Postepy Hig Med Dosw. (online), 2011; 65: 714-724
Review
Full Text PDF  

Osmoregulacja - ważny parametr rozwoju bakterii
Osmoregulation - an important parameter of bacterial growth
Marta Sochocka, Janusz Boratyński
Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu
Adres do korespondencji
dr Marta Sochocka, Laboratorium Chemii Biomedycznej, Laboratorium Wirusologii, Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, ul. Weigla 12, 53-114 Wrocław; e-mail: mars@iitd.pan.wroc.pl

Otrzymano:  2011.07.19
Zaakceptowano:  2011.11.09
Opublikowano:  2011.11.22

Streszczenie
Warunki środowiskowe, takie jak temperatura, pH, promieniowanie czy ciśnienie osmotyczne sta­nowią ważne czynniki limitujące wzrost i rozmnażanie się bakterii. Prawidłowa struktura i meta­bolizm komórki bakteryjnej utrzymywane są dzięki stabilnej gospodarce wodno-elektrolitowej, regulowanej w procesie osmozy. Gwałtowne przemiany wywołane szokiem osmotycznym (dehy­dratacja, rehydratacja) prowadzą m.in. do modyfikacji fosfolipidowej struktury błony komórko­wej, a nawet śmierci komórki. Zjawiska zakłócające proces osmozy, stanowiące jednak natural­ny element życia komórki, mogą się pojawić na przykład w układach koloidowych. Biologiczna identyfikacja ciśnienia osmotycznego powiązana jest ze wzrostem lub spadkiem siły osmotycz­nej środowiska bytowania organizmów. Komórki poddane stresowi osmotycznemu, takiemu jak wzrost ciśnienia osmotycznego, inicjują mechanizmy aktywnego radzenia sobie z niekorzystny­mi skutkami jego działania. Procesy osmoregulacyjne mają na celu utrzymanie turgoru komór­ki, a tym samym zapewnienie warunków do prawidłowego rozwoju bakterii. Osmoregulacja, po­legająca na utrzymaniu równowagi wodno-elektrolitowej komórki, dotyczy m.in. gromadzenia swoistych substancji osmoregulacyjnych, tzw. osmolitów. Osmolity są małymi, rozpuszczalny­mi cząsteczkami organicznymi, wpływającymi korzystnie na stabilizację błon i białka komórko­we, nie zakłócając jednocześnie centralnego metabolizmu komórki. Magazynowanie substancji osmoregulacyjnych odbywa się w wyniku syntezy lub przez pobranie z otoczenia za pomocą spe­cjalnych systemów transportowych, aktywowanych przez bodźce mechaniczne. Wiedza o wpły­wie ciśnienia osmotycznego na mikroorganizmy oraz o regulacji jego działania pozwala m.in. na odpowiednie wykorzystanie bakterii w różnych gałęziach przemysłu biotechnologicznego.
Słowa kluczowe: ciśnienie osmotyczne • osmoza • substancje osmoregulacyjne • rozwój bakterii


Summary
Environmental conditions such as temperature, pH, radiation and osmotic pressure are important factors limiting the growth and multiplication of bacteria. Regular structure and metabolism of bacterial cells are maintained through a stable arrangement of the water-electrolyte system, re­gulated by osmosis. The rapid changes caused by osmotic shock (dehydration, rehydration) mi­ght lead to modifications of the phospholipid structure of the cell membrane and even cell death. Advances disturbing the osmosis, which are a natural part of living cells, may appear for exam­ple in colloid systems. The biological identification of the osmotic pressure is connected with an increase or decrease in the environmental osmotic strength of microorganisms' habitat. Cells exposed to osmotic stress, such as an increase in osmotic pressure, initiate mechanisms of acti­ve coping with the adverse consequences of its effects. Osmoregulatory processes are designed to maintain cell turgor, hence ensuring proper conditions for bacterial growth. Osmoregulation, which consists of maintaining fluid and electrolyte balance of cells, raising concerns accumula­tion of specific compatible solutes (osmolytes). Osmolytes are small, soluble organic molecules with a positive influence on membrane stabilization and proteins, without disrupting cellular func­tions. Storage of compatible solutes takes place by synthesis or by downregulation from the me­dium by means of special transport systems, activated by mechanical stimuli. Knowledge of the impact of osmotic pressure on microbial cells and the regulation of its activity led to the appro­priate use of bacteria in various branches of the biotechnology industry.
Key words: osmotic pressure • osmosis • compatible solutes • bacterial growth




Wprowadzenie
Dynamika i tempo wzrostu mikroorganizmów zależą przede wszystkim od ich budowy i fizjologii oraz warunków śro­dowiskowych. Czynniki fizykochemiczne limitujące roz­wój mikroorganizmów to przede wszystkim: temperatura, obecność lub brak w otoczeniu wody, pH, zawartość i ro­dzaj substancji odżywczych, promieniowanie oraz ciśnie­nie. Istotne znaczenie ma zarówno rodzaj jak i natężenie działania danego czynnika zewnętrznego, a także orga­nizm, na który działa. Każdy gatunek bakterii ma wła­sne zakresy tolerancji dla danego czynnika, można zatem wyznaczyć optymalne warunki pozwalające na najlepszy wzrost. Bakterie są naturalnie przystosowane do tolero­wania dosyć dużych zmian wszystkich wyżej wymienio­nych czynników. Należy jednak pamiętać, że wzrost nie­których grup często ograniczony jest do wąskiego zakresu zmian danego parametru. Reakcje bakterii na działanie da­nego czynnika fizykochemicznego są także indywidualnie zróżnicowane. To, co dla jednych gatunków bywa bójcze, dla innych może się okazać wyjątkowo korzystne. Zakresy zmian działania danego czynnika są dla bakterii limitują­ce, a ich przekroczenie może doprowadzić nawet do ich zabicia. Nie jest także możliwe określenie, który czynnik jest dla komórki najważniejszy, gdyż bardzo często efek­ty oddziaływań są wypadkową działania wielu nakładają­cych się czynników jednocześnie.
Parametry fizykochemiczne środowiska
W komórce bakteryjnej woda stanowi naturalne środowi­sko, w którym przebiega większość niezbędnych do życia procesów metabolicznych i biosyntetycznych. Układ wod­ny gwarantuje utrzymanie prawidłowej struktury komórki, zachowanie parametrów biochemicznych oraz właściwo­ści białek i kwasów nukleinowych. Transport wody od­bywa się zgodnie z gradientem stężeń, za pośrednictwem osmozy, czyli samorzutnego przechodzenia cząsteczek roz­puszczalnika przez półprzepuszczalną błonę, w tym wy­padku błonę komórkową, pod wpływem zmian zewnętrz­nej osmolalności [7].
W układzie modelowym mogą występować zjawiska zakłó­cające proces osmozy. Ze względu na indywidualny charak­ter zaburzeń nawet najbardziej idealna membrana będzie charakteryzowała się różną przenikalnością związków ni­skocząsteczkowych [25]. Na powierzchni membrany może się wytworzyć potencjał polaryzujący środowisko na gra­nicy faz membrana/roztwór lub bezpośrednio w przekroju membrany. Polaryzacja membrany zaburza przepływ nała­dowanych cząsteczek. Pojęcie idealnej membrany nie znaj­duje odzwierciedlenia w rzeczywistości. Nawet „inertne chemicznie" membrany otrzymane na bazie celulozy nie są obojętne względem otoczenia. Celuloza, z której wykona­na jest membrana, jest acetylowana, sieciowana chemicz­nie, może zawierać śladową zawartość reszt fosforanowych itp. Obecność często niezidentyfikowanych zanieczyszczeń powoduje adsorpcję cząsteczek na membranie. W przy­padku koloidów polaryzacja membrany może spowodo­wać wystąpienie dodatkowej półprzepuszczalnej warstwy wytworzonej przez adsorbowane makrocząsteczki. W uzu­pełnieniu należy wspomnieć o możliwościach zatykania porów lub o ich deformacji. W przyrodzie procesy mem­branowe są naturalnym elementem życia komórki [19,66].
