Postepy Hig Med Dosw. (online), 2011; 65: 93-103
Review
Full Text PDF  

Szczepienia przeciwprątkowe - BCG i co dalej?
Vaccination against M. tuberculosis - what next after BCG?
Marek Fol, Katarzyna Zawadzka, Magdalena Druszczyńska, Magdalena Kowalewicz-Kulbat, Wiesława Rudnicka
Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Uniwersytet Łódzki
Adres do korespondencji
dr Marek Fol, Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii, Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Uniwersytet Łódzki, ul. S. Banacha 12/16,90-237 Łódź; e-mail: marekfol@poczta.onet.pl

Źródło finansowania
Publikacja została sfinansowana z grantu MNiSzW nr N N303 345035

Otrzymano:  2010.11.09
Zaakceptowano:  2011.02.07
Opublikowano:  2011.02.19

Streszczenie
Gruźlica (TB) ciągle stanowi bardzo poważny światowy problem zdrowia publicznego. Występowanie TB jest zdecydowanie większe w regionach ubogich i o dużej gęstości zaludnienia (Afryka, Azja), niż w krajach postrzeganych jako stosunkowo zasobne. Jednakże również i tam, zwłasz­cza w Europie Wschodniej, problem gruźlicy staje sie palący ze względu na coraz częściej po­jawiające się szczepy wielolekooporne.
Leczenie gruźlicy jest trudne, gdyż wymaga długiego okresu stosowania kilku leków przeciw­prątkowych, a czasami nieskuteczne - gdy pacjent został zainfekowany prątkami wielolekoopor­nymi lub wykazuje deficyty odporności (infekcja HIV). Najlepszą ochroną przed gruźlicą pozo­staje więc zastosowanie skutecznej szczepionki.
Na początku XX wieku została wprowadzona do powszechnego użycia pierwsza i jak dotąd jedy­na przeciwgruźlicza szczepionka BCG (Bacille Calmette-Guerin). Dziś wiadomo, że preparat ten nie jest w pełni skuteczny. Mimo wielu badań i upływu czasu nie udało się jak dotąd uzyskać lep­szej szczepionki przeciwgruźliczej. Prace mające na celu jej stworzenie są jednak bardzo szeroko zakrojone. Wiele z nowo opracowywanych preparatów jest w II i III fazie badań, a ich dotychcza­sowe rezultaty wydają się obiecujące. Poszukiwania nowych szczepionek obejmują kilka strate­gii: użycie osłabionych przez modyfikacje wirulentnych prątków Mycobacterium tuberculosis, rekombinowanych atenuowanych prątków M. bovis BCG, wyselekcjonowanych immunogennych białek mikobakterii lub kodującego je DNA, czy też innych wektorów drobnoustrojowych no­szących antygeny prątkowe. Rozwój różnorodnych koncepcji jest niezwykle istotny, ponieważ zwiększa szanse otrzymania preparatów jak najbardziej skutecznych i bezpiecznych w immuni­zacji jak najszerszej grupy ludzi, nie tylko osób zdrowych, ale również tych z niedoborami od­porności. W świetle trwających badań perspektywy uzyskania bardziej skutecznej szczepionki napawają pewnym optymizmem.
Słowa kluczowe: gruźlica • szczepionka • immunizacja • BCG


Summary
Tuberculosis (TB) still remains a huge global health problem. An increase in TB has been ob­served in many parts of the world, especially in poor and densely populated sub-Saharan Africa and Asia. Tuberculosis affects not only the developing countries but also the relatively wealthy regions of Europe, particularly Eastern Europe, where drug-resistant mycobacterial strains are increasingly reported.
Control of tuberculosis expansion is very difficult. It requires the long-term use of anti-myco­bacterial drugs. Additionally, the HIV epidemic and the phenomenon of multi-drug resistance are assumed to be responsible for the increase in TB cases. Therefore the most reasonable form of anti-TB protection seems to be effective vaccination.
At the beginning of the twentieth century the BCG vaccine was introduced into general use as the first and so far the only immune protector against tuberculosis. Now it is known that this vac­cine is not powerful enough and induces protection at a relatively low level. Hence ongoing rese­arch on the development of a more powerful anti-mycobacterial vaccine is still needed. Many of the new formulations are in phase II or III of clinical trials and the results are promising. The se­arch for new vaccines involves several strategies: modified virulence-attenuated Mycobacterium tuberculosis strains, recombination of attenuated M. bovis BCG bacilli, immunogenic mycobac­terial proteins and DNA encoding selected proteins as well as unrelated microorganisms used as carriers of mycobacterial antigens. The wide range of concepts is extremely important because new vaccines should serve for immunization of the broadest possible population, not only heal­thy individuals but also those who are immunocompromised.
Key words: tuberculosis • vaccine • immunization • BCG




Wstęp
Mycobacterium tuberculosis (Mtb) to jeden z najbar­dziej rozpowszechnionych patogenów bakteryjnych czło­wieka. 24 marca 1882 r., podczas wykładu w Berlińskim Towarzystwie Fizjologicznym, Robert Koch ogłosił, że bakteria ta jest czynnikiem etiologicznym gruźlicy. Mtb występuje w postaci Gram-dodatniej pałeczki i charakte­ryzuje się wyjątkową budową ściany komórkowej. Cechuje się ona dużą zawartością lipidów, w tym kwasów mikolo­wych oraz innych specyficznych struktur, które warunku­ją kwasooporność tej bakterii. Prątek gruźlicy jest jednym z najstarszych patogenów ludzkich, który rozwinął kom­pleksowe strategie przetrwania [16,17,18]. Jedną z nich jest jego zdolność do utrzymywania się wewnątrz gospodarza przez długi okres w stanie utajonym [15,51].
