Postepy Hig Med Dosw. (online), 2011; 65: 542-551
Review
Full Text PDF  

Epigenetyka a etiologia chorób neurodegeneracyjnych
Epigenetics and etiology of neurodegenerative diseases
Beata M. Gruber
Zakład Biochemii i Biofarmaceutyków, Narodowy Instytut Leków w Warszawie
Adres do korespondencji
doc. dr hab. n. farm. Beata M. Gruber, Zakład Biochemii i Biofarmaceutyków, Narodowy Instytut Leków, ul. Chełmska 30/34, 00-725 Warszawa; e-mail: b-gruber@il.waw.pl

Otrzymano:  2011.05.24
Zaakceptowano:  2011.07.22
Opublikowano:  2011.08.19

Streszczenie
Kluczem do morfologicznego i funkcjonalnego zróżnicowania komórek w obrębie ludzkiego organizmu jest ustalanie specyficznych wzorców ekspresji genów. Genom ludzki zawiera oko­ło 25-30 tys. genów, przy czym w każdej komórce tylko część z nich ulega ekspresji. Za usta­lanie specyficznych wzorców ekspresji współodpowiedzialne są modyfikacje epigenetyczne. Obejmują one przede wszystkim: metylację DNA, modyfikacje histonów i struktury chromaty­ny, a także funkcje niekodującego RNA. Uważa się, że aktywne transkrypcyjnie geny wykazują hipometylację, podczas gdy transkrypcyjnie nieaktywne sekwencje są zazwyczaj zmetylowane. Kowalencyjne zmiany histonów i procesy metylacji DNA są zjawiskami współzależnymi, mo­gącymi się wzajemnie indukować. Modyfikacje białek chromatyny regulowane są przez swoiste enzymy, ale także przez kinazy białkowe, fosfatazy, enzymy związane z ubikwityną i białkiem SUMO i tzw. białka koaktywatorowe, jak CBP (CREB-binding protein). Ich działanie stanowi o tzw. „kodzie histonowym", który w połączeniu z białkami związanymi z chromatyną deter­minuje wzór ekspresji genowej w odpowiedzi na czynniki zewnętrzne. Istnieją przesłanki, uza­sadniające poszukiwanie związku zjawisk epigenetycznych z chorobami neurologicznymi: nie­zmienność w toku ewolucji struktur histonowych podatnych na zmiany epigenetyczne, wykryte korelacje zmian epigenetycznych z występowaniem syndromów chorobowych w układzie ner­wowym i stwierdzona skuteczność małocząsteczkowych modulatorów procesów epigenetycz­nych, np. inhibitorów deacetylaz histonowych, m.in. w nieuleczalnych, jak dotąd, schorzeniach neurologicznych, takich jak: choroba Huntingtona (HD), choroba Parkinsona (PD), czy choro­ba Alzheimera (AD). W pracy omówiono doniesienia literaturowe obejmujące charakterystykę wzorców ekspresji genów w odniesieniu do występowania wymienionych schorzeń neurodege­neracyjnych. Podkreśla się m.in. istotność zjawisk hipometylacji DNA i acetylacji białek histo­nowych oraz wskazuje na potencjalną przydatność terapeutyczną deacetylaz histonowych.
Słowa kluczowe: epigenetyka • choroby neurodegeneracyjne • modyfikacje histonów


Summary
Determination of specific gene profile expression is essential for morphological and functional differentiation of cells in the human organism. The human genome consists of 25-30 thousands genes but only some of them are expressed in each cell. Epigenetic modifications such as DNA methylation, histone and chromatin modifications or non-coding RNA functions are also respon­sible for the unique gene expression patterns. It is suggested that transcriptional gene activation is related to hypomethylation and the transcriptionally non-active sequences are hypermethylated. Covalent histone modifications and DNA methylation are correlated and interacting. Chromatin modeling is regulated not only by specific enzymes but also by protein kinases or phosphatases and coactivators, such as CBP. Such interaction makes the "histone code" which with the chro­matin proteins determines gene expression patterns as the response to external agents. Evidence of a major role for epigenetic modifications in neurological disease has come from three conver­ging lines of enquiry: high conservation throughout evolution of the histone residues that are the target for epigenetic modifications; association between mutations in epigenetic components and multisystem disease syndrome in the nervous system; and broad efficacy of small-molecule epi­genetic modulators, e.g. histone deacetylase inhibitors, in models of neurological diseases incu­rable up to now, such as Huntington's disease, (HD), Parkinson's disease (PD) and Alzheimer's disease (AD). This article is a survey of the literature concerning the characterization of gene expression patterns correlated with some neurodegenerative diseases. The processes of DNA hy­pomethylation and histone acetylation are emphasized. The histone deacetylases are indicated as the basis for design of potential drugs.
Key words: epigenetics • neurodegenerative disorders • histone modifications




Wstęp
Termin „epigenetyka" wywodzi się z greckiego przedrost­ka epi oznaczającego „ponad", „w dodatku do". Odnosi się w tym przypadku do procesów, które zachodzą z udziałem genów lub w ich obrębie, a wspomagane są mechanizma­mi opartymi na strukturze i właściwościach chromatyny.
Współczesna definicja epigenetyki to zespół zmian w funk­cjach poszczególnych genów - dziedziczony podczas mi­tozy, jak i mejozy, ale niewynikający ze zmian pierwszo­rzędowej struktury DNA.
Mechanizmy epigenetyczne są biochemicznymi modyfi­kacjami DNA i białek histonowych będących strukturalną podstawą chromatyny. Do regulacji epigenetycznej ostat­nio zalicza się także białka prionowe i udział interferen­cyjnego RNA [9,29].
Istnieją przesłanki, uzasadniające poszukiwanie związku zjawisk epigenetycznych z chorobami neurologicznymi. Po pierwsze, mamy do czynienia z niezmiennością w toku ewolucji struktur histonowych podatnych na zmiany epige­netyczne, co według Ratana [26] stanowi pośredni dowód znaczenia takich zmian. Po drugie, zanotowano wiele przy­kładów świadczących o korelacji zmian epigenetycznych i występowania syndromów chorobowych w układzie ner­wowym. Po trzecie, wykazano skuteczność małocząstecz­kowych modulatorów procesów epigenetycznych, takich jak inhibitory deacetylaz histonowych - HDACis (histo­ne deacetylase inhibitors) w wielu schorzeniach neurolo­gicznych, takich jak choroba Huntingtona (HD), choroba Parkinsona (PD), choroba Alzheimera (AD).
Epigenetyczna regulacja ekspresji genów
Kluczem do morfologicznego i funkcjonalnego zróżni­cowania komórek w obrębie ludzkiego organizmu jest ustalanie swoistych wzorców ekspresji genów. Genom ludzki zawiera około 25-30 tys. genów, przy czym w każdej komórce tylko część z nich ulega ekspresji. Za ustalanie takich wzorców ekspresji współodpowie­dzialne są modyfikacje epigenetyczne [25]. Obejmują one przede wszystkim: metylację DNA, modyfikacje hi­stonów i struktury chromatyny, a także funkcje nieko­dującego RNA [21,25].
Podstawowym następstwem zmian epigenetycznych jest występowanie różnych fenotypów tego samego genomu, opartych na zróżnicowanym statusie epigenetycznym [5].
Metylacja DNA
Metylacja DNA jest, jak się uważa, najtrwalszą z modyfi­kacji epigenetycznych [25]. Stanowi poreplikacyjną mo­dyfikację DNA i ma głównie na celu, choć nie zawsze, transkrypcyjne wyciszanie genów [9,12]. W warunkach prawidłowych metylacja jest wykorzystywana w komór­ce, m.in. do wyciszania licznych sekwencji powtórzonych, piętnowania rodzicielskiego i wyłączania drugiego chro­mosomu X w komórkach żeńskich. Służy też rozróżnianiu nici DNA w procesach naprawczych typu „mismatch" [25].
Metylacja reszt cytozynowych w DNA odgrywa ważną rolę w kontroli procesów decydujących o poziomie ekspresji genów w komórkach, uczestniczy w tworzeniu struktury chromatyny [12,25]. Wzór metylacji DNA ustalany jest we wczesnych fazach rozwoju zarodkowego i utrzymywany podczas życia osobniczego przez metylotransferazy DNA - DNMTs (DNA methyltransferases). Ustalony wzór me­tylacji DNA jest swoisty tkankowo, stabilny, odwracalny i stanowi cechę dziedziczną [11,12,25].