Procesowi osmozy w naturalny sposób towarzyszy zjawisko ciśnienia osmotycznego, które zależy od stężenia i rodza­ju substancji oraz temperatury. Ciśnienie osmotyczne jest jednym z fizycznych parametrów środowiska limitującym wzrost i rozmnażanie się bakterii [10,37]. Zjawisko ciśnie­nia osmotycznego dobrze ilustruje zachowanie się dwóch roztworów oddzielonych od siebie półprzepuszczalną mem­braną zawierających różne stężenia lub rodzaje rozpusz­czonej substancji. Do naszych rozważań przyjmujemy, że membrana będzie idealnie selektywna, to znaczy w pełni przepuszczalna dla rozpuszczalnika i nieprzepuszczalna dla substancji rozpuszczonej. Prawa termodynamiki na­rzucają roztworom dążenie do wyrównania stężeń. W ide­alnym układzie cząsteczki rozpuszczalnika będą dyfundo­wały przez membranę rozcieńczając roztwór o wyższym stężeniu. W wyniku tego procesu dojdzie do zmian obję­tości poszczególnych podukładów, a w przypadku układu zamkniętego wytworzy się różnica ciśnień. W chwili usta­lenia równowagi, osiągnięta zostanie maksymalna różnica ciśnień, którą można nazwać ciśnieniem osmotycznym roz­tworu danej substancji.
Dla roztworów rozcieńczonych ciśnienie osmotyczne wy­raża się wzorem van't Hoffa:


lub


c - stężenie molowe substancji rozpuszczonej [mol/dm3],
R
- stała gazowa [8,314 J/mol×K],
T
- temperatura [K].
Oznacza to, że ciśnienie osmotyczne jest wprost proporcjo­nalne do stężenia roztworu oraz do temperatury bezwzględ­nej [64]. W praktyce mamy do czynienia z membranami, które trudno nazwać selektywnymi. Na przykład pory dia­lizacyjnej błony celulozowej pozwalają na dyfuzję relatyw­nie dużych cząsteczek. Błony biologiczne oprócz funkcji zamykania w określonej objętości organelli komórkowych zawierają wiele systemów aktywnego, błonowego trans­portu od jonów do makrocząsteczek. W przeciwieństwie do membran idealnych przepływy składników będą ulegały fluktuacjom. W przypadku organizmów żywych oraz wi­rusów, wartość ciśnienia osmotycznego będzie zależała od środowiska, etapu rozwoju komórki, stanu metaboliczne­go itd. Znajomość podstawowych praw rządzących osmozą i ciśnieniem osmotycznym może być pomocna w interpre­tacji wyników doświadczeń biologicznych. Parametry te są istotne w transporcie komórkowym, jak i w fizykochemii tkanek lub całych organów [1]. Istotne znaczenie w układzie biologicznym mają roztwory koloidalne. Chociaż stężenie molarne koloidu ze względu na dużą masę cząsteczkową jest niewielkie, to jednak właściwości fizykochemiczne makro­cząsteczek tworzących koloid mogą podlegać fluktuacjom w wyniku zmian na granicy faz ciecz/ciecz. Zmieniać się może hydratacja, potencjał zeta, oddziaływania między cząsteczkami itp. Wartości ciśnienia osmotycznego kolo­idów (colloid osmotic pressure, oncotic pressure) pozwa­lają oszacować wzory empiryczne. Na przykład ciśnienie osmotyczne albuminy Π=2,8c+0,18c2+0,012c3, osocza Π=2,1c+0,16c2+0,009c3, globulin Π=1,6c+0,15c2+0,006c3 (stężenie białka c [g/100 ml], Π [mmHg]) [40].
W analityce ciśnienie osmotyczne wyznacza się przez po­miar zmiany temperatur zamarzania lub wrzenia roztwo­ru i rozpuszczalnika. Inny sposób oznaczania wykorzystu­je pomiar wydzielonego ciepła krystalizacji. W tym celu próbkę schładza się do temperatury poniżej temperatury zamarzania. Po zainicjowaniu krystalizacji dochodzi do wydzielenia ciepła, którego miernikiem jest wzrastająca do wartości maksymalnej temperatura. Wydzielona ener­gia powoduje nagrzewanie próbki, której wielkość jest skorelowana z osmolarnością roztworu. Ciśnienie osmo­tyczne roztworów niedegradujących błon lipidowych (np. niezawierających detergentów) można wyznaczać poprzez pomiar zmian pojemności komórek, w tym erytrocytów, w środowiskach hiper- i hipotonicznych [23]. Tradycyjna metoda pomiaru ciśnienia osmotycznego wykorzystuje osmometry membranowe bezpośrednio mierzące zmiany ciśnienia roztworów przedzielonych membraną. W meto­dzie hydrostatycznej aparat złożony jest z dwóch zbiorni­ków oddzielonych membraną. Po wypełnieniu zbiorników rozpuszczalnikiem i roztworem po ustalonym czasie wy­stąpi różnica ciśnień. Na innej zasadzie działa osmometr parowy. Do oznaczenia ciśnienia osmotycznego wyko­rzystuje się pomiar efektu cieplnego kondensacji par roz­puszczalnika w kropli badanego roztworu i rozpuszczalni­ka. Kondensacja par w kropli roztworu jest większa, stąd wyższy wzrost temperatury, który jest skorelowany z ci­śnieniem osmotycznym badanego roztworu. Zjawisko ci­śnienia osmotycznego może być wykorzystywane do wyzna­czania masy molowej makrocząsteczek. Szczegółowy opis doświadczenia znajduje się w opracowaniu Krzymińskiego i Sieradzana [31].
Osmolalność, opisująca ciśnienie osmotyczne, to liczba moli substancji aktywnych znajdujących się w litrze roz­puszczalnika. Pojęcie osmolarności natomiast odnosi się do ilości moli substancji przypadających na kilogram roz­puszczalnika. Osmolalność wyrażana jest w osmolach. Jej wartość zależna jest od liczby osmotycznie aktywnych cząstek oraz ich kształtu, ładunku i wielkości. Ze wzglę­du na specyfikę ciśnienia osmotycznego osmol [osm] nie jest jednostką układu SI. Jednostką ciśnienia osmotycz­nego jest pascal [Pa]. Wartość osmola skorelowana jest ze stężeniem. Ekwiwalentną wartością ciśnienia osmotycz­nego 1 osm będzie charakteryzował się roztwór zawiera­jący jednomolowe stężenie jonów lub substancji rozpusz­czonej [14]. Zakładając całkowitą dysocjację 1 M roztwór NaCl będzie charakteryzowany przez ciśnienie osmotycz­ne równe 2 osmole/L a CaCl2 3 osmole/L (dysocjuje na trzy jony). Precyzyjna definicja mówi o korelacji stężenia osmotycznie czynnych cząsteczek rozpuszczonych w 22,4 L roztworu w temperaturze 0°C przy ciśnieniu zewnętrznym 1013,25 hPa. Praktycznie 1 osmolowi odpowiada takie stę­żenie rozpuszczanej substancji, które powoduje obniżenie temperatury krzepnięcia roztworu o 1,86°C.
