewaniu, bio­genezie i transporcie melanosomów, a także w regulacji pro­liferacji i procesu apoptozy melanocytów. Znajomość prze­biegu kaskad związanych z udziałem cAMP oraz czynnika transkrypcyjnego MITF może się przyczynić do lepsze­go zrozumienia i poznania molekularnych mechanizmów regulacji procesu melanogenezy oraz opracowania tera­pii dziedzicznych zespołów Waardenburga typu 2, Tietza, McCune'a-Albrighta oraz Carneya.
PIŚMIENNICTWO
[1] Busca R., Ballotti R.: Cyclic AMP a key messenger in the regulation of skin pigmentation. Pigment Cell Res., 2000; 13: 60-69
[PubMed]  
[2] Chang T.S.: An updated review of tyrosinase inhibitors. Int. J. Mol. Sci., 2009; 10: 2440-2475
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[3] Chavan B., Gillbro J.M., Rokos H., Schallreuter K.U.: GTP cyclohydrolase feedback regulatory protein controls cofactor 6-tetrahydrobiopterin synthesis in the cytosol and in the nucleus of epidermal keratinocytes and melanocytes. J. Invest. Dermatol., 2006; 126: 2481-2489
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[4] Cheli Y., Luciani F., Khaled M., Beuret L., Bille K., Gounon P., Ortonne J.P., Bertolotto C., Ballotti R.: αMSH and cyclic AMP elevating agents control melanosome pH through a protein kinase A - independent mechanism. J. Biol. Chem., 2009; 284: 18699-18706
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[5] Costin G.E., Hearing V.J.: Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress. FASEB J., 2007; 21: 976-994
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[6] Curto E.V., Kwong C., Hermersdorfer H., Glatt H., Santis C., Virador V., Hearing V.J., Dooley J., Dooley T.P.: Inhibitors of mammalian melanocyte tyrosinase: In vitro comparisions of alkyl esters of gentisic acid with other putative inhibitors. Biochem. Pharmacol., 1999; 57: 663-672
[PubMed]  
[7] Dumaz N, Marais R.: Integrating signals between cAMP and the RAS/RAF/MEK/ERK signalling pathways. FEBS J., 2005; 272: 3491-3504
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[8] Funasaka Y., Boulton T., Cobb M., Yarden Y., Fan B., Lyman S.D., Williams D.E., Anderson D.M., Zakut R., Mishima Y., Halaban R.: c-Kit kinase induces a cascade of protein tyrosine phosphorylation in normal human melanocytes in response to mast cell growth factor and stimulates mitogen activated protein kinase but is down-regulated in melanomas. Mol. Biol. Cell, 1992; 3: 197-209
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[9] Gillbro J.M., Olsson M.J.: The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents - existing and new approaches. Int. J. Cosmet. Sci., 2011; 33: 210-221
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[10] Goding C.R.: Mitf from neural crest to melanoma: signal transduction and transcription in the melanocyte lineage. Genes Dev., 2000; 14: 1712-1728
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[11] Hemesath T.J., Steingrímsson E., McGill G., Hansen M.J., Vaught J., Hodgkinson C.A., Arnheiter H., Copeland N.G., Jenkins N.A., Fisher D.E.: Microphthalmia, a critical factor in melanocyte development, defines a discrete transcription factor family. Genes Dev., 1994; 8: 2770-2780
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[12] Hoogduijn M.J., Cemeli E., Ross K., Anderson D., Thody A.J., Wood J.M.: Melanin protects melanocytes and keratinocytes against H2O2-induced DNA strand breaks throught its ability to bind Ca2+. Exp. Cell Res., 2004; 294: 60-67
[PubMed]  
[13] Hoogduijn M.J., Hitchock I.S., Smit N.M.P., Gillbro J.M., Schallreuter K.U., Genever P.G.: Glutamate receptors on human melanocyte regulate the expression of MITF. Pigment Cell Res., 2005; 19: 58-67
[PubMed]  
[14] Ito S., Wakamatsu K.: Chemistry of mixed melanogenesis - pivotal roles of dopaquinone. Photochem. Photobiol., 2008; 84: 582-592
[PubMed]  
[15] Kadekaro A.L., Kavanagh R.J., Wakamatsu K., Ito S., Pipitone M.A., Abdel Malek Z.A.: Cutaneous photobiology. The melanocyte vs the sun: Who will win the final round? Pigment Cell Res., 2003; 16: 434-447
[PubMed]  
[16] Khaled M., Larribere L., Bille K., Aberdam E., Ortonne J.P., Ballotti R., Bertolotto C.: Glycogen synthase kinase 3β is activated by cAMP and plays an active role in the regulation of melanogenesis. J. Biol. Chem., 2002; 37: 33690-33697
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[17] Kim D.S., Hwang E.S., Lee J.E., Kim S.Y., Kwon S.B., Park K.C.: Sphingosine-1-phosphate decreases melanin synthesis via sustained ERK activation and subsequent MITF degradation. J. Cell Sci., 2003; 116: 1699-1706
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[18] Kim D.S., Park S.H., Kwon S.B., Park E.S., Huh C.H., Youn S.W., Park K.C.: Sphingosylphosphorylcholine-induced ERK activation inhibits melanin synthesis in human melanocytes. Pigment Cell Res., 2006; 19: 146-153