Metylacji w ludzkim DNA ulegać mogą wyłącznie reszty cytozyny w obrębie dinukleotydów 5'-CG-3' (CpG), przy czym metylacja jest zawsze symetryczna i obejmuje obie komplementarne nici.
Grupa metylowa pochodzi z S-adenozylometioniny [11,12,25].
Genom człowieka zawiera około 29 000 wysp CpG, tj. ob­szarów DNA (ok. 1 kb) o zwiększonej w porównaniu z ca­łym genomem zawartości CpG, zlokalizowanych w około 50-60% promotorów genów, tj. wszystkich genów me­tabolizmu podstawowego i około 40% genów swoistych tkankowo. Uważa się, że aktywne transkrypcyjnie geny wykazują hipometylację promotorów, podczas gdy trans­krypcyjnie nieaktywne sekwencje są zazwyczaj zmetylo­wane [12,33]. Dinukleotydy CpG znajdujące się poza wy­spami CpG są rozmieszczone przede wszystkim w obrębie sekwencji powtórzonych lub centromerów i to one zwy­kle ulegają metylacji - procesowi gwarantującemu stabil­ność chromosomalną, ochronę przed obcym DNA, czy po­wstrzymywanie translokacji [33].
Wygaszanie ekspresji genów związane jest z utrudnieniem przez grupy metylowe dostępu czynników transkrypcyjnych do rejonów promotorowych genów bądź ze stymulowaniem przyłączania białek efektorowych MBP (methyl binding pro­teins), MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, MeCP2 z domeną MBD, wiążącą zmetylowane DNA. Podobną funkcję peł­nią białka z rodziny Kaiso [11,25]. O sile wiązania białek MBD do określonych sekwencji DNA mogą decydować ilość i lokalne zagęszczenie dinukleotydowej sekwencji CpG [12]. Zahamowanie funkcji białek MBP znosi efekt wyciszający transkrypcję, wywołany metylacją CpG [25].
Hamowanie transkrypcji przez procesy metylacji DNA na­stępuje też w wyniku ich pośredniego wpływu na konden­sację chromatyny, a mianowicie poprzez interakcję białek MBP z białkami modyfikującymi kowalencyjnie histony i z kompleksami przebudowującymi oraz przez aktywację enzymów z grupy deacetylaz histonowych [12,25].
Metylacja DNA kontrolowana jest przez metylotransferazy DNA. W komórkach ssaków zidentyfikowano pięć genów kodujących te enzymy, tj.: DNMT1, DNMT2 (z powodu wykazanej ostatnio funkcji metylowania RNA, ten enzym powinien być raczej umiejscowiony wśród metylotransferaz RNA), DNMT3a, DNMT3b i DNMT3L. Zachowawczą mety­lotransferazą, odpowiedzialną za utrzymanie stanu metylacji podczas replikacji DNA jest DNMT1. DNMT3a i 3b uczest­niczą w ustaleniu wzoru metylacji de novo podczas wczesne­go rozwoju embrionalnego. DNMT3L nie ma aktywności enzymatycznej, ale działa jako czynnik stymulujący aktyw­ność enzymatyczną enzymów DNMT3a i 3b. Tworzone mię­dzy tymi dwoma enzymami kompleksy wykazują większą zdolność wiązania DNA i S-adenozylometioniny. DNMT3L jest też zaangażowana w remodelowanie chromatyny i de­acetylację histonów [11,12,13,27,33].
Wzór metylacji to konsekwencja nie tylko przyłączania grup metylowych do reszt cytozynowych, ale również efekt procesów demetylacji. Mogą być one zależne, jak i nieza­leżne od replikacji DNA. Demetylacja zależna od repli­kacji zwana jest demetylacją pasywną i występuje wów­czas, gdy DNMT1 nie metyluje nowo zsyntetyzowanego łańcucha DNA, co prowadzi do powstania niezmetylowa­nego DNA po drugim cyklu replikacyjnym. Demetylacja aktywna przebiega niezależnie od replikacji i zachodzi na drodze enzymatycznej [12].
Jak podają Guz i wsp. [12], w warunkach niewielkiego stę­żenia S-adenozylometioniny, enzymy DNMT3a i 3b mogą funkcjonować nie tylko jako metylotransferazy DNA, ale także jako deaminazy 5-metylocytozyny. Deaminacja 5-me­tylocytozyny do tyminy, a następnie wolna od błędów na­prawa (przywrócenie pary G: C) stanowią jeden z prawdo­podobnych mechanizmów demetylacji DNA u kręgowców.
Modyfikacje histonów
Histony stanowią białkową podstawę strukturalną chroma­tyny. Chromatyna składa się z nukleosomów, które zawie­rają łańcuchy DNA o długości 146-147 par zasad owinięte dookoła oktamerów histonów rdzeniowych stanowiących z kolei pary histonów H3, H4, H2A i H2B. Nukleosomy połączone są łącznikowym DNA nawiniętym na łączni­kowy histon H1. Histony rdzeniowe pełnią rolę nie tylko podstawy struktury nukleosomu. Ich N-końce, tzw. ogo­ny histonowe, wystające z nukleosomu są przeznaczone do interakcji z białkami.
W skład histonów wchodzą również warianty histonu H2A, takie jak: H2A.Z; H2A.v; H2A.Bbdb i H2A.Bdb [21,24,33].
W transkrypcyjnie aktywnej euchromatynie, gęstość nukle­osomów (jednostek strukturalnych) wynosi 6 jednostek/11 nm, w nieaktywnej heterochromatynie, 12-15 jednostek/11 nm. Promotorowe rejony genów są zwykle wolne od nu­kleosomów. Ich właściwe rozmieszczenie ma istotne zna­czenie dla ekspresji genów i zależy od efektu zmian epi­genetycznych. Nukleosomy wykazują preferencje wobec określonych sekwencji DNA [8,21,24,27,33].
Terminem „modyfikacja histonów" określa się zmiany w strukturze DNA i białek histonowych, obejmujące: re­modelowanie chromatyny rozumiane jako przemieszcza­nie się nukleosomów wzdłuż nici DNA, wymianę histonów rdzeniowych na wariant H2A.Z i modyfikacje kowalencyj­ne N-końców ogonów histonowych, tj.: acetylację, mety­lację, ubikwitynację, fosforylację, biotynylację, sumoila­cję i ADP-rybozylację [9,24,27,32].
O istotności modyfikacji chromatyny jako zmian epigene­tycznych determinujących fenotypy chorobowe świadczy tworzenie baz danych dotyczących wzajemnych zależno­ści genów, struktury chromatyny i występowania określo­nych chorób. Najpełniejszą, uwzględniającą wszystkie te powiązania wydaje się baza DAnCER (Disease-Annotated Chromatin Epigenetics Resource), dostępna na stronie http://wodaklab.org/dancer [32].
W niniejszej pracy skoncentrowano się na modyfikacjach kowalencyjnych histonów, wymienianych jako jedne z głów­nych zmian epigenetycznych mogących korelować z wystę­powaniem chorób neurologicznych. Biologiczne znaczenie powyższego rodzaju zmian zależy od rodzaju modyfikacji i ich umiejscowienia [25].
Posttranslacyjne kowalencyjne modyfikacje w N-końcach histonów odgrywają krytyczną rolę w regulacji transkryp­cji genów.
Modyfikacje białek chromatyny regulowane są przez swo­iste enzymy, tj. acetylotransferazy histonowe HATs (hi­stone acetyltransferases), HDACs, metylotransferazy hi­stonowe HMTs (histone methyltransferases) i demetylazy histonowe (histone demethylases), ale także przez kinazy białkowe, fosfatazy, enzymy związane z ubikwityną i biał­kiem SUMO i tzw. białka koaktywatorowe, takie jak CBP (CREB-binding protein), mające aktywność HAT [1,27]. Działanie powyższych enzymów stanowi o tzw. „kodzie histonowym", który w połączeniu z białkami związanymi z chromatyną determinuje wzór ekspresji genowej w od­powiedzi na czynniki zewnętrzne [9,11].
Zmodyfikowane histony grupują się w dwóch kompleksach białkowych, TrxG (trithorax group) i PcG (polycomb gro­up). Niektóre ze składowych tych kompleksów wykazują aktywność metylotransferaz histonowych - HMTs (histo­ne methyltransferases), podczas gdy inne odgrywają rolę w utrzymywaniu równowagi między heterochromatyną (białka związane z PcG) a euchromatyną (białka zwią­zane z TrxG). Białka te wiążą się do rejonów promotoro­wych PRE (PcG) i TRE (TrhG) genów, odpowiadających za metylację DNA, modyfikacje histonów, ATP-zależne mo­delowanie nukleosomów i procesy regulatorowe z udzia­łem RNA [11,21].