Błona komórkowa ma stosunkowo dużą przepuszczal­ność dla wody. Wynika to z jej szybkiego transbłonowe­go transportu w odpowiedzi na zmiany osmotyczne śro­dowiska oraz zmiany w strukturze komórki i koncentracji składników komórkowych. Akwaporyny, które mogą po­średniczyć w przyspieszonym transporcie wody ziden­tyfikowano w komórkach niektórych mikroorganizmów [3,6,24]. Jednak drobnoustroje nie mają możliwości ak­tywnego pompowania wody do i na zewnątrz komórki [24]. Zdolność mikroorganizmów do dostosowywania się do zmian zewnętrznej osmolalności, związanej głównie ze stężeniem NaCl, jest niezmiernie ważna dla ich wzrostu i przeżycia, stąd w toku ewolucji wykształciły się u nich liczne mechanizmy pozwalające im na szybką adaptację do zmieniających się warunków osmotycznych środowi­ska (ryc.1). Wzrost zewnętrznej osmolalności, ciśnienia osmotycznego, powoduje gwałtowny wypływ wody zgod­nie z gradientem stężeń, skutkując dehydratacją składni­ków cytoplazmy i plazmolizą. Odwrotna sytuacja prowa­dzi do nadmiernego pobierania wody ze środowiska, co może spowodować jej rozerwanie [10].
Ryc. 1. Wpływ warunków osmotycznych na wzrost i funkcjonowanie komórki (wg [43] zmodyfikowany)

W wielu sytuacjach trudny jest bezpośredni pomiar ci­śnienia osmotycznego, ponieważ wartość ta ma znaczenie tylko w kontekście rozpatrywania dwóch roztworów od­dzielonych półprzepuszczalną membraną. Większe zna­czenie w opisywaniu osmotycznych właściwości roztwo­ru ma pojęcie potencjału osmotycznego (π), które zależy od aktywności rozpuszczalnika i wyrażane jest wzorem:


gdzie
R - stała gazowa [8,314 J/mol×K],
T - temperatura [K],
Vw - objętość molowa wody [m3/mol-1],
aw - aktywność wody.
Wzrost temperatury o 1K powoduje wzrost ciśnienia o 1/273. Zgodnie z definicją aktywność czystego rozpusz­czalnika jest równa 1 (czysta chemicznie woda), więc po­tencjał osmotyczny każdego czystego rozpuszczalnika wy­nosi 0. Ogólnie dodanie substancji rozpuszczonej obniża aktywność rozpuszczalnika do wartości <1, więc poten­cjał osmotyczny roztworu jest zwykle ujemny. W mikro­biologii wartość aktywności wody (aw) stosuje się w celu dokładniejszego określenia zapotrzebowania drobnoustro­jów na wodę. Minimalna aktywność wody pozwalająca na wzrost i rozwój komórki jest różna dla różnych grup drob­noustrojów np. dla bakterii Gram-ujemnych wynosi 0,95, dla drożdży 0,88, natomiast dla halofilnych bakterii i glo­nów 0,75 [45]. Użyteczność potencjału osmotycznego po­lega na tym, iż wskazuje on, że gdy roztwór jest oddzielo­ny od cząsteczek rozpuszczalnika przez membranę, która jest bardziej przepuszczalna dla rozpuszczalnika niż sub­stancji rozpuszczonej, to cząsteczki rozpuszczalnika migru­ją z regionu o wyższym do regionu o niższym potencjale osmotycznym. Biologiczna definicja ciśnienia osmotycz­nego oznacza wzrost lub spadek siły osmotycznej środo­wiska działającej na dany organizm [61]. Aktywny proces radzenia sobie organizmów ze stresem osmotycznym jest rozumiany jako osmoregulacja [10,65].
Ze zjawiskiem osmoregulacji wiąże się także pojęcie ci­śnienia turgorowego, które wywierane jest na warstwę peptydoglikanu budującego ściany bakterii, wynikają­ce z różnicy potencjału osmotycznego między wnętrzem a otoczeniem komórki. Wpływ na ciśnienie turgorowe mają substancje osmoaktywne, magazynowane w cyto­plazmie. Żywe komórki mają dodatnie ciśnienie turgoro­we, które zapewnia im prawidłowe funkcjonowanie i roz­wój. Dostarcza ono m.in. podstawowej siły mechanicznej niezbędnej do rozwoju wielowarstwowej ściany komórko­wej. Turgor wpływa zatem na morfogenezę komórki bak­teryjnej. Jeśli komórka ma przyjąć dowolny kształt, poza sferycznym, musi zostać poddana procesom rozciągania ściany lub jej rozszerzania przez wstawianie nowych frag­mentów budulcowych ściany. Rozbudowa musi postępować w taki sposób, aby ściana pozostała integralną strukturą, chroniącą komórkę przed pękaniem pod wpływem jakich­kolwiek czynników mechanicznych [21]. Wartość ciśnie­nia turgorowego zależy od rodzaju bakterii, literatura po­daje wartości 3-10 bar dla bakterii Gram-ujemnych i 20 bar dla bakterii Gram-dodatnich. Komórki utrzymują ponadto nieco wyższe ciśnienie turgorowe w stosunku do otocze­nia poprzez akumulację substancji osmoaktywnych [27].
Przystosowania mikroorganizmów do zmian warunków osmotycznych środowiska
Aby utrzymać ustaloną zawartość wody w komórce (tur­gor) i uniknąć niekorzystnych następstw zwiększającej się osmolarności środowiska organizmy muszą zachować w cytoplazmie odpowiednie stężenia cząsteczek osmore­gulacyjnych (compatible solutes - cząsteczki osmoregu­lacyjne, osmolity) oraz jonów nieorganicznych, głównie K+ i Cl-, w stosunku do otaczającego medium. Wybrane przykłady substancji osmoregulacyjnych zidentyfikowa­nych w komórkach Procaryota przedstawiono na ryc. 2.
Ryc. 2. Budowa chemiczna wybranych substancji osmoregulacyjnych występujących u Procaryota (wg [48,52])

Jedna z możliwości utrzymania homeostazy komórki to po­bieranie jonów z otoczenia, określana jako strategia typu „salt-in". Sposób ten jest charakterystyczny dla wysoce wyspecjalizowanych mikroorganizmów, zdolnych do ży­cia niemal w nasyconych solankach, takich jak halofilne Archea (Halobacteriaceae), ale także niektóre aerobowe i anaerobowe halofilne Bacteria (np. Salinibacter ruber), polegający na ograniczeniu wzrostu w warunkach niskich stężeń soli w środowisku. U tych organizmów całkowita zawartość soli w komórce odpowiada w przybliżeniu stę­żeniom pozakomórkowym. Cytoplazmatyczna zawartość jonów chloru jest zwykle podobna do obecnej w podłożu, jonów sodu czasem bywa niższa, natomiast jony potasu mogą występować nawet w większych stężeniach w po­równaniu do środowiska zewnętrznego komórki. Strategię tę wykorzystuje niewielka liczba mikroorganizmów ogra­niczona do rzadkich nisz ekologicznych [11,41].