Gruźlica (TB) stanowi poważny problem zdrowotny na świecie. Szacuje się, iż w 2008 r. u ponad 9 milionów osób rozwinęła się aktywna postać choroby. Rocznie jest ona przyczyną około 2 milionów zgonów [21]. Tym sa­mym gruźlica obok AIDS stanowi chorobę o najwyższym stopniu śmiertelności dla ludzi, spowodowaną przez jeden czynnik zakaźny [19]. Ponadto szacuje się, że około 2 mi­liardy ludzi, czyli prawie 1/3 całej populacji, jest latentnie zakażona Mtb [38].
Większość przypadków gruźlicy odnotowuje się w kra­jach Azji Południowo-Wschodniej, charakteryzujących się bardzo dużą gęstością zaludnienia. Najgorzej w tych statystykach wypadają Indie, gdzie wykrywa się około 1,9 miliona nowych przypadków rocznie. Równie poważ­na sytuacja występuje w Chinach i Indonezji. Ogromny odsetek zachorowań obserwowany jest również w Afryce Subsaharyjskiej, RPA, Ugandzie i Mozambiku, gdzie na 100000 osób stwierdza się ponad 500 przypadków zacho­rowań na gruźlicę. Problem gruźlicy wzrasta w przypad­ku osób zakażonych wirusem HIV, wśród których to wła­śnie gruźlica jest najczęstszą przyczyną śmierci. Zupełnie odmienna sytuacja panuje w krajach zachodniej Europy, gdzie gruźlica występuje znacznie rzadziej i na 100000 osób pojawia się średnio 10-50 zachorowań. Gruźlica, łącznie z malarią i AIDS określane są wspólną nazwą „The Big Three" (Wielka Trójka), a ich występowanie wiąże się m.in. z ubóstwem oraz ogromnymi dysproporcjami mię­dzy krajami bogatymi i biednymi [13,15].
Do niedawna sądzono, iż gruźlica przestała być poważ­nym problemem zdrowia publicznego, ponieważ moż­na ją skutecznie zwalczyć lekami przeciwprątkowymi. Kilka czynników przyczyniło się jednak do braku sukce­su w globalnej kontroli gruźlicy. Zaliczamy do nich: trud­ności w diagnostyce, czynniki społeczno-ekonomiczne na obszarach endemicznego występowania gruźlicy oraz to, że eradykacja bakterii z organizmu wymaga wielu miesię­cy leczenia. Ponadto pojawiły się wielolekooporne posta­ci gruźlicy (MDR - multi drug resistant) i nadzwyczajnie lekooporne postaci gruźlicy (XDR - extensive drug resi­stant). MDR TB jest wywołana przez bakterie oporne na działanie dwóch podstawowych leków przeciwprątkowych - izoniazydu i rifampicyny. Natomiast prątek typu XDR TB charakteryzuje się opornością na wymienione wcze­śniej leki oraz najlepsze leki drugiej linii - fluorochinolony, a ponadto na jeden z trzech innych antybiotyków: amika­cynę, kanamycynę lub kapreomycynę. Ta wielolekoopor­ność sprawia, iż chorzy z gruźlicą XDR mają niewielkie szanse wyleczenia i umierają mimo intensywnej, kosztow­nej i długotrwałej terapii. Wszystko to sprawia, iż zwal­czanie gruźlicy ponownie stało się sprawą priorytetową w skali globalnej [13,15,50].
Zachorowaniom na gruźlicę zapobiega się przez stosowa­nie szczepień ochronnych. Dotychczas jedyną dopuszczoną do użycia szczepionką przeciwprątkową jest szczepionka BCG, którą zastosowano po raz pierwszy w latach 20. XX wieku. Sądzono wtedy, że po wprowadzeniu tego preparatu liczba nowych zachorowań na gruźlicę zostanie znacząco ograniczona, a tym samym problem tej choroby zostanie rozwiązany. Do tej pory podano dzieciom około 4 bilio­ny dawek szczepionki BCG w 182 państwach. Mimo po­wszechnego stosowania na całym świecie szczepień prze­ciwgruźliczych, nie osiągnięto zamierzonego celu. Jest to wynikiem m.in. różnego stopnia odporności przeciwgruź­liczej indukowanej u szczepionych. Właściwości ochronne BCG szacowane są na poziomie 0-80% w zależności od miejsca wykonania badań. Dowiedziono, że szczepionka BCG chroni skutecznie przede wszystkim dzieci do lat 15 (zwłaszcza przed najgroźniejszymi postaciami gruźlicy - gruźlicą ośrodkowego układu nerwowego i uogólnioną gruźlicą „prosówką"). U osób dorosłych, poziom ochro­ny wykonywanych w dzieciństwie szczepień BCG ocenia się najwyżej na 50% [50].