Metylacja histonów daje efekt dwojaki, związany zarów­no z wyciszeniem, jak i transkrypcyjną aktywacją genów [11]. Metylacja reszt lizynowych -4 i -36 zachodzi w wer­sjach mono-, di- i tri- w H3 i związana jest z tworzeniem aktywnej transkrypcyjnie euchromatyny [11]. Z wygasze­niem genów, a więc tworzeniem zamkniętej struktury he­terochromatyny wiąże się metylacja reszt lizynowych -9 i -27 w histonie H3, czy trimetylacja reszty lizynowej -20 w H4 [8,11,33]. Proces metylacji w wersjach mono- i di­metylowych pochodnych może dotyczyć także argininy, ale wpływ tych zjawisk na strukturę chromatyny nie jest dobrze znany [11].
Z aktywacją transkrypcyjną wiąże się fosforylacja, przy­puszczalnie dzięki odpychaniu się ujemnego ładunku fos­fohistonów i DNA. Takie oddziaływanie dekondensuje chromatynę i ułatwia dostęp czynników transkrypcyjnych do rejonów promotorowych genów [9,11].
Ubikwitynacja, poza rozluźnianiem struktury chromaty­ny i ułatwianiem transkrypcji, stanowi też warunek na­stępującej po niej metylacji. Dokładna funkcja tych mo­dyfikacji nie jest bliżej poznana, podobnie, jak najsłabiej poznanego procesu modyfikacji posttranskrypcyjnych - sumoilacji [9,11].
Z aktywacją transkrypcyjną związany jest proces acetylacji. Polega na neutralizującym dodatni ładunek acetylowaniu reszt lizynowych, przez co osłabieniu ulega powinowactwo białka histonowego i DNA i rozluźnia się struktura chro­matyny. Acetylacja histonów jest procesem odwracalnym, a enzymami katalizującymi proces odwrotny są HDACs. Usuwają one grupy acetylowe z reszt lizynowo-arginino­wych w N-końcach ogonów histonowych. Spośród 11 róż­nych izoform HDACs, większość wykazuje ekspresję na poziomie białka w komórkach OUN. Odrębną kategorię tych enzymów stanowi rodzina sirtuin - SIRT.
Domeną wspólną dla większości HDACs jest domena cyn­kozależna. Domeny różniące izoformy wykazują swoistość substratową i w sposobie regulacji [1]. Deacetylazy histono­we u ssaków stanowią klasy 1-4, przy czym w komórkach układu nerwowego dominują klasy 1 i 2. Klasa 1 obejmuje HDACs 1, 2, 3 i 8 - białka jądrowe występujące powszech­nie w organizmie; klasa 2 obejmuje HDACs: 4, 5, 6, 7, 9 i 10 - białka wykazujące swoistość tkankową, regulowane w wyniku przemieszczania się jądrowo-cytoplazmatycz­nego z udziałem białek 14-3-3 [1,30]. Klasę 3 HDACs sta­nowią sirtuiny, niepoddające się inhibitorom hamującym HDACs z klas 1 i 2, podobnie, jak HDAC11 - jedyna re­prezentantka klasy 4 [30].
Należy podkreślić, że procesy zachodzące w ramach zmian epigenetycznych nie są efektywne jako procesy pojedyncze. Białka MBP przyłączone do metylowanego DNA tworzą kompleksy z enzymami HDACs i ten etap dopiero prowa­dzi do zagęszczenia struktury chromatyny i transkrypcyj­nego wyciszania genów [13]. Białka modyfikujące histony, takie jak HP1 (heterochromatin protein 1), LSD1 (lysine­-specific demethylase 1), czy PRMT1 (protein arginine me­thyltransferase 1) indukują enzymy DNMTs prowadząc do metylacji DNA [13].
Kowalencyjne zmiany histonów i procesy metylacji DNA są zjawiskami współzależnymi, mogącymi się wzajemnie indukować. Wcześniejszy pogląd, że metylacja DNA jest pierwotna względem modyfikacji histonów w ostatnich la­tach zweryfikowano. Okazało się, że zmiany w białkach histonowych zachodzą przed metylacją DNA, jednocze­śnie warunkując ten proces.
Czynnikiem regulującym tworzenie zamkniętej struktu­ry chromatyny może być sam brak lub niewielka ekspre­sja danego genu [25].
Rola niekodującego RNA
Stosunek rejonów niekodujących do kodujących w geno­mie Eucaryota zmienia się jako funkcja postępów w roz­woju ewolucyjnym, przy czym liczba genów kodujących jest stosunkowo stabilna [21]. Co więcej, ostatnie badania wykazały, że rejony niekodujące są aktywnie transkrybo­wane z obu nici DNA. Powstałe transkrypty stanowią o ist­nieniu regulatorowych cząsteczek niekodującego RNA - ncRNA (non-coding RNA) [5,21].
Przyjmuje się, że ncRNA odgrywa rolę, m.in. w: różnico­waniu komórek macierzystych układu krwiotwórczego, embriogenezie, apoptozie, regulacji metabolizmu kseno­biotyków, odporności, stanach zapalnych, infekcjach wi­rusowych i bakteryjnych oraz chorobach neurologicznych [15]. NcRNA, do którego zalicza się, m.in.: mikroRNA (miRNA), tRNA, rRNA i krótkie nukleolarne RNA - snoR­NA (small nucleolar RNA) oddziałują rozpoznając specy­ficzne miejsca bądź sekwencje w DNA, RNA, kompleksach DNA: RNA, a także poprzez interakcje, m.in. z białkami wiążącymi RNA - RBP (RNA-binding proteins) [5,21].
Niektóre z enzymów remodelujących chromatynę mają powinowactwo nie do DNA, ale do RNA dzięki posiada­niu określonych specyficznych domen w swojej struktu­rze [5,21]. Część ncRNA aktywuje geny białek regulatoro­wych wpływających na strukturę chromatyny, np. HP1 [21].
Wiele typów ncRNA występuje preferencyjnie w obrębie komórek układu nerwowego u ssaków. Liczne podklasy miRNA wykryto w neuronach kory nowej i móżdżku. Jak podaje Mehler [21], utrata DICER - kompleksu enzyma­tycznego zaangażowanego w proces dojrzewania miRNA z prekursorów, w mysich neuronach części czołowej mó­zgu skutkowała, m.in. zaburzeniami morfogenezy w korze i podwzgórzu, zmianami w sposobie rozgałęzienia den­drytów, czy wzmożoną apoptozą rozwijających się neu­roblastów. SnoRNA ma natomiast zróżnicowane profile ekspresji w obszarach mózgu związanych z uczeniem się i zapamiętywaniem. Zaś mutacje wyspecjalizowanych pod­klas ncRNA, tj. rRNA i tRNA korelują z patogenezą scho­rzeń neurorozwojowych, neurodegeneracyjnych i neurop­sychiatrycznych [21].
W świetle powyższych doniesień pojawiły się sugestie, że ncRNA może być zaangażowane w szlaki sygnałowe i procesy leżące u podłoża chorób neurologicznych i psy­chiatrycznych [21].
MiRNA stanowi krótkoodcinkowe RNA (21-23 nukleoty­dów). Zidentyfikowano, jak dotąd, jego 700 rodzajów, a po­dejrzewa się istnienie ponad 1000. Prawdopodobnie około 30% wszystkich ludzkich genów jest regulowanych przez miRNA [11,15,21,23]. Geny miRNA mają różne umiejsco­wienie, mieszczą się w intronach i/lub w eksonach genów strukturalnych lub w obszarach międzygenowych. Mogą wy­stępować pojedynczo lub tworzą skupiska, mające wspól­ne sekwencje regulatorowe [15]. MiRNA oddziałuje po­przez hamowanie posttranskrypcyjne na etapie mRNA lub na etapie translacji. W każdym z tych przypadków wystę­puje inny sposób wiązania regulatorowej cząsteczki do mRNA, a następnie jego degradacja lub unieczynnienie [15]. MiRNA jest związany nie tylko z wyciszaniem ge­nów. W określonych warunkach może wzmagać transla­cję docelowego mRNA [23]. W jego funkcję wpisana jest też modyfikacja struktury chromatyny poprzez bezpośred­ni wpływ na enzymy modyfikujące tę strukturę. Na liście genów, na których transkrypcję wpływa miRNA znajdują się te, kodujące: HMTs, MeCP2, HDACs i białka z chro­modomenami - wiążące zmetylowane reszty lizyny i ar­gininy [11,25].