Druga z możliwości to strategia typu „salt-out", którą sto­suje większość komórek/organizmów. Polega ona na tym, że komórka utrzymuje raczej stałe, niskie stężenie jonów nieorganicznych w cytoplazmie [20,22]. Niski potencjał osmotyczny wody w obecności wysokich stężeń pozakomór­kowych soli jest osiągany dzięki gromadzeniu cząsteczek osmoregulacyjnych, określanych jako małe, rozpuszczalne cząsteczki organiczne, które nie ingerują w centralny meta­bolizm komórki, nawet jeśli są gromadzone w dużych stę­żeniach [12]. Przy wysokim stężeniu w cytoplazmie jonów Na+/Cl- strategia „salt-out" jest dla bakterii niekorzystna, ponieważ aktywność metaboliczna jest hamowana przez duże stężenia soli, co prowadzi do licznych zmian w funk­cjonowaniu komórki. Z tego względu niezwykle ważna jest zawartość jonów Na+/Cl- oraz rola jonów K+ magazyno­wanych w cytoplazmie i wymienianych z Na+, które w du­żych ilościach są dla komórki toksyczne. Dla optymalnych warunków wzrostu bakterie starają się utrzymywać na sta­łym poziomie stosunek Na+/K+ w cytoplazmie [59]. Wyniki badań Shabali [58] pokazują także, iż w przypadku braku osmolitów w środowisku, bakterie, takie jak Escherichia coli, przestawiają się na intensywne pobieranie jonów K+ w celu zachowania równowagi osmotycznej w warunkach hiperosmotycznych. Autorka sugeruje, że rola substancji osmoregulacyjnych w dostosowywaniu się bakterii do wa­runków zewnętrznej osmotyczności jest pośrednia i ogra­niczona do sprawnej regulacji działania licznych kana­łów jonowych i transporterów. Warto również zauważyć, iż do wzrostu niektórych bakterii obecność jonów chloru jest niezbędna w warunkach hiperosmotycznych, spowo­dowanych wysokim stężeniem jonów Na+. Jony Cl- pełnią ważną rolę w utrzymywaniu homeostazy Na+ przez wy­woływanie ich wypływu z komórki i/lub udział w procesie transdukcji sygnału wewnątrzkomórkowego [22]. Strategia typu „salt-out", wykorzystywana m.in. przez cyjanobakte­rie zamieszkujące słodko i słonowodne siedliska, została dokładnie opisana przez Hagemanna [20] w artykule doty­czącym molekularnego podłoża przystosowywania się cy­janobakterii do różnych warunków zasolenia. Warto rów­nież zauważyć, iż wykorzystywany przez te organizmy system „salt-out" przypomina ten występujący u hetero­troficznych bakterii, takich jak E. coli czy Bacillus subtilis.
W przeciwieństwie do nich jednak fotoautotroficzne cyja­nobakterie preferują syntezę de novo niż pobieranie sub­stancji osmoregulacyjnych z otoczenia, co jest związane z ich naturalnym środowiskiem życia, ubogim w rozpusz­czalne związki organiczne.
Zawartość osmolitów w komórce regulowana jest przez ciśnienie osmotyczne. Badania wykazały także zasadni­czą różnicę w podatności na plazmolizę między bakteria­mi Gram-dodatnimi (mniej podatne) i Gram-ujemnymi. Ma to związek zarówno z odmienną budową komórki jak i ciśnieniem turgorowym, które u bakterii Gram-dodatnich jest wyższe. W sytuacji stresu osmotycznego bowiem bak­terie Gram-ujemne gromadzą w komórce duże ilości glu­taminianu potasu, podczas gdy Gram-dodatnie gromadzą prolinę. Przy braku stresu osmotycznego bakterie Gram-dodatnie mają zatem duże zasoby aminokwasów, z prze­wagą glutaminianu. Ponadto większe jest u nich stężenie jonów K+, co skutkuje utrzymaniem wyższego turgoru ko­mórkowego [49,60].
Substancje osmoregulacyjne
Substancje osmoregulacyjne odpowiadają za utrzyma­nie właściwego turgoru komórki oraz regulację ciśnienia osmotycznego. Należy jednak zaznaczyć, że nie wszystkie substancje osmoaktywne mogą wykazywać właściwości osmoregulacyjne. Wśród licznej grupy różnych substan­cji organicznych do osmolitów zaliczamy m.in. amino­kwasy, krótkie peptydy, cukry czy alkohole wielowodo­rotlenowe (tab. 1). Wszystkie charakteryzują się kilkoma wspólnymi cechami:
1. Są to małe, amfoteryczne lub obojętne cząsteczki or­ganiczne, dobrze rozpuszczalne w wodzie, tolerowane przez komórkę nawet w dużych stężeniach molarnych.
2. Mają niską molekularną masę cząsteczkową.
3. Nie wpływają negatywnie na metabolizm.
4. Stabilizują struktury białek i błon komórkowych, nie obniżają jednak aktywności enzymów.
5. Mogą być syntetyzowane de novo lub pobierane przez komórki ze środowiska.
6. Zwykle są to produkty końcowe reakcji metabolicz­nych, które dodatkowo mają właściwości osmoochron­ne w stosunku do składników cytoplazmy.
7. Ciśnienie osmotyczne wymusza w sposób selektywny ich kontrolowane przenikanie przez błonę komórkową.
Tabela 1. Substancje osmoregulacyjne wykorzystywane przez bakterie

W zależności od rodzaju drobnoustroju różny jest typ osmolitów, mechanizm ich pobierania ze środowiska oraz wpływ na wzrost i rozwój komórki. Bakterie Gram-dodatnie i Gram-ujemne różnią się między sobą preferencjami co do rodzaju gromadzonych substancji osmoregulacyjnych. W warunkach stresu osmotycznego bakterie Gram-ujemne magazynują głównie glutaminian oraz jony potasu, nato­miast Gram-dodatnie akumulują aminokwasy, zwłaszcza prolinę. Brak warunków stresu osmotycznego wskazuje na inne preferencje mikroorganizmów. W komórkach bakte­rii Gram-dodatnich przeważają wtedy jony K+ oraz kwas glutaminowy, ponieważ utrzymują one wyższe ciśnienie turgorowe. W przypadku proliny i betainy na uwagę za­sługuje to, iż komórki bakterii Gram-dodatnich syntety­zują te substancje, podczas gdy Gram-ujemne pobierają ze środowiska zewnętrznego. Jest to związane z różnym oddziaływaniem tej substancji na rozwój drobnoustrojów. Betaina stymuluje wzrost pałeczek jelitowych z rodziny Enterobacteriaceae w warunkach stresu osmotycznego wywołanego obecnością KCl i NaCl, a także sacharozy. Z kolei stymulacja wzrostu bakterii probiotycznych z grupy Lactobacillus i Lactococcus obserwowana jest tylko w obec­ności zwiększonych stężeń soli [16,33]. Niektóre klasy sub­stancji osmoregulacyjnych są mniej lub bardziej ograniczo­ne do specjalnych grup mikroorganizmów. W komórkach Archea gromadzone są m.in.: α-glutaminian, β-glutami­nian czy N-acetylo-β-lizyna [39]. Termofile i ekstermo­file, zaliczane do Archea, magazynują charakterystyczne osmolity (DIP, DGP, MG), które nie odgrywają żadnej roli u organizmów mezofilnych. Może to sugerować ich silny związek z przystosowaniem się do życia w warunkach wy­sokiej temperatury. Mechanizmy transportu i gromadze­nia substancji osmoregulacyjnych u ekstermofilów opisują Pflüger i Müller [48]. Niezwykle interesujące wydają się również badania Goha i wsp. [17], dotyczące nowo pozna­nych substancji osmoregulacyjnych sinic pochodzących ze stromatolitów występujących w Australii. Gatunki, takie jak Gleothece sp. czy Cyanothece sp. magazynują w swoich komórkach tlenek trimetylaminy (trimethylamine-N-oxide, TMAO), niezidentyfikowany dotąd jako osmolit u innych mikroorganizmów. Ponadto u Plectonema sp. i Symploca sp. opisano także nieznane dotychczas oligosacharydy, któ­re być może pełnią jednocześnie funkcje termoochronne.
Osmodetekcja i osmosygnalizacja
Zmiany ciśnienia osmotycznego środowiska powodują na­tychmiastową reakcję komórki bakteryjnej, która przede wszystkim stara się utrzymać turgor i objętość, takie jak dla normalnych fizjologicznie warunków życia. Jest to moż­liwe dzięki wykształceniu licznych mechanizmów osmo­adaptacyjnych, polegających na odbieraniu, rejestrowaniu i przetwarzaniu informacji o zmianach ciśnienia osmotycz­nego środowiska.
Zmieniające się ciśnienie osmotyczne środowiska może, jeśli wzrasta, prowadzić do gromadzenia osmolitów przez bakterie (stres hiperosmotyczny). Spadek ciśnienia osmo­tycznego, czyli warunki stresu hipoosmotycznego, powo­duje natomiast wyrzut syntetyzowanych wewnątrzkomór­kowo substancji osmoregulacyjnych na zewnątrz komórki. Bakterie mogą zatem zarówno pobierać, jak i pozbywać się osmolitów w warunkach narażenia na działanie stre­su osmotycznego.