Biorąc pod uwagę dramatyczne statystyki lat 90. XX wie­ku, obrazujące zachorowalność na gruźlicę i śmiertelność spowodowaną tą chorobą, Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) ogłosiła globalne zagrożenie tym drobnoustro­jem. Przyczyniło się to do utworzenia międzynarodowych strategii zwalczania gruźlicy. Opracowano m.in. program DOTS (Directly Observed Treatment Short-course), które­go podstawę stanowi szybkie wykrywanie i bezpośrednio nadzorowane leczenie gruźlicy zestawem leków przeciw­prątkowych. Program DOTS został zaakceptowany przez organizacje rządowe, korporacje przemysłowe i instytu­cje zajmujące się walką z gruźlicą (m.in. WHO). Jego ce­lem jest opracowywanie warunków pomocy dla państw o najwyższym poziomie zachorowalności oraz zasad dia­gnostyki, leczenia i kontroli epidemiologicznej gruźlicy. Zgodnie z tym programem należy dążyć do zredukowa­nia liczby zachorowań na gruźlicę, tak by do 2015 r. na­stąpił spadek o 50%, a do roku 2050 powinien być odno­towywany mniej niż jeden przypadek aktywnej postaci gruźlicy na 100 000 osób. W ramach powyższej strate­gii wyróżniono kilka głównych celów. Zaliczamy do nich redukcję czasu leczenia i częstości ponownych zachoro­wań, opracowanie nowych leków oraz schematów lecze­nia gruźlicy XDR i MDR, a także terapii osób zakażonych jednocześnie Mtb i HIV [2,15,49]. Szczególne znaczenie wśród zamierzeń programu walki z gruźlicą ma stwo­rzenie nowej, bardziej efektywnej szczepionki prze­ciwprątkowej.
Duża liczba nowych zakażeń Mtb i niski poziom ochro­ny przeciwprątkowej powstały po podaniu szczepionki BCG, oznaczają potrzebę opracowania lepszego szcze­pionkowego preparatu przeciwgruźliczego. W ośrodkach badawczych na świecie podejmowane są próby stworze­nia takiego preparatu, który doprowadzi do efektywniej­szego nabycia odporności przeciw prątkom gruźlicy [24]. Obecnie znajduje się kilka wariantów nowych szczepionek przeciwgruźliczych w różnych fazach badań. W pracy omó­wiono wybrane nowe modele szczepionek przeciwprątko­wych i związane z nimi perspektywy skutecznej ochrony przeciwgruźliczej, a w konsekwencji perspektywy ogra­niczenia występowania tej choroby.
Szczepionka BCG
Szczepionka BCG (Bacille Calmette-Guérin) jest pre­paratem powszechnie używanym do szczepień przeciw­gruźliczych. Nazwa szczepionki pochodzi od nazwy prąt­ków oraz nazwisk badaczy, którzy ją opracowali - Albert Calmette i Camille Guérin. Prątki Calmette-Guérin są ate­nuowanym szczepem Mycobacterium bovis (prątka bydlę­cego) uzyskanym w Instytucie Pasteura w Lille we Francji.
Po raz pierwszy ogłoszono, iż gruźlica jest chorobą zakaźną w połowie XIX w., kiedy to Jean Antoine Villemin w 1865 r. na jednym z posiedzeń francuskiej Akademii Medycznej przedstawił wyniki swoich badań. Dowodził, iż możliwa jest transmisja choroby z jednego osobnika na drugiego, co wykazał przez zarażenie królika materiałem pobranym od chorego na gruźlicę pacjenta oraz materiałem pobranym od chorego bydła [5,37]. Dopiero prace Roberta Kocha pozwoliły określić, iż czynnikiem etiologicznym ludzkiej gruźlicy jest Mycobacterium tuberculosis, a gruźlicy bydła - Mycobacterium bovis. Sądzono, iż na zasadzie analogii, podobnie jak w przypadku opracowania szczepionki prze­ciwko ospie, będzie można zastosować M. bovis do immu­nizacji ludzi w celu ochrony przed gruźlicą. Okazało się, że bezpośrednie zastosowanie M. bovis nie jest możliwe, gdyż doprowadza do rozwoju choroby. Przełom nastąpił po tym jak w 1908 r. Edmond Nocard wyizolował szczep M. bovis (zwany szczepem „Lait Nocard") ze zmian cho­robowych okolic sutka chorej na gruźlicę krowy i prze­słał go do Alberta Calmette z Instytutu Pasteura w Lille. Calmette oraz jego współpracownik Camille Guérin wie­lokrotnie pasażowali prątki na podłożu hodowlanym. Po 230 pasażach zauważono, że M. bovis stracił swą zjadli­wość, co umożliwiło wykorzystanie go do produkcji bez­piecznej szczepionki [60]. Warunkiem stosowania BCG jako szczepionki przeciwprątkowej była zatem utrata wła­ściwości chorobotwórczych.
Obecnie w celach immunizacyjnych stosowanych jest na świecie 12 podszczepów BCG różniących się, w wyniku kilkudziesięcioletniego pasażowania, pod względem ge­notypowym i fenotypowym. Wszystkie jednak zachowu­ją pierwotnie opisane właściwości protekcyjne, przy czym jednym z podszczepów o najsilniejszych cechach immu­nizacyjnych jest szczep brazylijski zwany BCG Moreau-Rio de Janeiro. Przywieziony został do Brazylii w 1927 r. i jest szczepem siostrzanym szczepu sprowadzonego do Urugwaju w 1925 r. przez Julio Elvio Moreau [6].