Podkreśla się także rolę miRNA jako regulatora DNMT. Jak wykazano na przykładzie niedrobnokomórkowego raka płuc, zależność ekspresji miRNA i DNMT była odwrot­na. Stwierdzono też komplementarność między miRNA­-29s a określonymi sekwencjami w mRNA niektórych ro­dzajów DNMT [11].
Epigenetyczne podłoże chorób neurodegeneracyjnych
Choroba Alzheimera
Choroba Alzheimera (AD) należy do kręgu schorzeń otę­piennych i jest uważana za bardzo rozpowszechnioną wśród ludzi w podeszłym wieku. Stanowi ponad 50% wszystkich przypadków otępienia, charakteryzujących się zaburzenia­mi w sferze czynności poznawczych, zwłaszcza zaś postę­pującym zanikiem pamięci, traceniem zdolności do abs­trakcyjnego myślenia, do wykonywania w sposób logicznie uporządkowany złożonych, a potem, w miarę postępu cho­roby, nawet prostych zadań. W miarę upływu czasu poja­wiają się różne zaburzenia zachowania i objawy związane przede wszystkim z upośledzeniem pamięci [10].
Typowe dla AD zmiany w mózgowiu polegają na powsta­waniu blaszek starczych z b-amyloidu oraz zwyrodnienia włókienkowego, w którym główną rolę odgrywa zmienione białko tau. Wzdłuż naczyń mózgowych odkładają się złogi b-amyloidu. Stwierdza się, szczególnie nasilone w korze mózgowej, zmniejszenie liczby neuronów i synaps [10].
Istnieje kilka hipotez próbujących wyjaśnić patogenezę tej choroby, m.in. deficyt neuroprzekaźników, zaburze­nia przemian energetycznych, stres oksydacyjny i zmia­ny w sygnalizacji mitotycznej oraz kaskada amyloidowa związana z udziałem β-amyloidu. β-amyloid pochodzi z proteolitycznego rozszczepienia prekursora APP (amy­loid precursor protein) przez kompleks γ-sekretazy. APP kodowany jest przez geny PSEN1 i PSEN2 (presenilina 1; 2) [9,33]. Białko to, poza tym że tworzy neurotoksyczne agregaty składające się z 39-40 aminokwasów, kumulują­ce się w blaszkach starczych, przyczynia się bezpośrednio do formowania nadtlenków, aktywuje też komórki generu­jące przemiany tlenku azotu w rodniki nadtlenoazotynowe. Z AD wiąże się także występowanie określonych izoform apolipoproteiny E (APOE), białka będącego składnikiem chylomikronów i lipoprotein o bardzo niskiej gęstości - VLDL (very low density lipoproteins), zaangażowanego w transport cholesterolu [10]. Uważa się, że jedna z izo­form APOE - APOE-ε4 stymuluje odkładanie β-amyloidu i formowanie blaszek [22]. Jak podaje Gruber [10], u cho­rych z AD obserwuje się podwyższone stężenie APOE w osoczu, a także mRNA dla tego genu w mózgu chorych. Pojawienie się kopii izoform APOE-ε3 i APOE-ε4 korelo­wało z większą koncentracją β-amyloidu. Co ciekawe, ko­pia APOE-ε2 wiązała się z obniżeniem ryzyka AD [10,22].
Interesująca jest obserwacja, że powyższe korelacje między APOE-ε4 a AD, zależne od płci, a także uwarunkowane et­nicznie, wraz z wiekiem stawały się mniej znaczące [22].
Przez ostatnie 20 lat przebadano ponad 300 genów jako po­tencjalnych determinantów późnoobjawowej, sporadycznej postaci AD, stanowiącej 90-95% wszystkich przypadków AD. Jednak, z wyjątkiem genu APOE, żaden nie został po­twierdzony jako marker AD, powtarzający się w toku ba­dań niezależnych populacji [22]. Potwierdzono jedynie, że z późnoobjawową, sporadyczną postacią AD związane są geny mieszczące się w obrębie chromosomów 9, 10 i 12.
Za rodzinną, wczesnoobjawową postać choroby odpo­wiada rzadko występujący zespół penetrujących mutacji w trzech genach: APP, PSEN1 i PSEN2. Jak podają Migliore i Coppede [22], według ostatnich badań nadekspresja APP okazuje się wystarczająca do wystąpienia AD. Warunkują ją trzy mutacje punktowe usytuowane blisko miejsca roz­szczepienia APP przez sekretazę, zaburzające proces pro­teolizy prekursora. Poza tymi mutacjami stwierdzono też istnienie kopii APP będącej przyczyną nadekspresji APP na poziomie białka.
W przypadku PSEN1 i PSEN2 zanotowano, jak dotąd, po­nad 160 mutacji, w tym ponad 150 mutacji w genie PSEN1. W badaniach podkreśla się też polimorfizm występujący w rejonach niekodujących PSEN1 [22].
Związane z fenotypem AD mutacje w genie PSEN1 prowadzą do utrzymującej się aktywności HAT białka koaktywatorowego - CBP. Z kolei hipometylacja rejonu promotorowego tego genu wzmaga aktywność enzymatycz­ną białka PSEN1 i wytwarzanie β-amyloidu [9]. Jak wy­kazano w badaniach in vitro, proces hipometylacji może być częściowo odwrócony przez S-adenozylometioninę - źródło grup metylowych, co wskazuje na możliwości ukie­runkowania terapii AD w przyszłości [9].
Notowane tendencje do hipometylacji w genomie chorych obciążonych AD potwierdzają rezultaty prospektywnych, obserwacyjnych badań przeprowadzonych przez Roe i wsp. [31]. Prowadzący badania stwierdzili istnienie odwrotnej zależności między tempem rozwoju AD i chorób nowotwo­rowych. U pacjentów z AD obserwowano znacznie wolniej­szy rozwój nowotworów, bez rozróżnienia na ich rodzaje. Nie tak znaczącą, ale dającą się zauważyć prawidłowość zanotowano u chorych obarczonych nowotworami w odnie­sieniu do tempa postępu AD. Ma to przypuszczalny zwią­zek z profilami metylacji genów. Hipometylacja odbloko­wuje transkrypcję genów supresorowych nowotworów, zaś hipermetylacja, wzmożona w przypadku chorób nowotwo­rowych, prawdopodobnie obejmuje też geny kodujące en­zymy generujące b-amyloid, unieczynniając je i przyczy­niając się w ten sposób do spowolnienia postępu AD [31].
Wyniki badań, cytowane przez Migliore i Coppede [22], a dotyczące zależności profilu metylacji w genach APP, PSEN1 i BACE (β-site amyloid precursor protein cle­aring enzyme) - genie, kodującym β-sekretazę odpowie­dzialną razem z γ-sekretazą za rozpad APP i generowanie neurotoksycznego β-amyloidu a szlakiem metabolicznym S-adenozylometioniny potwierdzają, że procesy metyla­cji są istotną częścią zmian epigenetycznych związanych z występowaniem AD. Okazuje się bowiem, że niedobór folianów i cyjanokobalaminy - związków biorących udział w remetylacji S-adenozylometioniny, w pożywce hodowla­nej ludzkich komórek neuroblastomy SK-N-SH i SK-N-BE zmienia profil metylacji promotora genu PSEN1 i zaburza wydzielanie białek PSEN1, BACE i APP. Niedawno wy­kazano też jednoczesną kumulację homocysteiny w tych komórkach, pozostającą w odwrotnej zależności z pozio­mem S-adenozylometioniny [10,22].
Rozpad APP generuje nie tylko β-amyloid, ale także pep­tyd C-końcowy APP - AICD [9,33]. AICD przemieszcza się do jądra i oddziałuje na swoiste geny, takie jak gen ne­prilizyny - NEP, kodujący enzym degradujący β-amylo­id. Jak podaje Urdinguio i wsp. [33], wykazano, że w ludz­kich komórkach neuroblastomy NB7 i SH-SY5Y ekspresja tego genu regulowana jest przez procesy acetylacji histo­nowej, co potwierdzono też na przykładzie szczurzych ko­mórek guza chromochłonnego - PC12. Podwyższone stę­żenie białka AICD nasila acetylację reszt lizynowych: -14 w H3 i -5 w H4. Współdziałanie AICD z Fe65 - białkiem wiążącym prekursora β-amyloidu A4 i indukcja HAT-Tip60 są warunkami wywierania wpływu AICD na chro­matynę. Acetylacja H4 przez HAT-Tip60 jest niezbędna do prawidłowej naprawy powstałych w przebiegu AD uszko­dzeń DNA [22,33].