Komórki bakterii Gram-ujemnych otoczone są błoną ko­mórkową, cienką warstwą peptydoglikanu (mureiny) oraz błoną zewnętrzną, w której zakotwiczone są cząsteczki li­popolisacharydu (LPS). Gram-dodatnie bakterie mają grub­szą warstwę mureiny, pozbawione są jednak LPS. Transport osmolitów odbywa się za pośrednictwem swoistych białek błonowych reagujących na zmieniające się warunki zasole­nia środowiska. Zarówno Bacteria jak i Archea, w wyniku ewolucji, wykształciły specjalistyczne systemy pobierania substancji osmoregulacyjnych z otoczenia. Cząsteczki te są uwalniane do środowiska przez różne mikroorganizmy z butwiejących szczątków roślin i zwierząt oraz produktów wydalania ssaków. Mechanizmy pobierania tych substan­cji bardzo często są zupełnie inne od systemów pobierania substancji odżywczych. Transportery osmolitów ewoluowa­ły w kierunku wysokiego powinowactwa do pobieranego składnika i sprawności fizjologicznej. Efektywnie funk­cjonują w warunkach wysokiej osmolalności środowiska oraz dużej siły jonowej, które najczęściej blokują pobie­ranie składników odżywczych. Mechanizmy pobierania substancji osmoregulacyjnych są kontrolowane na pozio­mie genetycznym oraz enzymatycznym (aktywacja białek transbłonowych) [27,50]. Pod pojęciem osmosensora na­leży rozumieć białko, które reaguje na zmiany potencjału osmotycznego środowiska, struktury czy składu komórki, a następnie generuje sygnały wewnątrzkomórkowe i aktywa­cję odpowiedzi osmoregulacyjnej. System osmoregulacyj­ny pobierania i wydalania osmolitów Eubacteria obejmu­je: transportery, kinazy histydynowe będące składnikami dwóch transkrypcyjnych systemów regulacyjnych oraz ka­nały uaktywniane przez bodźce mechaniczne (mechano­sensitive channel - Msc) [32].
Główne transportery odpowiedzialne za pobieranie substan­cji osmoregulacyjnych, takie jak: BetP u Corynebacterium glutamicum [38,44], ProP, ProU, BetT u E. coli czy Yersinia enterocolitica [2] oraz OpuA, OpuC, OpuD (Osmoprotectant uptake) u B. subtilis czy E. coli (ryc. 3), reagują na zmiany ciśnienia osmotycznego i aktywują od­powiedź osmoochronną bez udziału innych białek [26,30].
Ryc. 3. System osmoregulacyjny Escherichia coli (wg [53] zmodyfikowany). Transport wody odbywa się z udziałem błonowych akwaporyn (AqpZ). W procesie akumulacji jonów K+ pośredniczą natomiast transportery, takie jak TrkA(G/H)SapD oraz KdpFABC. Kontrola transkrypcji genów kdpFABC odbywa się z udziałem dwuelementowego układu KdpDE. Transportery ProP, ProU, BetT oraz BetU umożliwiają akumulację osmolitów organicznych. Synteza betainy katalizowana jest przez enzymy BetA i BetB, natomiast synteza trehalozy przez enzymy OtsA i OtsB. Wypływ substancji osmoregulacyjnych odbywa się za pośrednictwem kanałów uaktywnianych przez bodźce mechaniczne MscL i MscS

Równowaga między aktywnymi i nieaktywnymi konforma­cjami transporterów zależy od własności jonów wewnątrz­komórkowych działających na ich cytoplazmatyczne dome­ny C-końcowe. Jednak właściwy przejaw działania bodźca i charakter odpowiedzi jest różny dla różnych transporte­rów. Transbłonowe kinazy histydynowe reagują na zmiany ciśnienia osmotycznego poprzez oddziaływanie na czynniki transkrypcyjne, które aktywują geny kodujące motywy K+ATP-azy jednego z transporterów jonów potasu. Główne osmosensory mogą reagować na zmiany aktywności wody tak samo jak chemosensory reagują na zmiany aktywno­ści ligandów. Jednak zmiana ciśnienia osmotycznego wy­wołuje zmiany właściwości komórkowych. W ten sposób pośredni osmosensor może wykrywać zmiany ciśnienia osmotycznego aktywując zmiany w objętości komórki, turgorze komórkowym, odkształcenie błony komórkowej lub zmiany w stężeniu konkretnych substancji osmoregu­lacyjnych, sile jonowej oraz gromadzeniu się cząsteczek w cytoplazmie [65]. Obecna wiedza na temat osmosenso­rów dotyczy przede wszystkim rozpoznawania sygnałów z otoczenia, co jest powszechne także dla innych sytuacji stresu komórkowego. Ograniczona jest natomiast wiedza na temat promotorów genów, genów i kodowanych przez nie białek rzeczywiście zaangażowanych w regulację stę­żenia soli w komórce.
Oprócz pobierania substancji osmoregulacyjnych z otocze­nia mikroorganizmy mogą, za pośrednictwem endogennej syntezy, magazynować osmolity w dużych ilościach jesz­cze przed wystąpieniem warunków stresu osmotycznego. Jest to reakcja przypominająca „robienie zapasów", jed­nak może się okazać wyjątkowo niekorzystna dla komór­ki, jeśli ciśnienie osmotyczne środowiska zamiast wzra­stać, zacznie spadać. W takiej sytuacji obserwowany jest bardzo szybki wypływ substancji osmoregulacyjnych ka­nałami Msc. Białka te odgrywają bardzo ważną rolę w re­gulacji ciśnienia turgoru, które ma zasadnicze znaczenie dla podziału i wzrostu komórek bakteryjnych. Obecnie uważa się, iż cząsteczki te pojawiły się bardzo wcze­śnie w toku ewolucji, odgrywając główną rolę w strate­gii przetrwania mikroorganizmów, dając początek podob­nym kanałom w komórkach Procaryota i Eucaryota [35]. Najbardziej znanymi i najlepiej opisanymi kanałami typu Msc są białka MscL, MscS i MscM występujące u E. coli [4]. Kanały aktywowane są pod wpływem odkształceń w strukturze błony komórkowej wynikających ze zwięk­szenia objętości komórki, która pobiera duże ilości wody. Otwarcie kanałów wywołuje wypływ substancji osmore­gulacyjnych. Proces ten może być inicjowany działaniem bodźców mechanicznych lub zależny od systemu transpor­tu opartego na przenośnikach [55].
Praktyczne zastosowanie cząsteczek osmoregulacyjnych
Neutrofilne, halofilne oraz haloalkalofilne bakterie są pro­ducentami zarówno alkalicznych enzymów jak i organicz­nych cząsteczek osmoregulacyjnych. Swoisty charakter tych związków czyni je niezwykle cennymi narzędziami w wielu dziedzinach nauki i przemysłu, takich jak biotech­nologia, kosmetologia, medycyna, farmacja czy agrokul­tura [11,15]. Bakterie te do osiągnięcia równowagi osmo­tycznej w środowiskach o dużym zasoleniu syntetyzują znaczne ilości osmolitów, takich jak: ektoina, betaina czy hydroksyektoina. Poddając komórki działaniu szoku hi­perosmotycznego na skalę przemysłową można wywołać u nich szybkie uwalnianie dużych ilości substancji osmo­regulacyjnych [15].