Po raz pierwszy BCG podano człowiekowi doustnie w 1921 r., kiedy to zaszczepiono noworodka urodzonego przez chorą na gruźlicę matkę [6]. Wkrótce szczepienia zo­stały wdrożone w całej Europie, a po II Wojnie Światowej WHO zaleciła rozszerzenie kampanii szczepień poza te­ren Europy [13,20,36,42,51].
Sposób podania szczepionki zmieniał się na przestrze­ni lat. Pierwotnie szczepionka podawana była doustnie. Po raz pierwszy szczepienie śródskórne przeprowadzono w 1927 r., a od 1939 r. praktykowano szczepienie przez wielopunktowe nakłucia skórne. Obecnie szczepionka po­dawana jest śródskórnie, chociaż jeszcze do 1968 r. bywa­ła podawana doustnie [6].
Od wprowadzenia BCG przeprowadzono wiele badań kli­nicznych (pierwsze już w latach 30. ub.w.) aby ocenić sku­teczność ochronną tej szczepionki. W wielu krajach jest ona podawana zaraz po urodzeniu i daje ochronę szczegól­nie przed gruźliczym zapaleniem opon mózgowych, w cią­gu pierwszych 15 lat życia. Od początku istnieją kontro­wersje na temat protekcyjnego działanie szczepionki BCG zapobiegającego gruźlicy płuc u dorosłych. Podczas kon­trolnych badań klinicznych wykazano, że poziom zabez­pieczenia BCG przeciw chorobie płuc w Europie wynosi średnio 50%. Są jednak rejony świata, gdzie skuteczność ta jest znacznie wyższa (około 80%) i obszary, gdzie sku­teczność bliska jest zeru (subkontynent indyjski). Ponadto wykazano, że ponowne podawanie szczepionki BCG mło­dzieży nie zwiększa zabezpieczenia przed najpowszechniej występującą płucną postacią gruźlicy [42,56,63].
Próbując wyjaśnić różnice w poziomie aktywności ochron­nej szczepień BCG obserwowanej w różnych programach badawczych rozważa się zróżnicowane ryzyko ekspozycji na prątki środowiskowe [42].
Prątki środowiskowe to organizmy wszechobecne, które żyją w glebie. Ich liczba wzrasta wraz ze zmniejszaniem się długości geograficznej, a więc na obszarach położo­nych blisko równika ekspozycja na działanie tych bakterii jest największa. Podejrzewa się, że reakcje odpornościo­we wzbudzane przez mikobakterie środowiskowe interfe­rują z reakcją na szczepionkę BCG poprzez jej blokowa­nie lub maskowanie [42].
Aby zbadać wpływ prątków środowiskowych na powstawa­nie odporności przeciwgruźliczej przeprowadzono badania porównawcze w grupach ludności zamieszkującej Wielką Brytanię i Malawi. Okazało się, że przed zaszczepieniem szczepionką BCG poziom odpowiedzi immunologicznej przeciw antygenom prątkowym u osób w Wielkiej Brytanii był niski, natomiast u osób w Malawi wysoki. Po podaniu szczepionki BCG badani w Wielkiej Brytanii wykazywa­li oczekiwaną reakcję, czyli wzrost poziomu odpowiedzi immunologicznej na antygeny prątkowe. W przypadku Malawijczyków szczepienie nie miało istotnego wpływu na tę odpowiedź. Doświadczenie to potwierdza założenia hipotezy maskowania, według której odpowiedź na prąt­ki środowiskowe koliduje z odpowiedzią na wprowadza­ną doskórnie szczepionkę BCG, poprzez jej blokowanie. Potwierdzono to w badaniach u zwierząt [42].
Różne poziomy ochrony przeciwprątkowej BCG mogą wynikać również z różnic genetycznych między różnymi szczepami BCG, jakie były używane do produkcji szcze­pionek na całym świecie [42,51].
Zrozumienie mechanizmów zmiennej skuteczności szcze­pionki BCG jest bardzo ważne w opracowaniu nowych, lepszych szczepionek przeciwprątkowych, co staje się nie­zbędnym zadaniem w sytuacji powstawania lekoopornych szczepów Mtb.
Nowe kierunki poszukiwawcze skuteczniejszej szczepionki przeciwprątkowej
Podczas opracowywania nowych szczepionek przeciwprąt­kowych należy uwzględnić możliwość bezpiecznego ich za­stosowania u osób zarażonych wirusem HIV lub lekoopor­nymi prątkami gruźlicy MDR i XDR. Nowa szczepionka powinna także wzmagać odpowiedź komórkową na prąt­ki gruźlicy u ludzi, u których podanie BCG w wieku no­worodkowym, a do niedawna także szkolnym, nie wzbu­dziło efektu protekcyjnego [49].