W schorzeniach związanych z zaburzeniami pamięci, np. AD, podkreśla się znaczenie HDAC2. Niedobór tego enzy­mu koreluje ze wzrostem liczby synaps i poprawą pamię­ci. W AD zwrócono też uwagę na istotność epigenetycznej regulacji dwóch innych genów, tj. S100A2, kodującego biał­ko wiążące wapń i SORBS3, kodującego białko adhezyj­ne z domeną SH3. W obu przypadkach zanotowano różne profile metylacji DNA w AD w porównaniu z próbą kon­trolną. Wiadomo, że S100B - białko należące, podobnie jak S100A2 do rodziny S100 jest czynnikiem neurotroficz­nym i zapewniającym przeżycie neuronów. SORBS3 wy­kryto w synapsach. Funkcje obu białek w AD nie zosta­ły dokładnie poznane, ale powyższe rezultaty skłaniają do dalszych badań [33].
Szansą na „terapię przyszłości" w AD jest miRNA. Okazuje się, że poziom miRNA-107 uzależnia ekspresję BACE1. W strukturze tego genu wykryto 5 różnych miejsc w rejo­nie niekodującym mRNA, komplementarnych z miRNA i stwierdzono odwrotną zależność poziomów ekspresji BACE1 i miRNA-107 [35].
To, że w etiologii AD odnotowuje się niebagatelną rolę procesów acetylacji w zakresie regulacji ekspresji genów związanych z chorobą, umożliwia poszukiwanie rozwią­zań terapeutycznych wśród enzymów bezpośrednio wpły­wających na ten proces, tj. HDACs.
Inhibitory HDAC (HDACis) można sklasyfikować jako cztery chemiczne rodziny, tj.: krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe, kwasy hydroksamowe, benzamidy i epoksy­ketony [1].
W badaniach na modelach komórkowych wykazano obni­żenie poziomu białka CBP/p300 o aktywności HAT i stop­nia acetylacji histonów, przy jednoczesnej aktywacji proce­sów generujących APP. Jak wykazano, kwas walproinowy - HDACi należący do grupy krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych obniżał wytwarzanie β-amyloidu w ludzkich komórkach embrionalnych nerki - HEK293 i w komór­kach OUN myszy modelowych z AD [4]. W innych ba­daniach, codzienne wstrzykiwanie myszom modelowym z AD - Tg2576 HDACi - fenylomaślanu znosiło ubytki pamięci dzięki hiperfosforylacji białka tau w podwzgó­rzu, bez wpływu na poziom β-amyloidu. Fenylomaślan drastycznie obniżał też acetylację H4 w korze i stymulo­wał ekspresję czynników transkrypcyjnych, co sugeruje, że u podłoża mechanizmów neuroprotekcyjnych leży nor­malizacja dysfunkcji w procesach transkrypcji [4]. U my­szy transgenicznych APP23, wstrzykiwanie fenylomaśla­nu w dawce 30 mg/kg i.p./dz. redukowało ilość blaszek β-amyloidowych, a także poprawiało pamięć, pod warun­kiem rozpoczęcia podawania HDACi stosunkowo wcze­śnie (w siódmym miesiącu życia myszy). Poprawę pamię­ci i obniżenie stężenia białka tau bez wpływu na blaszki amyloidowe zanotowano też po zastosowaniu nikotynami­du - inhibitora klasy 3 HDAC [4].
Paradoksalnie, w rzadkich przypadkach, neuroprotekcyj­ny efekt w AD wykazują izoformy HDAC, np. HDAC1, czy sirtuina - SIRT1 [16]. Jak wykazali Kim i wsp. [16], u myszy transgenicznych p25 stanowiących model zmian neurodegeneracyjnych występował podwyższony poziom mRNA genu SIRT1, co sugeruje indukcję czynników od­powiedzialnych za transkrypcję tego genu. Autorzy pod­kreślają, że wyniki te mogą stanowić przesłankę do po­szukiwania możliwości interwencji w aktywację SIRT1. Na możliwy związek SIRT1 z AD wskazuje też to, że gen ten znajduje się na chromosomie 10, na którym występu­ją geny związane z rodzinną postacią AD.
Choroba Parkinsona
Choroba Parkinsona (PD) jest postępującym neurologicz­nym schorzeniem charakteryzującym się występowaniem licznych ruchowych i pozaruchowych zaburzeń, takich jak zaburzenia węchu, neuropsychiatryczne oraz układu autono­micznego. Badania neuropatologiczne dotyczące zaburzeń tego układu u osób z PD wykazały występowanie a-synu­kleiny - białka o aktywności chaperonowej, regulujące­go uwalnianie neuroprzekaźników w synapsach w jądrze grzbietowym nerwu błędnego, ciał Lewy'ego w ośrodkach autonomicznych w podwzgórzu, jądrze miejsca sinawego, jądrze szwu, korze limbicznej oraz w zwojach współczul­nych i w trzewnych splotach śródściennych przewodu po­karmowego [7,10]. PD jest chorobą zwyrodnieniową struk­tur mózgu, zwłaszcza jąder podkorowych, czyli istoty szarej leżącej w głębi półkul mózgu. Dochodzi w niej do zaniku komórek dopaminergicznych istoty czarnej, który prowa­dzi do niedoboru dopaminy oraz przewagi układu choli­nergicznego. Skutkiem powstających zmian są zaburze­nia układu ruchu [19]. Główne zaburzenia autonomiczne w PD obejmują: zaburzenia układu sercowo-naczyniowe­go, przewodu pokarmowego, układu moczowo-płciowego, odżywiania, nadmiernego wydzielania łoju i termoregula­cji [7]. Z PD wiążą się zmiany w obrębie chromosomu 17 i w strukturze białka tau, co charakteryzuje także AD [6].
Ponad 90% przypadków PD to postać sporadyczna. Jednak podstawę większości badań dotyczących etiologii choroby stanowi postać rodzinna. W oparciu o te badania wymie­niono 8 genów, w których mutacje związane są z pojawie­niem się PD. Zalicza się do nich geny kodujące: α-synukle­inę - SNCA; białka zaangażowane w ubikwitynację i procesy z udziałem proteosomu (PARK 2 (parkin), UCH-L1 (ubiqu­itin carboxyterminal hydrolase L1)), białka mitochondrialne związane z ochroną komórek, m.in. przed stresem oksyda­cyjnym (PINK-1 (PTEN-induced putative kinase 1) i DJ-1), białko dardarynę, zawierające domenę kinazy tyrozynowej (LRKK2 (leucine-rich repeat serine/threonine-protein kina­se 2)), lizosomalną ATP-azę (ATP13A2), czy proteazę sery­nową - OMI/HTRA2, zaangażowaną w procesy apoptozy, a także geny kodujące białka uczestniczące w synaptycznym transporcie i wydzielaniu neuroprzekaźników, takich jak sy­naptobrewina [6,22,33]. W tym miejscu należy przybliżyć rolę a-synukleiny, tworzącej fibrylarne agregaty zwane ciał­kami Lewy'ego, kumulujące się w miejscach ubytków neu­ronów, co stanowi jeden z głównych markerów PD [22,33]. Jak wykazano, polimorfizm występujący w obrębie promo­tora genu SNCA wiąże się ze zwiększonym ryzykiem za­chorowania na PD. W rodzinnej postaci choroby notowano też występowanie dodatkowych kopii genu i substytucje [22].
W PD α-synukleina przemieszcza się do jądra i może się wiązać z histonami hamując procesy acetylacji w H3 po­przez stymulujący wpływ na deacetylazę SIRT2, ale także inaktywując aktywność HAT białek: CBP, p300 i p/CAF (CBP associated factor) i powodując hipoacetylację i apop­tozę ludzkich komórek neuroblastomy [4,18]. Dowodem na tego typu interakcje są wyniki badań, które potwierdziły efekt ochrony przed toksycznym działaniem a-synukleiny w komórkach, do których wprowadzono siRNA dla SIRT2.