Wykorzystanie cząsteczek osmoregulacyjnych w biotech­nologii związane jest głównie z ich zastosowaniem w no­woczesnych systemach buforujących do ochronny aktyw­ności komercyjnie stosowanych enzymów. Jako przykład można wymienić działanie ektoiny oraz hydroksyekto­iny [42]. Obie substancje stabilizują kwasy nukleinowe oraz liczne labilne enzymy in vitro, co znacznie wydłuża ich czas działania. Ponadto chronią enzymy przed działa­niem wysokiej i niskiej temperatury, wysychaniem, a tak­że wpływem wolnych rodników tlenowych i promieniowa­niem. Te ostatnie mają ogromne znaczenie w kosmetologii, wykazano bowiem ochronne działanie ektoiny na komórki ludzkiej skóry poddane szkodliwemu działaniu promienio­wania ultrafioletowego. Ochronne działanie ektoiny i hy­droksyektoiny w stosunku do enzymów zauważono także w procesach fermentacyjnych, zwłaszcza u bakterii kwa­su mlekowego [34]. Znakomitymi stabilizatorami enzy­mów, m.in. dehydrogenazy mleczanowej czy białek z gru­py reduktaz, są również ujemnie naładowane cząsteczki glukoglicerolu i glukoglicerynianu szeroko rozpowszech­nione i pozyskiwane z bakterii (hiper)termofilnych [56].
Ogromne znaczenie ektoiny w medycynie przypisuje się jej właściwościom przeciwzapalnym oraz przeciwwiruso­wym. Największymi producentami ektoiny oraz hydrok­syektoiny są α- oraz γ-Proteobacteria i Actinobacteridae, np. Halomonas elongata czy Chromohalobacter selexigens [47,57]. Ponadto wykazano, że ektoina chroni błony ko­mórkowe przed uszkodzeniami spowodowanymi działa­niem surfaktantów. Jak się okazuje miejscowe zastoso­wanie emulsji wodnych z dodatkiem ektoiny zmniejsza narażenie skóry na wysychanie, co świadczy o jej nawil­żających właściwościach. Ze względu na wyjątkową ak­tywność wiązania wody ektoina może być szczególnie przydatna w zapobieganiu utraty wody w suchej i atopo­wej skórze, w odzyskaniu zdrowego wyglądu skóry i za­pobieganiu jej starzenia się [18].
Organiczne cząsteczki osmoregulacyjne, takie jak be­taina znane są ze swoich właściwości krioochronnych. Z tego względu znalazły zastosowanie jako stabilizato­ry w procesie zamrażania i długoterminowego przecho­wywania komórek mikroorganizmów. Ich działanie może być skuteczniejsze niż powszechnie stosowanych albumi­ny czy mieszanki trehalozy i dekstranu [9]. Betaina sto­sowana jest także w terapii kompleksowej chorób układu krwionośnego, a także schorzeń o podłożu neurologicz­nym i psychicznym. Obniża prawdopodobieństwo wystą­pienia ataku serca, zatoru, udaru czy chorób obwodowych naczyń krwionośnych [62].
Ciekawym zagadnieniem wydaje się zastosowanie czą­steczek osmoregulacyjnych w rolnictwie. Okazało się, iż efekt działania osmolitów nie jest swoisty gatunkowo, co pozwala na swobodne wprowadzenie systemu osmoregu­lacyjnego do komórek roślin. Próby takie zostały już pod­jęte w stosunku do genów ektoiny i betainy, którymi trans­formowano rośliny niehalofilne, zwiększając w ten sposób ich odporność na stres osmotyczny środowiska czy wpływ niskiej temperatury [8,46,54].
Wpływciśnienia osmotycznego na przeżywalność i struktury komórkowe bakterii
Błony biologiczne są bardziej przepuszczalne dla wody niż dla większości substancji rozpuszczonych, dlatego stężenie tych substancji w otoczeniu ma ogromny wpływ na komórki żywe. W komórkach poddawanych działaniu stresu osmotycznego mogą się uaktywniać dwa mechani­zmy reakcji. Pierwszy dotyczy pasywnego wypływu wody z komórki, powodującego spadek ciśnienia osmotycznego i w efekcie śmierć komórki. Dochodzi bowiem do zmniej­szenia objętości komórki spowodowanej redukcją objętości cytoplazmy. Drugi mechanizm, uruchamiany gdy spadek potencjału wody nie jest zbyt duży, polega na aktywacji systemu osmoregulacyjnego komórki. Następuje szybka synteza osmolitów, zmianie ulega przepuszczalność bło­ny komórkowej, co prowadzi do poboru wody z otoczenia. Na przykład u E. coli jest to kontrolowane gromadzenie jonów K+, a następnie akumulacja organicznych cząste­czek proliny i/lub betainy. Ta biologiczna odpowiedź po­zwala komórce na przywrócenie objętości, jeśli nie do­szło do uszkodzenia błony komórkowej. Uszkodzenia takie stanowią bowiem główny skutek działania stresu osmotycz­nego, ale również innych czynników środowiskowych, ta­kich jak temperatura czy ciśnienie osmotyczne. Komórki E. coli poddawane działaniu stresu osmotycznego, wywoła­nego stężeniem glicerolu, wykazywały zmiany żywotności w zależności od wielkości ciśnienia osmotycznego i tem­peratury. Zwiększające się ciśnienie osmotyczne z 26 do ponad 133 MPa powodowało spadek żywotności komórek z ponad 80 do 10%. Najlepiej tolerowane zmiany ciśnie­nia osmotycznego mieściły się w zakresie 1,38-35 MPa. Kombinacja działania ciśnienia osmotycznego i tempera­tury (4, 10, 30 i 37°C) miała zróżnicowany wpływ na ko­mórki. W przedziale 1,38-35 MPa temperatura wpływa­ła na przeżywalność komórek mikroorganizmów, wyższe wartości ciśnienia (>35 MPa) i temperatury drastycznie ograniczały jednak ich wzrost. Ciekawe są również obser­wacje, z których wynika, że przy bardzo wysokich war­tościach ciśnienia osmotycznego (82-133 MPa) i niskiej temperaturze (4-10°C) żywotność bakterii jest utrzymy­wana na poziomie ponad 10%, spada natomiast wraz ze wzrostem temperatury [37].
Do prawidłowego funkcjonowania komórki oraz ochro­ny przed śmiercią mikroorganizmy utrzymują równo­wagę między dehydratacją a rehydratacją, ponieważ ży­wotność bakterii jest znacznie lepsza, kiedy procesy te przebiegają stopniowo i powoli. Gwałtowne zmiany wy­woływane szokiem osmotycznym mogą prowadzić m.in. do zmian w strukturze fosfolipidowej błony komórkowej [5]. W strukturze błony komórkowej większości bakterii występują amfoteryczne i anionowe fosfolipidy, takie jak fosfatydyloetanolamina i fosfatydyloglicerol oraz difosfa­tydyloglicerol (kardiolipina). Poddanie bakterii działaniu stresu osmotycznego, wywołanego działaniem różnych stężeń soli, powoduje zmiany w proporcji między dwoma rodzajami fosfolipidów błonowych. Następuje gwałtow­ny wzrost zawartości cząsteczek anionowych i jednocze­sny spadek fosfolipidów amfoterycznych. U E. coli stres osmotyczny wywołany działaniem elektrolitów i nieelek­trolitów, powoduje wzrost zawartości kardiolipiny a spa­dek fosfatydyloetanolaminy. Zmiana zawartości frakcji fosfolipidowej błony ma także bezpośredni wpływ na ak­tywację i funkcjonowanie transporterów błonowych np. ProP [53]. Badania Mille i wsp. [37] wykazały, iż komór­ki E. coli pod wpływem wysokiego ciśnienia osmotycz­nego 26-40 MPa wykazują drastyczny spadek objętości komórki na skutek mechanicznych uszkodzeń błony ko­mórkowej i deformacji kurczącej się komórki. Zmiany na powierzchni komórki, takie jak pęcherzykowatość błony, były nieodwracalne, kiedy dehydratacja a następnie rehy­dratacja przebiegały gwałtownie.