Wyróżnia się dwie główne strategie w opracowywaniu nowych szczepionek przeciwgruźliczych. Pierwsza obej­muje stworzenie preparatów, które zastąpią dotychczaso­wą szczepionkę BCG i będą się opierać na modyfikowa­nych szczepach BCG lub Mtb. Druga strategia skupia się na opracowaniu szczepionek typu „booster". Mogłyby one zawierać wyselekcjonowane antygeny Mtb i byłyby poda­wane osobom już wcześniej immunizowanym szczepion­ką BCG. Ich użycie potęgowałoby właściwości protekcyj­ne dotychczas stosowanej szczepionki [42].
Szczepionki przeciwprątkowe, nad którymi trwają ostat­nio badania, można podzielić na kilka rodzajów. Wśród nich wyróżniamy:
• szczepionki zawierające atenuowane mutanty Mycobacterium tuberculosis,
• rekombinowane szczepionki BCG,
• szczepionki zawierające szczepy BCG oraz inne prąt­ki, np. M. vaccae lub M. simiae,
• szczepionki zawierające wirusy jako nośniki antygenów prątkowych,
• szczepionki podjednostkowe,
• szczepionki DNA.
Powyższe preparaty testowane są w różnych laboratoriach i jednostkach naukowo-badawczych w celu określenia ich bezpieczeństwa i skuteczności [36,42,56,68]. Obecnie te­stowanych jest na różnych etapach badań klinicznych nie mniej niż 6 nowych preparatów szczepionkowych [9,13,27].
Żywe, atenuowane szczepionki przeciwprątkowe
Szczepionki stanowiące atenuowane mutanty M. tuberculosis
W genomie M. tuberculosis występuje ponad 120 genów, które nie są obecne w szczepach BCG. Na tej podstawie postawiono hipotezę, że żywy, atenuowany prątek gruźli­cy, który zawiera bardziej kompletny zestaw antygenów, może lepiej chronić niż dotychczasowa szczepionka BCG. Podstawowym warunkiem zastosowania Mtb, jako szcze­pionki jest jego skuteczna atenuacja przy jednoczesnym zachowaniu właściwości immunogennych [13]. Dzięki za­stosowaniu nowoczesnych metod inżynierii genetycznej otrzymano mutanty auksotroficzne Mtb w zakresie synte­zy m.in. puryn [35], leucyny [29], lizyny [48], glutaminy [64] czy tryptofanu [58]. Szczepy takie przeżywały i na­mnażały się w organizmach zwierząt doświadczalnych nie powodując u nich objawów chorobowych. Niestety ich wła­ściwości protekcyjne były równoważne lub częściej słab­sze w porównaniu z właściwościami ochronnymi standar­dowej szczepionki BCG [13,56].
Eliminacja genu secA2 u Mtb reprezentuje inny nurt po­dejścia w zakresie pozyskiwania atenuowanych szczepów Mtb do immunizacyji. Gen ten odpowiada za powstawa­nie czynnika niezbędnego do uwalniania przez komórki Mtb pewnej grupy białek, w tym dysmutazy ponadtlenko­wej SodA, odpowiedzialnych za przekształcanie anionów ponadtlenkowych (superoxide anions) do nadtlenku wo­doru (H2O2). Tak przygotowany mutant odznaczał się ob­niżoną zjadliwością i w przeciwieństwie do szczepu dzi­kiego Mtb, nasilał proces apoptozy zarażonych prątkami makrofagów. Antygeny tego mutanta były prezentowane limfocytom T w sposób promujący rozwój swoistych lim­focytów cytotoksycznych o fenotypie CD8+. Badania na zwierzętach wykazały, że szczep ΔsecA2 Mtb zapewniał lepszą ochronę przed zjadliwymi prątkami Mtb niż obec­nie stosowana szczepionka BCG [26].
Inną strategię pozyskania szczepów Mtb do szczepienia stanowią próby opracowania mutantów charakteryzują­cych się obniżoną zdolnością do utrzymywania się (per­sist) w organizmie poddawanym wakcynacji przy zacho­waniu możliwie niezmienionych podstawowych procesów biologicznych. Skrócony czas utrzymywania się bakterii szczepionkowych w organizmie ma szczególne znaczenie w przypadku immunizacji osób z niedoborami odporności. Wyrazem tych poszukiwań jest opracowanie auksotroficz­nego szczepu Mtb w zakresie syntezy kwasu pantoteno­wego (witaminy B5). Wykazano, iż taki mutant odznacza się wysokim poziomem atenuacji nie tylko w organizmach zwierząt immunokompetentnych (myszy BALB/c), ale rów­nież w organizmach zwierząt z dużym niedoborem odpor­ności (myszy typu SCID), a uzyskiwany poziom protekcji obserwowany u zwierząt szczepionych mutantem z deficy­tem syntezy witaminy B5 i tych immunizowanych szcze­pionką BCG był porównywalny [53].