Toksyczność α-synukleiny obniżały też HDACis, takie jak vorinostat, co wykazano in vivo i in vitro. Wyniki tych badań wskazują kierunek terapeutyczny i potwierdzają koniecz­ność dalszych badań na zwierzęcych modelach PD [1,18,33].
Omawiając molekularne podłoże PD podkreśla się też rolę czynnika wzrostu fibroblastów - FGF20 (fibroblast growth factor 20). FGF20 należy do rodziny czynników wzrostu fibroblastów, które swoje funkcje biologiczne wykazują poprzez cztery rodzaje receptorów, FGFR1-4. FGF20 przez wiązanie do FGFR1 stymuluje różnicowa­nie komórek nerwowych w komórki wykazujące ekspre­sję hydroksylazy tyrozynowej i wpływa dodatnio na prze­życie neuronów dopaminergicznych [34]. Jak wykazano, FGF20 wraz z FG2 - należącym także do rodziny FGF, wzmagał ekspresję α-synukleiny w szczurzych neuronach dopaminergicznych śródmózgowia [34]. Jak sugerują au­torzy, FGF20 we wczesnych okresie życia zapewnia pro­liferację, różnicowanie i ochronę przed stresem neuronów dopaminergicznych śródmózgowia, jednak w późniejszych etapach, chronicznie podwyższony poziom tego czynnika może pośrednio odpowiadać za śmierć komórek nerwo­wych i zwiększone ryzyko PD. Potwierdzają tę sugestię badania, w których stwierdzono mutacje w rejonie nieko­dującym w genie FGF20, powodujące zaburzenia struk­tury miejsca wiązania miRNA-433, wzmożoną translo­kację FGF20 i zwiększoną ekspresję α-synukleiny [21].
Oddziaływanie synukleiny z histonami nie jest jedynym zja­wiskiem epigenetycznym charakteryzującym PD. Obniżenie stężenia dopaminy, obserwowane w tej chorobie, związane jest ze spadkiem stężenia trimetylowej pochodnej lizyny -4 w H3. Przewlekła terapia lewodopą prowadzi do deacetylacji lizynowych reszt: -5, -6, -12 i -16. MPTP (1-metyl-4-fenyl­-1,2,3,6-tetrahydropirydyna) - związek wywołujący objawy zbliżone do występujących w PD indukuje acetylację w H3 hamowaną przez lewodopę. Powyższe dane potwierdzają na­ruszenie szlaków epigenetycznych w PD, jednak bezpośred­nie implikacje poszczególnych procesów nie są, jak dotąd, pewne [33]. Wiadomo, że przynajmniej w części, uszkodze­nia w istocie czarnej mogą być konsekwencją hipometylacji w genie TNFα. Hipometylacja prowadzi do nadekspresji biał­ka TNF-α i w konsekwencji do wzmożonej apoptozy neuro­nów. Wysoki poziom TNF-α zanotowano w płynie mózgo­wo-rdzeniowym chorych obciążonych PD [33].
Znaczenie acetylacji histonów w etiopatogenezie PD potwier­dzają badania z zastosowaniem HDACi. Jak podają Chuang i wsp. [4], podawanie myszom modelowym HDACi - fenylo­maślanu znacząco znosiło skutki ubytku dopaminy i zanika­nia neuronów w substancji czarnej, wykazujących ekspresję hydrolazy tyrozynowej, odpowiedzialnej za biosyntezę dopa­miny. Inni autorzy wykazali, że śmierci neuronów dopaminergicznych zapobiegało podawanie także innych HDACi, w tym kwasu walproinowego. Stosowane HDACi indukowa­ły przy tym GDNF - neurotroficzny czynnik komórek glejo­wych (glial-cell line-derived neurotrophic factor) w astrocy­tach śródmózgowia, co wskazuje na możliwość wykorzystania także GDNF w terapii chorób neurodegeneracyjnych [4].
Choroba Huntingtona (HD)
Choroba Huntingtona jest dziedzicznym schorzeniem neuro­degeneracyjnym, przekazywanym z pokolenia na pokolenie w sposób autosomalny, dominujący, spowodowanym mu­tacją genową w chromosomie 4. Głównie dotyka neurony kory mózgowej i prążkowia [4,10,33].
Rozpowszechnienie choroby w populacji ogólnej wynosi 10/100 000. Defekt polega na patologicznym zwiększeniu liczby powtórzeń trójek CAG w genie kodującym białko huntingtynę (HTT). Zwiększenie liczby powtórzeń trójek CAG, umiejscowionych w eksonie 1 zmienia konformację HTT. W wyniku tego dochodzi do nagromadzenia niepra­widłowego białka w komórce, co implikuje zaburzenie pro­cesów komórkowych i w efekcie śmierć komórki [4,10,33]. Mimo iż choroba jest dziedziczna, objawy nie pojawiają się zwykle od urodzenia, lecz najczęściej między 30 a 50 rokiem życia. Tylko w około 3% wszystkich przypadków początek choroby przypada na okres dzieciństwa [10].
W badaniu analizującym objawy kliniczne u 1901 chorych, do najczęstszych objawów należały: pląsawica, zaburze­nia chodu, niestabilność postawy, drażliwość, depresja, niezgrabność ruchów, zaburzenia mowy, utrata pamięci, wypadanie przedmiotów z rąk, utrata motywacji i napędu, zespół urojeniowy, regresja intelektualna, zaburzenia snu, halucynacje, utrata masy i zaburzenia seksualne. Często, przed pojawieniem się objawów ruchowych występują ob­jawy psychiatryczne. Wydają się całkowicie niezależne od objawów ruchowych, a ich progresja może być odmienna niż postęp innych objawów choroby [10].
Zaburzenia emocjonalne, drażliwość, labilność, zacho­wania agresywne, aspołeczność, nadużywanie alkoholu, apatia oraz pogorszenie zdolności poznawczych w HD, związane są z uszkodzeniem głowy jądra ogoniastego i ją­dra soczewkowatego oraz funkcji pętli czołowo-podstaw­nych. Powyższe objawy wynikają, jak się przypuszcza, ze zmniejszenia stężenia acetylocholiny i liczby neuronów GABA-ergicznych w jądrach podstawy [10].
Borovecki i wsp. [2] stwierdzili istotne zmiany w poziomie mRNA 12 genów w próbkach krwi pobranej od pacjentów znajdujących się w różnych stadiach HD. Białka kodowa­ne przez te geny należały do różnych grup funkcjonalnych, m.in. procesów transkrypcji i przemian RNA (koaktywator TAF7, czynnik uczestniczący w splicingu - SF3B1, biał­ka z domenami palca cynkowego), szlaków z udziałem ubikwityny i proteasomu (proteaza ubikwitynoswoista - USP15), transportu pęcherzykowego (proteoglikan 1). Profil ekspresji tych genów u pacjentów we wczesnym stadium przedobjawowym choroby był zbliżony do profilu u osób zdrowych. Profil w późnym stadium przedobjawowym był zbieżny z wyznaczonym u chorych w rozwiniętym, obja­wowym stadium HD. Autorzy wykazali jednocześnie, że podwyższone poziomy mRNA ulegały redukcji pod wpły­wem fenylomaślanu sodu - HDACi, podawanego pacjen­tom przez 4 tygodnie, co wskazuje na znaczenie procesów acetylacji histonów w przebiegu HD i zasadność uwzględ­nienia HDACi w projektowaniu potencjalnych terapii HD. Ekspresja genów należących do powyższych grup, a także związanych z cyklem komórkowym, kanałami jonowymi, apoptozą, chaperonami, czy gospodarką wapniową różniła szczurze komórki modelowe prążkowia -ST14A i komórki szczepu dzikiego [28]. Autorzy w swoich badaniach wy­mieniają jako różnicującą, także ekspresję genów związa­nych z metabolizmem cholesterolu i kwasów tłuszczowych.
Zmutowana HTT wiąże i blokuje domenę HAT w koak­tywatorach CBP i CAF, co w efekcie prowadzi do deregu­lacji transkrypcji [4,9,33]. Oddziaływanie HTT na CBP może polegać też na stymulowaniu tworzenia agregatów tego białka. Efekt ten niektórzy autorzy traktują jako po­średnio wpływający na modyfikację histonów [3]. W my­sich modelach HD wykazano wpływ HDACi na łagodzenie zaburzeń motorycznych i atrofii neuronów, przy jedno­czesnym wzmożeniu procesów acetylacji histonów i ob­niżonej ich metylacji. Zmieniona HTT powodowała hi­poacetylację H3 i H4 u modelowych myszy R6/2 i 82Q. Trimetylację w H3 wykryto nie tylko u myszy 82Q, ale także u chorych obciążonych HD [33]. Powyższe oddzia­ływanie HTT w sposób przeciwstawny w kontekście za­leżności struktury chromatyny i możliwości zachodzenia procesów transkrypcyjnych (hipoacetylacja i hipermetyla­cja) wskazuje na znaczenie nieprawidłowej HTT dla pro­cesów utrzymujących równowagę między aktywną trans­krypcyjnie a represorową chromatyną [33].