Czynniki środowiska życia bakterii, takie jak temperatu­ra, pH, ciśnienie osmotyczne, wyczerpanie składników od­żywczych oraz obecność cząsteczek toksycznych bądź ha­mujących wzrost (np. antybiotyki), mogą mieć niekorzystny wpływ na rozwój komórki. Może się to przejawiać w zaha­mowaniu wzrostu lub nawet śmierci komórki. Badania gru­py McMahona [36] wykazały, iż stres osmotyczny (>4,5% zasolenia) oraz niskie pH (<5) prowadzą do wzrostu anty­biotykooporności patogenów pokarmowych, takich jak E. coli, Salmonella enterica czy S. aureus. Redukcja działania czynnika stresowego pozwalała na utrzymanie braku wrażli­wości na antybiotyki, co sugeruje, że działanie subletalnych warunków stresowych indukuje stabilny wzrost lekooporności. W praktyce może to oznaczać, że zastosowanie subletalnych (ograniczających wzrost), bardziej niż letalnych (bójczych) warunków konserwujących, może prowadzić do rozwoju lekooporności wśród znanych patogenów żywnościowych.
Podsumowanie
Wzrost i rozmnażanie się bakterii w warunkach zmienne­go ciśnienia osmotycznego środowiska zależne są od dzia­łania wielu czynników. Jednym z najważniejszych mecha­nizmów osmoregulacyjnych, pozwalających na adaptację do nowych warunków zewnętrznych, jest gromadzenie swoistych substancji osmoregulacyjnych, tzw. osmolitów. Obecnie opisanych jest wiele mechanizmów osmoregula­cyjnych oraz białek zaangażowanych w aktywny transport osmolitów do komórki. Znajomość wpływu czynników środowiskowych, zwłaszcza ciśnienia osmotycznego, na bakterie pozwala na ich odpowiednie wykorzystanie, m.in. w przemyśle biotechnologicznym czy spożywczym. Dzięki sprawnej regulacji działania danego parametru można do­kładnie kierować szybkością podziałów komórkowych, de­cydować o zabiciu komórki, ale także kontrolować prze­bieg wielu różnych reakcji enzymatycznych.
PIŚMIENNICTWO
[1] Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raft M., Roberts K., Walter P.: Molecular biology of the cell. Garland Science, 4th Edition, 2002
[2] Annamalai T., Venkitanarayanan K.: Role of proP and proU in betaine uptake by Yersinia enterocolitica under cold and osmotic stress conditions. Appl. Environ. Microbiol., 2009; 75: 1471-1477
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[3] Bonhivers M., Carbrey J.M., Gould S.J., Agre P.: Aquaporins in v. Genetic and functional distinctions between laboratory and wild-type strains. J. Biol. Chem., 1998; 273: 27565-27572
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[4] Booth I.R., Louis P.: Managing hypoosmotic stress: aquaporins and mechanosensitive channels in Escherichia coli. Curr. Opin. Microbiol., 1999; 2: 166-169
[PubMed]  
[5] Brown G.R., Sutcliffe I.C., Bendell D., Cummings S.P.: The modification of the membrane of Oceanomonas baumannii when subjected to both osmotic and organic solvent stress. FEMS Microbiol. Lett., 2000; 189: 149-154
[PubMed]  
[6] Calamita G., Bishai W.R., Preston G.M., Guggino W.B., Agre P.: Molecular cloning and characterization of AqpZ, a water channel from Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1995; 270: 29063-29066
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[7] Cath T.Y., Childress A.E., Elimelech M.: Forward osmosis: principles, applications, and recent developments. J. Membrane Sci., 2006; 281: 70-87
[8] Chen T.H., Murata N.: Glycinebetaine: an effective protectant against abiotic stress in plants. Trends Plant. Sci., 2008; 13: 499-505
[PubMed]  
[9] Cleland D., Krader P., McCree C., Tang J., Emerson D.: Glycine betaine as a cryoprotectant for prokaryotes. J. Microbiol. Methods, 2004; 58: 31-38
[PubMed]  
[10] Csonka L.N.: Physiological and genetic responses of bacteria to osmotic stress. Microbiol. Rev., 1989; 53: 121-147
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[11] Detkova E.N., Boltianskaia I.V.: Osmoadaptation of haloalkaliphilic bacteria: role of osmoregulators and their possible practical application. Mikrobiologiia, 2007; 76: 581-593
[PubMed]  
[12] Empadinhas N., da Costa M.S.: Osmoadaptation mechanisms in prokaryotes: distribution of compatible solutes. Int. Microbiol., 2008; 11: 151-161
[PubMed]  
[13] Empadinhas N., da Costa M.S.: Diversity, biological roles and biosynthetic pathways for sugar-glycerate containing compatible solutes in Bacteria and Archaea. Environ. Microbiol., 2011; 13: 2056-2077
[PubMed]  
[14] Erstad B.L.: Osmolality and osmolarity: narrowing the terminology gap. Pharmacotherapy, 2003; 23: 1085-1086
[PubMed]  
[15] Fallet C., Rohe P., Franco-Lara E.: Process optimization of the integrated synthesis and secretion of ectoine and hydroxyectoine under hyper/hypo-osmotic stress. Biotechnol. Bioeng., 2010; 107: 124-133
[PubMed]  
[16] Glaasker E., Tjan F.S., Ter Steeg P.F., Konings W.N., Poolman B.: Physiological response of Lactobacillus plantarum to salt and nonelectrolyte stress. J. Bacteriol., 1998; 180: 4718-4723
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[17] Goh F., Barrow K.D., Burns B.P., Neilan B.A.: Identification and regulation of novel compatible solutes from hypersaline stromatolite-associated cyanobacteria. Arch. Microbiol., 2010; 192: 1031-1038
[PubMed]  
[18] Graf R., Anzali S., Buenger J., Pfluecker F., Driller H.: The multifunctional role of ectoine as a natural cell protectant. Clin. Dermatol., 2008; 26: 326-333
[PubMed]  
[19] Groysman N., Orynbayeva Z., Katz M., Kolusheva S., Khanin M., Danilenko M., Jelinek R.: Membrane processes and biophysical characterization of living cells decorated with chromatic polydiacetylene vesicles. Biochim. Biophys. Acta, 2008; 1778: 1335-1343
[PubMed]  
[20] Hagemann M.: Molecular biology of cyanobacterial salt acclimation. FEMS Microbiol. Rev., 2011; 35: 87-123
[PubMed]  
[21] Harold F.M.: Bacterial morphogenesis: learning how cells make cells. Curr. Opin. Microbiol., 2007; 10: 591-595
[PubMed]  
[22] Heermann R., Jung K.: Structural features and mechanisms for sensing high osmolarity in microorganisms. Curr. Opin. Microbiol., 2004; 7: 168-174
[PubMed]  
[23] Heubusch P., Jung C.Y., Green F.A.: The osmotic response of human erythrocytes and the membrane cytoskeleton. J. Cell Physiol., 1985; 122: 266-272
[PubMed]  
[24] Hohmann I., Bill R.M., Kayingo I., Prior B.A.: Microbial MIP channels. Trends Microbiol., 2000; 8: 33-38
[PubMed]  
[25] Janáček K., Sigler K.: Osmosis: membranes impermeable and permeable for solutes, mechanism of osmosis across porous membranes. Physiol. Res., 2000; 49: 191-195
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[26] Kempf B., Bremer E.: Stress response of Bacillus subtilis to high osmolarity environments:uptake and synthesis of osmoprotectants. J. Biosci., 1998; 23: 447-455
[27] Kempf B., Bremer E.: Uptake and synthesis of compatibile solutes as microbial stress responses to high-osmolality environments. Arch. Microbiol., 1998; 170: 319-330
[PubMed]  
[28] Khmelenina V.N., Sakharovskii V.G., Reshetnikov A.S., Trotsenko I.A.: Synthesis of osmoprotectors by halophilic and alkalophilic methanotrophs. Mikrobiologiia, 2000; 69: 465-470