Jednym ze szczepów M. tuberculosis wykazującym atenu­ację przekraczającą nawet tę reprezentowaną przez szczep BCG jest Mtb SO2 [41]. Szczep ten uzyskano przez unie­czynnienie genu phoP kodującego jedno z dwu białek dwu­komponentowego systemu sygnałowego phoP/R. System ten jest jednym z najważniejszych elementów odgrywają­cych rolę w wirulencji Mtb. Produkt genu phoP ma działa­nie regulatorowe w formowaniu złożonej struktury lipidów prątkowych, w tym tych nadających im charakter wirulent­ny. W badaniach u myszy wykazano, iż szczep MtbSO2, użyty jako szczepionka, wykazywał działanie protekcyjne na poziomie zbliżonym do tego, jakie obserwowane było po podawaniu szczepionki BCG. Z płuc myszy szczepio­nych MtbSO2 i tych immunizowanych BCG, zakażonych po szczepieniu w pełni zjadliwymi prątkami gruźlicy, izo­lowano podobną liczbę prątków, niższą niż liczba bakterii wykrywanych w płucach zwierząt nieimmunizowanych. Również liczba zwierząt, u których zakażenie Mtb spowo­dowało zmiany zapalne w płucach była podobnie zmniej­szona w grupach szczepionych MtbSO2 i BCG w porów­naniu z grupą myszy nieimmunizowanych [4].
Obiektem zainteresowania w pozyskaniu nowego szczepu szczepionkowego stały się również mikobakterie określa­ne jako Mycobacterium w (Mw). Są to nietypowe, szyb­ko rosnące i niechorobotwórcze prątki [46]. Wykazują po­krewieństwo antygenowe zarówno z M. leprae jak i z M. tuberculosis. Stwierdzono, że zabite prątki Mw aktywowały limfocyty Th1 do wytwarzania IFN-γ i IL-2 [55]. Dalsze badania z udziałem zwierząt wykazały, iż zabite prąt­ki Mycobacterium w podawane razem z zawierającym dwumikolan trehalozy adiuwantem Ribi lepiej chroni­ły zwierzęta przed prątkami gruźlicy niż zabite prątki M. tuberculosis [56].
Szczepionki zawierające rekombinowany szczep M. bovis BCG
Prątki M. bovis BCG obecnie używane w szczepionkach przeciwgruźliczych utraciły część genów podczas długo­trwałego procesu atenuacji. Zakłada się, że ponowne wpro­wadzenie genów kodujących określone antygeny lub „im­munostymulatorów" do genomu BCG może wpłynąć na podwyższenie właściwości immunogennych tych bakte­rii. Tym samym poziom ochrony indukowany po podaniu szczepionki zawierającej tak udoskonalone drobnoustroje powinien być znacznie lepszy w stosunku do szczepion­ki pierwotnej [56].
Rekombinowane szczepionki BCG (rBCG) są konstru­owane technikami inżynierii genetycznej. W ten sposób uzyskano rekombinanty BCG z ekspresją różnych cyto­kin, takich jak IL-2, IFN-γ lub GM-CSF, które mogłyby wzmocnić odpowiedź na antygeny Mtb. Opracowany zo­stał również rekombinant z ekspresją listeriolizyny wyka­zujący zwiększoną zdolność stymulowania limfocytów T CD8+. Niedawno skonstruowano również szczepy BCG wy­twarzające białka Ag85B i Rv3425 należące do grupy bia­łek PPE pochodzących od Mtb (rBCG: Ag85B- Rv3425). Białka tej grupy zawierają w N-końcowej części łańcucha peptydowego sekwencję aminokwasów Pro-Pro-Glu, od której została utworzona nazwa grupy białek PPE [56]. Geny związane z syntezą białek PPE (wraz z inną grupą niespokrewnionych z PPE białek PE) zajmują aż około 9% całego genomu Mtb, natomiast same białka są uznawane za podstawowy rezerwuar zróżnicowania antygenowego prąt­ków gruźlicy [12]. Wykazano, iż białko Rv3425 Mtb ma właściwości immunogenne wzmacniające odpowiedź typu Th1/Th2. Wyrazem tego jest m.in. wzrost stężenia IFN-γ w hodowlach splenocytów i intensywne wytwarzanie IgG1 w organizmach myszy immunizowanych białkiem Rv3425. Obserwacje te w połączeniu z informacjami o immunodo­minującej roli tego białka stwarzają przesłanki by rozwa­żać Rv3425 jako dobrego kandydata do prac nad nowymi szczepionkami przeciwgruźliczymi [66].
Nowo opracowywana szczepionka, zwana rBCG30, za­wiera rekombinowany szczep BCG charakteryzujący się nadekspresją mikolylotransferazy (MSP) [30,31,32,33], sekrecyjnego białka o masie 30 kDa, znanego także jako α-antygen lub Ag85B [7]. Białko to jest wydzielane za­równo do podłoża wzrostu, jak i wewnątrz makrofagów fa­gocytujących prątki [30].