Znaczenie procesów acetylacji histonów w etiopatogene­zie HD potwierdzały już badania Hockly i wsp. w 2005 roku. W badaniach przedklinicznych na modelu mysim HD - R6/2, vorinostat po podaniu doustnym wzmagał procesy acetylacji histonów w mózgach myszy. Objawowo znaczą­co wygaszał zaburzenia motoryczne. Jak podają Chuang i wsp. [4], wzrost przeżywalności u myszy R6/2 i ograni­czenie procesów neurodegeneracyjnych zanotowano też w przypadku zastosowania HDACi - maślanu sodu.
Problemem w wykorzystaniu wymienionych HDACis, sto­sowanych w opisywanych eksperymentach jest ich tok­syczność. Stąd poszukuje się HDACis o selektywnym działaniu. Przykładem takiego inhibitora jest HDACi 4b skierowany wybiórczo przeciw HDAC3. Niewątpliwą jego zaletą, poza selektywnym oddziaływaniem na izoformę HDAC 3 jest to, że hamujące działanie wobec tej deacety­lazy HDACi 4b wykazuje w stężeniu 50-krotnie niższym niż stężenie toksyczne [30]. Myszy modelowe R6/2 i kon­trolne typu dzikiego były poddawane działaniu tego inhi­bitora (150 mg/kg m.c.) lub placebo przez 67 dni. Efekty oceniano w badaniach prowadzonych w trakcie podawa­nia HDACi 4b. Inhibitor poprawiał zachowania motorycz­ne, powodował wydłużenie czasu utrzymywania się zwie­rząt na walcu (rotarod test), spowalniał spadek masy ciała. W analizie histologicznej wykazano też działanie neuro­protekcyjne. Hamowaniu deacetylacji przypisuje się rów­nież normalizację ekspresji genów móżdżku, kory i prąż­kowia, zaburzonej w HD [30].
W świetle powyższych doniesień, HDACis wydawałyby się doskonałym potencjalnym kandydatem do zastosowa­nia ich w terapii HD. Należy jednak pamiętać o złożoności procesów wewnątrzkomórkowych i tym samym niejedno­znaczności funkcji enzymów odpowiedzialnych za zmia­ny epigenetyczne w obrębie DNA i chromatyny. Dowodem na to jest dwojakie działanie HDAC6. Funkcja deacetyla­zy uniemożliwia acetylację tubul i upośledza transport pę­cherzykowy BDNF - czynnika nekrotycznego pochodzenia mózgowego (brain-derived necrotic factor), wykazującego wraz z HSP70 protekcyjną rolę w HD. W tym kontekście, pożądane jest zastosowanie HDACi. Jednak HDAC6 dzia­ła neuroprotekcyjnie uzależniając transport w mikrotubu­lach, niezbędny do autofagalnego rozpadu agregatów HTT, a więc wprowadzenie inhibitora będzie odnosić skutek nie­pożądany. Stąd jednoznaczne zastosowanie HDACi w HD nie musi być gwarantem terapeutycznego sukcesu [3,4,20].
Obserwowane w badaniach nad HD pozytywne efekty HDACis nie wynikają jedynie z funkcji modulatora struktu­ry chromatyny, ale mogą być rezultatem kompleksowej ak­tywności farmakologicznej. Tak jest np. w przypadku kwasu walproinowego. Jak wykazali Zádori i wsp. [36], podawany myszom modelowym N171-82Q dootrzewnowo w sposób ciągły, w dawce dziennej 100 mg/kg m.c. znacznie wydłużał przeżywalność myszy i poprawiał obniżoną aktywność loko­motoryczną. Takie działanie, jak sugerują autorzy, może być wynikiem uruchomienia przez HDACi mechanizmów antyek­scytotoksycznych, GABA-ergicznych lub hamowania HDAC.
HTT wpływa też na procesy ubikwitynacji histonów. Jak wykazali Kim i wsp.[17] w komórkowym i mysim modelu HD, zaburzona interakcja HTT z kompleksem ligazy ubi­kwitynowej E3 - hPRC1L E3 związanym z Bmi1 wzmagała monoubikwitynację H2A, redukując przy tym analogicz­ny proces w H2B. Upośledzenie tych procesów determino­wało przebieg procesów metylacji lizyny 9 w H3. Wyniki uzyskane przez Kim i wsp. [17] potwierdzają teorię zna­czenia kodów histonowych i istnienie współdziałania po­szczególnych procesów w regulowaniu ekspresji genów.
Podsumowanie
Odkrycie uwarunkowania ekspresji genów od zjawisk epi­genetycznych stworzyło nowy rozdział w terapii chorób nie­uleczalnych i leczonych dotąd jedynie objawowo.
Skuteczność małocząsteczkowych modulatorów procesów epigenetycznych, takich jak inhibitory deacetylaz histono­wych - HDACis, wykazana w schorzeniach neurologicz­nych, np.: AD, PD, czy HD potwierdza związek ich etio­patogenezy z posttranslacyjnymi zmianami w histonach.
Poza hipotezami potencjalnie wyjaśniającymi patogenezę AD, obejmującymi, m.in. zaburzenia energetyczne, stres oksydatywny, czy kaskadę amyloidową z udziałem b-amy­loidu oraz stwierdzeniem ponad 160 mutacji w genach ko­dujących prekursora amyloidu - PSEN1 i PSEN2, wyka­zano także udział zjawisk epigenetycznych. Stwierdzono wpływ wspomnianych mutacji na aktywność acetylotrans­ferazową białka koaktywatorowego CBP, a także istotność hipometylacji rejonu promotorowego genu PSEN1 dla ak­tywności białka PSEN1 i wytwarzania β-amyloidu oraz znaczenie zarówno procesów acetylacji, jak i deacetylacji histonowej dla prawidłowej naprawy powstałych w prze­biegu AD uszkodzeń DNA, a także ich korelacje z liczbą synaps i poprawą pamięci.
W świetle powyższych badań poszukuje się zatem roz­wiązań terapeutycznych wśród czynników bezpośrednio wpływających na procesy acetylacji, tj. HDACs, modyfi­kując ich funkcję.
W PD okazało się, że α-synukleina tworząca ciałka Lewy'ego - jeden z głównych markerów choroby - wpły­wa na hamowanie procesów acetylacji oddziałując na de­acetylazę SIRT2, ale także na aktywność acetylotransfera­zową białek koaktywatorowych: CBP, p300 i p/CAF. Ten mechanizm, podobnie jak hipometylacja genu TNFα, jest wiązany ze wzmożoną apoptozą neuronów, co wykazano m.in. na przykładzie ludzkich komórek neuroblastomy.
Znaczenie acetylacji histonów w etiopatogenezie PD po­twierdziły badania z zastosowanie HDACIs. Inhibitory znosiły efekt neurodegeneracji, w tym neuronów dopami­nergicznych u myszy modelowych oraz indukowały neu­rotroficzny czynnik komórek glejowych - GDNF.
W HD pod wpływem inhibitora HDAC - fenylomaśla­nu sodu zaobserwowano obniżenie ekspresji na poziomie mRNA 12 genów wykazujących zmiany w zależności od stadium choroby, co stwierdzono w próbkach krwi po­branej od pacjentów obciążonych HD. Zasadność zasto­sowania HDACIs w potencjalnej terapii HD potwierdza blokowanie przez zmutowaną huntingtynę domeny HAT w koaktywatorach CBP i p/CAF. Pożądane efekty HDACi 4b skierowanego wybiórczo przeciw HDAC3 potwierdzo­no w badaniach na zwierzętach, obserwując zarówno po­prawę zachowań motorycznych, spowolniony spadek masy ciała, neuroprotekcyjne działanie HDACi w analizie hi­stologicznej, jak i normalizację ekspresji genów móżdż­ku, kory i prążkowia.
Znajomość procesów modulujących ekspresję genów i, co za tym idzie pośrednio wpływających na kształtowanie od­powiedzi białkowej zrodziła możliwość opracowywania ce­lowanych strategii terapeutycznych ingerujących w proce­sy patologiczne u samego ich źródła.