[PubMed]  
[29] Kiena R.P.: Uptake of choline and its conversion to glycine betaine by bacteria in estuarine waters. Appl. Environ. Microbiol., 1998; 64: 1045-1051
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[30] Krämer R.: Bacterial stimulus perception and signal transduction: response to osmotic stress. Chem. Rec., 2010; 10: 217-229
[PubMed]  
[31] Krzymiński K., Sieradzan A.: Wyznaczanie masy molowej makromolekuł metodą osmometryczną (09.11.2011)
www.chem.ug.edu.pl/kchfiz/assets/.../OSMOZAinstrukcja02-2011.doc
[32] Kung C., Martinac B., Sukharev S.: Mechanosensitive channels in microbes. Annu. Rev. Microbiol., 2010; 64: 313-329
[PubMed]  
[33] Kwon Y.D., Kim S., Lee S.Y., Kim P.: Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain. J. Biosci. Bioeng., 2011; 111: 26-30
[PubMed]  
[34] Margesin R., Schinner F.: Potential of halotolerant and halophilic microorganisms for biotechnology. Extremophiles, 2001; 5: 73-83
[PubMed]  
[35] Martinac B., Kloda A.: Evolutionary origins of mechanosensitive ion channels. Prog. Biophys. Mol. Biol., 2003; 82: 11-24
[PubMed]  
[36] McMahon M.A., Xu J., Moore J.E., Blair I.S., McDowell D.A.: Environmental stress and antibiotic resistance in food-related pathogens. Appl. Environ. Microbiol., 2007; 73: 211-217
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[37] Mille Y., Beney L., Gervais P.: Viability of Escherichia coli after combined osmotic and thermal treatment: a plasma membrane implication. Biochim. Biophys. Acta, 2002; 1567: 41-48
[PubMed]  
[38] Morbach S., Krämer R.: Structure and function of the betaine uptake system BetP of Corynebacterium glutamicum: strategies to sense osmotic and chill stress. J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 2005; 10: 143-153
[PubMed]  
[39] Müller V., Spanheimer R., Santos H.: Stress response by solute accumulation in Archaea. Curr. Opin. Microbiol., 2005; 8: 729-736
[PubMed]  
[40] Nitta S., Ohnuki T., Ohkuda K., Nakada T., Staub N.C., Tohoku J.: The corrected protein equation to estimate plasma Collodi osmotic pressure and its development on a nomogram. Tohoku J. Exp. Med., 1981; 135: 43-49
[PubMed]  
[41] Oren A.: Microbial life a high salt concentrations: phylogenetic and metabolic diversity. Saline Systems, 2008; 4: 2
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[42] Oren A.: Industrial and environmental applications of halophilic microorganisms. Environ. Technol., 2010; 31: 825-834
[PubMed]  
[43] O'Toole M.T.: Miller-Keane Encyclopedia and Dictionary of Medicine, Nursing, and Allied Health, wyd. 7, Saunders 2003
[44] Ozcan N., Ejsing C.S., Shevchenko A., Lipski A., Morbach S., Krämer R.: Osmolality, temperature, and membrane lipid composition modulate the activity of betaine transporter BetP in Corynebacterium glutamicum. J. Bacteriol., 2007; 189: 7485-7496
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[45] Pałacha Z.: Aktywność wody-ważny parametr żywności. Przemysł Spożywczy, 2008; 62: 22-26
[Abstract]  
[46] Park E.J., Jeknić Z., Sakamoto A., DeNoma J., Yuwansiri R., Murata N., Chen T.H.: Genetic engineering of glycinebetaine synthesis in tomato protects seeds, plants, and flowers from chilling damage. Plant. J., 2004; 40: 474-487
[PubMed]  
[47] Pastor J.M., Salvador M., Argandona M., Bernal V., Reina-Bueno M., Csonka L.N., Iborra J.L., Vargas C., Nieto J.J., Cánovas M.: Ectoines in cell stress protection: uses and biotechnological production. Biotechnol. Adv., 2010; 28: 782-801
[PubMed]  
[48] Pflüger K., Müller V.: Transport of compatibile solutes in extermophiles. J. Bioenerg. Biomembr., 2004; 36: 17-24
[PubMed]  
[49] Poolman B., Glaasker E.: Regulation of compatible solute accumulation in bacteria. Mol. Microbiol., 1998; 29: 397-407
[PubMed]  
[50] Powałowski S., Gulewicz P., Grajek W.: Wpływ ciśnienia osmotycznego na stan fizjologiczny komórek bakteryjnych. Postępy Biol. Kom., 2002; 29: 435-448
[Abstract]  
[51] Purvis J.E., Yomano L.P., Ingram L.O.: Enhanced trehalose production improves growth of Escherichia coli under osmotic stress. Appl. Environ. Microbiol., 2005; 71: 3761-3769
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[52] Roberts M.F.: Osmoadaptation and osmoregulation in Archaea: update 2004, Frontiers in Bioscience 9, 1999-2019, September 1, 2004 (09.11.2011)
http://www.bioscience.org/2004/v9/af/1366/fulltext.asp?bframe=tables.htm&doi=yes
[53] Romantsov T., Guan Z., Wood J.M.: Cardiolipin and the osmotic stress responses of bacteria. Biochim. Biophys. Acta, 2009; 1788: 2092-2100
[PubMed]  
[54] Rontein D., Basset G., Hanson A.D.: Metabolic engineering of osmoprotectant accumulation in plants. Metab. Eng., 2002; 4: 49-56
[PubMed]  
[55] Ruffert S., Lambert C., Peter H., Wendisch V.F., Krämer R.: Efflux of compatible solutes in Corynebacterium glutamicum mediated by osmoregulated channel activity. Eur. J. Biochem., 1997; 247: 572-580
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[56] Sawangwan T., Goedl C., Nidetzky B.: Glucosylglycerol and glucosylglycerate as enzyme stabilizers. Biotechnol. J., 2010; 5: 187-191
[PubMed]  
[57] Schwibbert K., Marin-Sanguino A., Bagyan I., Heidrich G., Lentzen G., Seitz H., Rampp M., Schuster S.C., Klenk H.P., Pfeiffer F., Oesterhelt D., Kunte H.J.: A blueprint of ectoine metabolism from the genome of the industrial producer Halomonas elongata DSM 2581T Environ. Microbiol., 2011; 13: 1973-1994
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[58] Shabala L.: Organic vs inorganic: What makes the major contribution to osmotic adjustment in bacteria? Commun. Integr. Biol., 2009; 2: 74-75
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[59] Shabala L., Bowman J., Brown J., Ross T., McMeekin T., Shabala S.: Ion transport and osmotic adjustment in Escherichia coli in response to ionic and non-ionic osmotic. Environ. Microbiol., 2009; 11: 137-148
[PubMed]  
[60] Sleator R.D., Hill C.: Bacterial osmoadaptation: the role of osmolytes in bacterial stress and virulence. FEMS Microbiol. Rev., 2002; 26: 49-71
[PubMed]  
[61] Strange K.: Cellular volume homeostasis. Adv. Physiol. Educ., 2004; 28: 155-159
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[62] Ueland P.M.: Choline and betaine in health and disease. J. Inherit. Metab. Dis., 2011; 34: 3-15
[PubMed]  
[63] Vargas C., Argandona M., Reina-Bueno M., Rodríguez-Moya J., Fernández-Aunión C., Nieto J.J.: Unravelling the adaptation responses to osmotic and temperature stress in Chromohalobacter salexigens, a bacterium with broad salinity tolerance. Saline Systems, 2008; 4: 14
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[64] Voet D., Voet J.G, Pratt C.W.: Fundamentals of Biochemistry. New York: Wiley, 2001
[65] Wood J.M.: Bacterial osmosensing transporters. Methods Enzymol., 2007; 428: 77-107
[PubMed]  
[66] Yeagle L.P.: Cell membrane features, 2009 (09.11.2011)
http://www.els.net/WileyCDA/ElsArticle/refId-a0001261.html
Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.