W badaniach efektywności konstruowanych szczepionek przeciwgruźliczych, zwierzęciem z wyboru jest świnka morska, wykazująca dużą wrażliwość na chorobotwórcze działanie Mtb. Dodatkowo reakcje immunologiczne i pew­ne procesy patologiczne rozwijane przez świnki morskie zakażane prątkami gruźlicy przypominają te obserwowa­ne u ludzi. Niezwykle ważny jest sposób zakażania zwie­rząt. U ludzi pierwotna gruźlica zazwyczaj jest gruźlicą płuc. Dlatego w badaniach efektywności szczepionek prze­ciwgruźliczych zaleca się zakażanie zwierząt aerozolem. W celu określenia efektywności protekcyjnej skonstru­owanej szczepionki rBCG30, świnkom morskim podawa­no śródskórnie rekombinanta rBCG30 lub szczepionkowe prątki BCG, a 10 tygodni później, zwierzęta zakażano ae­rozolem zawierającym wirulentne Mtb. Zaobserwowano, że zwierzęta immunizowane rekombinantem rBCG30 efek­tywniej usuwały prątki gruźlicy Mtb z organizmu, a ponad­to przeżywały dłużej niż te, które były uodporniane prąt­kami BCG. Zwierzęta immunizowane nową szczepionką miały słabiej zaznaczone zmiany patologiczne w płucach, wątrobie i śledzionie w porównaniu ze zwierzętami, które otrzymały szczepionkę BCG. Szczepionka rBCG30 oka­zała się pierwszą szczepionką nowej generacji indukują­cą w modelu zwierzęcym bardziej efektywne mechanizmy protekcyjne w porównaniu z tradycyjnym preparatem BCG [30,33]. W 2008 r. opublikowano wyniki badań I fazy testów klinicznych szczepionki rBCG30 u ochotników. Wykazały one, że rBCG30 jest preparatem bezpiecznym i dobrze to­lerowanym przez zaszczepione osoby. W hodowlach ko­mórkowych, pobudzał on efektywnie namnażanie się swo­istych limfocytów pomocniczych CD4+ i cytotoksycznych CD8+, a także wzbudzał intensywne wytwarzanie IFN-γ. W wymiarze klinicznym szczepionka ta wykazywała po­dobną aktywność immunologiczną do tej obserwowanej po użyciu standardowego preparatu BCG [28,57].
W celu podniesienia właściwości immunogennych prąt­ków rBCG30 stworzono rekombinanta charakteryzującego się ekspresją ludzkiego IFN-γ (rBCG30/hIFN-γ). Świnki morskie immunizowane takim rekombinantem, a następ­nie zakażane Mtb szybciej eliminowały wprowadzane in­halacyjnie prątki Mtb niż świnki immunizowane prątka­mi BCG [34,49].
Bardzo ważną cechą szczepionek przeciwprątkowych po­winna być możliwość ich stosowania u osób z obniżoną odpornością komórkową np. zakażonych wirusem HIV. Uwzględniając ten aspekt opracowano kolejną wersję szcze­pionki - rBCG(mtb)30, zawierającą mutanta rBCG30 z de­fektem syntezy mikobaktyny, która jest potrzebna prątkom do pozyskiwania żelaza. Dzięki temu mutant defektywny rBCG(mtb)30 miał utrudnioną replikację w makroorgani­zmie, ale użyty do immunizacji świnek morskich zapew­niał im szybszą niż szczep BCG eliminację wirulentnych prątków Mtb i nasilał rozwój nadwrażliwości późnej (DTH - delayed hypersensitivity) na rekombinowane białko 30 kDa (rAg85B) [34,49].
Kolejnym przykładem rekombinowanej szczepionki prze­ciwprątkowej, która została dopuszczona do badań przed­klinicznych jest szczepionka ΔureChly+rBCG. Wirulentne prątki Mtb, a w pewnym okresie czasu także atenuowane prątki BCG, przeżywają wewnątrz pęcherzyków endoso­malnych (fagosomów) bakterii. Zatem ich antygeny są prze­twarzane endosomalnie i pobudzają głównie limfocyty T pomocnicze CD4+. Autorzy szczepionki ΔureChly+rBCG podjęli próbę bardziej efektywnego zaangażowania lim­focytów cytotoksycznych T CD8+ w odpowiedź przeciw­prątkową. Prątki Calmette-Guérin zostały tak zmodyfiko­wane, by wykazywały ekspresję genu listeriolizyny (Hly) Listeria monocytogenes. Białko to wykazuje optimum ak­tywności w pH kwaśnym zbliżonym do 5,8, podczas gdy początkowo kwaśne pH fagosomu zawierającego pochło­nięte prątki ulega neutralizacji. Aby temu zapobiec szczep rodzicielski BCG zmodyfikowano dodatkowo poprzez de­lecję genu ureazy (ΔureC). Brak tego enzymu pozwala na utrzymanie kwaśnego środowiska fagosomu, tworząc w ten sposób optymalne środowisko dla właściwości cytolitycz­nych listeriolizyny. Niszczy ona błonę fagosomu, a uwol­nione prątki przedostają się do cytosolu komórki makro­fagowej, są przetwarzane do peptydów w proteasomach i pobudzają swoiste limfocyty cytotoksyczne CD8+ [22].
Skuteczność nowej szczepionki, sprawdzano u myszy pod­danych ekspozycji na aerozol zawierający 2 różne szczepy Mycobacterium tuberculosis, laboratoryjny szczep H37Rv i klinicznie izolowany szczep Beijing. Badania te dowio­dły, że rekombinant BCG z ekspresją tylko listeriolizyny wywołuje odporność ochronną lepszą niż pierwotna szcze­pionka BCG. Wykazano także lepsze właściwości im­munogenne szczepu rekombinowanego BCG z ekspresją listeriolizyny i inaktywowanym genem ureazy w porówna­niu za szczepem wyposażonym wyłącznie w listeriolizy­nę [22]. W przypadku prątków ΔureC Hly+ rBCG docho­dzi do pobudzenia swoistych limfocytów cytotoksycznych CD8+ w sposób alternatywny z wykorzystaniem tzw. krzy­żowego przetwarzania antygenów egzogennych w cytoso­lu komórek prezentujących antygen (komórek dendrytycz­nych i makrofagów) i łączenia ich z cząsteczkami MHC klasy I [22,49]. Szczepionka ta weszła w I fazę badań kli­nicznych w 2008 r. [39].