[PubMed]  
[19] Kobayashi T., Urabe K., Winder A., Jimenez-Cervantes C., Imokawa G., Brewington T., Solano F., Garcia-Borron J.C., Hearing V.J.: Tyrosinase related protein 1 (TRP1) functions as a DHICA oxidase in melanin biosynthesis. EMBO J., 1994; 13: 5818-5825
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[20] Liu F., Singh A., Yang Z., Garcia A., Kong Y., Meyskens F.L. Jr.: MITF links Erk 1/2 kinase and p21CIP1/WAF1 activation after UVC radiation in normal human melanocytes and melanoma cells. Mol. Cancer, 2010; 9: 214
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[21] Marles L.K., Peters E.M., Tobin D.J., Hibberts N.A., Schallreuter K.U.: Tyrosine hydroxylase isoenzyme I is present in human melanosomes: a possible novel function in pigmentation. Exp. Dermatol., 2003; 12: 61-70
[PubMed]  
[22] Miranda F.F., Teigen K., Thórólfsson M., Svebak R.M., Knappskog P.M., Flatmark T., Martínez A.: Phosphorylation and mutations of Ser16 in human phenylalanine hydroxylase. Kinetic and structural effects. J. Biol. Chem., 2002; 277: 40937-40943
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[23] Park H.Y., Kosmadaki M., Yaar M., Gilchrest A.: Cellular mechanisms regulating human melanogenesis. Cell. Mol. Life Sci., 2009; 66: 1493-1506
[PubMed]  
[24] Ramsden C.A., Riley P.A.: Mechanistic studies of tyrosinase suicide inactivation. ARKIVOC, 2010; 260-274
[25] Šamija I., Lukač J., Kusić Z.: Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) - from Waardenburg syndrome genetics to melanoma therapy. Acta Med. Acad., 2010; 39: 175-193
[26] Schallreuter K.U., Kothari S., Chavan B., Spencer J.D.: Regulation of melanogenesis - controversies and new concepts. Exp. Dermatol., 2008; 17: 395-404
[PubMed]  
[27] Schallreuter K.U., Moore J, Tobin D.J., Gibbons N.J., Marshall H.S., Jenner T, Beazley W.D., Wood J.M.: α-MSH can control the essential cofactor 6-tetrahydrobiopterin in melanogenesis. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1999; 885: 329-341
[PubMed]  
[28] Schallreuter K.U., Moore J., Wood J.M., Beazley W.D., Peters E.M., Marles L.K., Behrens-Williams S.C., Dummer R., Blau N., Thöny B.: Epidermal H2O2 accumulation alerts tetrahydrobiopterin (6BH4) recycling in vitiligo: Identification of a general mechanism in regulation of all 6BH4-dependent processes? J. Invest. Dermatol., 2001; 116: 167-174
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[29] Shin M.H., Jang J. H., Surh Y.J.: Potential role of NFκB and ERK 1/2 in cytoprotection against oxidative cell death by tetrahydropapaveroline. Free Radic. Biol. Med., 2004; 36: 1185-1194
[PubMed]  
[30] Slominski A., Wortsman J., Plonka P.M., Schallreuter K.U., Paus R., Tobin D.J.: Hair follicle pigmentation. J. Invest. Dermatol., 2005; 124: 13-21
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[31] Slominski A., Zmijewski M.A., Pawelek J.: L-tyrosine and L-dihydroxyphenylalanine as hormone-like regulators of melanocyte functions. Pigment Cell Melanoma Res., 2011; 25: 14-27
[PubMed]  
[32] Smith S.D., Kelley P.M., Kenyon J.B., Hoover D.: Tietz syndrome (hypopigmentation/deafness) caused by mutation of MITF. J. Med. Genet., 2000; 37: 446-448
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[33] Spencer J.D., Chavan B., Marles L.K., Kauser S., Rokos H., Schallreuter K.U.: A novel mechanism in control of human pigmentation by β-melanocyte-stimulating hormone and 7-tetrahydrobiopterin. J. Endocrinol., 2005; 187: 293-302
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[34] Spencer J.D., Schallreuter K.U.: Regulation of pigmentation in human epidermal melanocytes by functional high-affinity β-melanocyte-stimulating hormone/melanocortin-4 receptor signaling. Endocrinology, 2009; 150: 1250-1258
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[35] Sulaimon S.S., Kitchell B.E.: The biology of melanocytes. Vet. Dermatol., 2003; 14: 57-65
[PubMed]  
[36] Tachibana M.: MITF: A stream flowing for pigment cells. Pigment Cell Res., 2000; 13: 230-240
[PubMed]  
[37] Takeda K., Takemoto C., Kobayashi I., Watanabe A., Nobukuni Y., Fisher D.E., Tachibana M.: Ser298 of MITF, a mutation site in Waardenburg syndrome type 2, is a phosphorylation site with functional significance. Hum. Mol. Genet., 2000; 9: 125-132
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[38] Wang Y., Radfar S., Liu S., Riker A.I., Khong H.T.: Mitf-Mdel, a novel melanocyte/melanoma-specific isoform of microphthalmia-associated transcription factor-M, as a candidate biomarker for melanoma. BMC Med., 2010; 8: 14
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[39] Yamaguchi Y., Brenner M., Hearing V.J.: The regulation of skin pigmentation. J. Biol. Chem., 2007; 282: 27557-27561
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.