PIŚMIENNICTWO
[1] Abel T., Zukin R.S.: Epigenetic targets of HDAC inhibition in neurodegenerative and psychiatric disorders. Curr. Opin. Pharmacol., 2008; 8: 57-64
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[2] Borovecki F., Lovrecic L., Zhou J., Jeong H., Then F., Rosas H.D., Hersch S.M., Hogarth P., Bouzou B., Jensen R.V., Krainc D.: Genome-wide expression profiling of human blood reveals biomarkers for Huntington's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005; 102: 11023-11028
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[3] Cha J.H.: Transcriptional signatures in Huntington's disease. Prog. Neurobiol., 2007; 83: 228-248
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[4] Chuang D.M., Leng Y., Marinova Z., Kim H.J., Chiu C.T.: Multiple roles of HDAC inhibition in neurodegenerative conditions. Trends Neurosci., 2009; 32: 591-601
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[5] Costa F.F.: Non-coding RNA-s, epigenetics and complexity. Gene, 2008; 410: 9-17
[PubMed]  
[6] Courtney E., Kornfeld S., Janitz K., Janitz M.: Transcriptome profiling in neurodegenerative disease. J. Neurosci. Methods, 2010; 193: 189-202
[PubMed]  
[7] Fiszer U.: Zaburzenia autonomiczne w chorobie Parkinsona. Aktualn. Neurol., 2009; 9: 159-163
[8] Gavin D.P., Sharma R.P.: Histone modifications, DNA methylation, and schizophrenia. Neurosci. Biobehav. Rev., 2010; 34: 882-888
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[9] Gräff J., Mansuy I.M.: Epigenetic codes in cognition and behaviour. Behav. Brain Res., 2008; 192: 70-87
[PubMed]  
[10] Gruber B.M.: Witaminy "pamięci". Aktualn. Neurol., 2009; 9: 52-62
[11] Guil S., Esteller M.: DNA methylomes, histone codes and miRNA: Tying it all together. Int. J. Biochem. Cell Biol., 2009; 41: 87-95
[PubMed]  
[12] Guz J., Foksiński M., Oliński R.: Mechanizm metylacji i demetylacji DNA - znaczenie w kontroli ekspresji genów. Postępy Biochem., 2010; 56: 7-15
[PubMed]  
[13] Handel A.E., Ebers G.C., Ramagopalan S.V.: Epigenetics: molecular mechanism and implications for disease. Trends Mol. Med., 2010; 16: 7-16
[PubMed]  
[14] Hockly E., Richon V.M., Woodman B., Smith D.L., Zhou X., Rosa E., Sathasivam K., Ghazi-Noori S., Mahal A., Lowden P.A., Steffan J.S., Marsh J.L., Thompson L.M., Lewis C.M., Marks P.A., Bates G.P.: Suberoylanilide hydroxamic acid, a histone deacetylase inhibitor, ameliorates motor deficits in a mouse model of Huntington's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003; 100: 2041-2046
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[15] Hukowska-Szematowicz B., Deptuła W.: Biologiczna rola mikroRNA (miRNA) nowe dane. Postępy Biol. Kom., 2010; 37: 585-597
[Abstract]  
[16] Kim D., Nguyen M.D., Dobbin M.M., Fischer A., Sananbenesi F., Rodgers J.T., Delalle I., Baur J.A., Sui G., Armour S.M., Puigserver P., Sinclair D.A., Tsai L.H.: SIRT1 deacetylase protects against neurodegeneration in models for Alzheimer's disease and amyotrophic lateral sclerosis. EMBO J., 2007; 26: 3169-3179
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[17] Kim M.O., Chawla P., Overland R.P., Xia E., Sadri-Vakili G., Cha J.H.: Altered histone monoubiquitylation mediated by mutant huntingtin induces transcriptional dysregulation. J. Neurosci., 2008; 28: 3947-3957
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[18] Kontopoulos E., Parvin J.D., Feany M.B.: α-synuclein acts in the nucleus to inhibit histone acetylation and promote neurotoxicity. Hum. Mol. Genet., 2006; 15: 3012-3023
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[19] Kozera D.: Choroba Parkinsona (20.01.2011)
http://www.neurologiczne.pl/choroba_parkinsona.htm
[20] Lombardi M.S., Jaspers L., Spronkmans C., Gellera C., Taroni F., Di Maria E., Di Donato S., Kaemmerer W.F.: A majority of Huntington's disease patients may be treatable by individualized allele-specific RNA interference. Exp. Neurol., 2009; 217: 312-319
[PubMed]  
[21] Mehler M.F.: Epigenetic principles and mechanisms underlying nervous system functions in health and disease. Progress Neurobiol., 2008; 86: 305-341
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[22] Migliore L., Coppede F.: Genetics, environmental factors and the emerging role of epigenetics in neurodegenerative diseases. Mutat. Res., 2009; 667: 82-97
[PubMed]  
[23] Nelson P.T., Wang W.X., Rajeev B.W.: MicroRNAs (miRNAs) in neurodegenerative diseases. Brain Pathol., 2008; 18: 130-138
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[24] Olszewska M.J.: Nukleosomy i regulacja aktywności chromatyny. Postępy Biol. Kom., 2010; 37: 657-670
[Abstract]  
[25] Paluszczak J., Baer-Dubowska W.: Epigenom i nowotwory: nowy cel terapeutyczny i możliwości diagnostyczne. W: Postęp w ocenie jakości substancji i produktów leczniczych, red: E. Grześkowiak. A. Jelińska, M. Zając. Wydawnictwo Naukowe Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu, Poznań 2010, 297-316
[26] Ratan R.R.: Epigenetics and the nervous system: epiphenomenon or missing piece of the neurotherapeutic puzzle? Lancet Neurol., 2009; 8: 975-977
[PubMed]  
[27] Roth T.L., Sweatt J.D.: Regulation of chromatin structure in memory formation. Curr. Opin. Neurobiol., 2009; 19: 336-342
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[28] Sipione S., Rigamonti D., Valenza M., Zuccato C., Conti L., Pritchard J., Kooperberg C., Olson J.M., Cattaneo E.: Early transcriptional profiles in huntingtin-inducible striatal cells by microarray analyses. Hum. Mol. Genet., 2002; 11: 1953-1965
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[29] Solaroglu I., Zhang J.H.: The neurosurgical role of epigenome. Surg. Neurol., 2009; 71: 159-160
[PubMed]  
[30] Thomas E.: Selective HDAC inhibitors. BIOforum Europe, 2009; 3: 32-34
[31] Tremolizzo L., Rodriguez-Menendez V., Brighina L., Ferrarese C.: Is the inverse association between Alzheimer's disease and cancer the result of a different propensity to methylate DNA? Med. Hypotheses, 2006; 66: 1251-1252
[PubMed]  
[32] Turinsky A.L., Turner B., Borja R., Gleeson J.A., Heath M., Pu S., Switzer T., Dong D., Gong Y., On T., Xiong X., Emili A., Greenblatt J., Parkinson J., Zhang Z., Wodak S.J.: DAnCER: Disease-Annotated Chromatin Epigenetics Resource. Nucleic Acids Res., 2011; 39: D889-D894
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[33] Urdinguio R.G., Sanchez-Mut J.V., Esteller M.: Epigenetic mechanisms in neurological diseases: genes, syndromes, and therapies. Lancet Neurol., 2009; 8: 1056-1072
[PubMed]  
[34] Wang G., van der Walt J.M., Mayhew G., Li Y.J., Züchner S., Scott W.K., Martin E.R., Vance J.M.: Variation in the miRNA-433 binding site of FGF20 confers risk for Parkinson disease by overexpression of α-synuclein. Am. J. Hum. Genet., 2008; 82: 283-289
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[35] Wang W.X., Rajeev B.W., Stromberg A.J., Ren N., Tang G., Huang Q., Rigoutsos I., Nelson P.T.: The expression of microRNA miR-107 decreases early in Alzheimer's disease and may accelerate disease progression through regulation of β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1. J. Neurosci., 2008; 28: 1213-1223
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[36] Zádori D., Geisz A., Vámos E., Vécsei L., Klivényi P.: Valproate ameliorates the survival and the motor performance in a transgenic mouse model of Huntington's disease. Pharmacol. Biochem. Behav., 2009; 94: 148-153
[PubMed]  
Autorka deklaruje brak potencjalnych konfliktów interesów.