Odmienną strategię reprezentują szczepionki, których kon­cepcja opiera się na uzyskaniu rekombinowanych szcze­pów BCG wykazujących ekspresję nie białek prątkowych, lecz określonych białek makroorganizmu, o których wia­domo, iż odgrywają rolę w przebiegu zakażenia lub pełnią rolę immunoregulatorową. Przykładem takich rozwiązań jest szczep BCG z ekspresją IFN-γ lub BCG z ekspresją IL-18. Wstępne badania na zwierzętach wykazały, że re­kombinanty takie wywołują silną odpowiedź limfocytów T na antygeny mikobakterii [10].
Preparaty typu „booster": szczepionki podjednostkowe, z białkami fuzyjnymi, szczepionki genetyczne
Istotną rolę w badaniach odporności przeciwzakaźnej od­grywa identyfikacja determinant antygenowych bakterii, sprawdzenie ich roli podczas indukcji odpowiedzi immu­nologicznej, a następnie izolacja fragmentów rozpozna­wanych przez limfocyty T i użycie ich do otrzymywa­nia szczepionek. Preparaty zawierające jeden bądź więcej oczyszczonych lub częściowo oczyszczonych peptydów antygenowych rozpoznawanych przez komórki układu im­munologicznego nazywane są szczepionkami podjednost­kowymi [15,20]. Opracowywanie takich szczepionek jest wyrazem poszukiwań stabilnych i bardziej bezpiecznych preparatów, zwłaszcza dla osób z niedoborem odporności.
Pojęcie „genetyczne uodpornienie" pojawiło się kilkana­ście lat temu i wiąże się z nową koncepcją rozwoju szcze­pionek przeciw czynnikom zakaźnym. Indukcja odpowie­dzi immunologicznej następuje po podaniu szczepionki zawierającej wyłącznie materiał genetyczny, obejmują­cy sekwencje kodujące wybrane cząsteczki antygenowe.
W porównaniu do białkowych podjednostkowych szczepio­nek, oczyszczenie i produkcja szczepionek DNA jest czę­sto mniej kosztowna. Szczepionki DNA są również prost­sze w opracowaniu i z tych powodów były wykorzystywane jako modele do badania immunogenności oraz ochron­nego działania pojedynczych antygenów Mycobacterium tuberculosis. Szczepionki te u myszy wywoływały dobrą odpowiedź immunologiczną, wykorzystując szerszy re­pertuar antygenowy limfocytów T CD4+ i CD8+, w porów­naniu ze szczepionkami podjednostkowymi. Ochrona po­wstająca po podaniu szczepionki DNA stanowiła 50-80% ochrony powstającej pod wpływem BCG, w tych samych warunkach eksperymentalnych. Jednoczesne użycie kilku szczepionek DNA lub immunizacja konstruktami niosą­cymi informację genetyczną dla dwu lub większej liczby antygenów, warunkowałyby zwiększenie działania ochron­nego w stosunku do monowalentnej szczepionki DNA. Interesujące jest to, że szczepionki DNA mogą wywoły­wać działanie protekcyjne u myszy, które nie mają lim­focytów CD4+. Dzięki temu szczepionki te mogłyby być wykorzystane u osób zarażonych wirusem HIV, które ce­chują się najwyższym ryzykiem rozwoju gruźlicy [13,20]. Istnieją przykłady nakazujące ostrożność w rozpatrywaniu zastosowania szczepionek DNA do ochrony przed gruź­licą. Szczepionki DNA mogą bowiem indukować odpo­wiedź immunologiczną prowadzącą do reakcji patolo­gicznych w chwili naturalnego zakażenia drobnoustrojami wirulentnymi. Szczepionki DNA kodujące antygeny Hsp60 M. leprae oraz Ag85 M. tuberculosis wykazywały działa­nie ochronne u świnek morskich zakażanych dożylnie M. tuberculosis. Jednak szczepionki te u świnek morskich za­każanych aerozolem zawierającym prątki Mtb powodowały poważne zmiany nekrotyczne w płucach, których nie ob­serwowano u zwierząt kontrolnych [59].
Jedną z pierwszych szczepionek przeciwprątkowych ba­zujących na pojedynczym białku prątkowym jest szcze­pionka MVA85A, wykorzystująca wirus, jako nośnik an­tygenów Mtb. Użyty w niej wirus krowianki typu Ankara (MVA) już wcześniej sprawdził się doskonale w końcowej fazie kampanii szczepień przeciwko ospie właściwej, oka­zując się bardzo bezpieczną szczepionką. Wirus ten utracił m.in. zdolność replikacji w komórkach ludzkich [39,42]. Na potrzeby badań nad nowymi szczepionkami przeciw­gruźliczymi, MVA został wyposażony w podjednostkę silnie immunogennego antygenu sekrecyjnego (Ag85A) M. tuberculosis.
MVA85A należy do szczepionek typu „booster", do stoso­wania u osób dorosłych, które były immunizowane szcze­pionką BCG w wieku noworodkowym i szkolnym, u któ­rych doszło do osłabienia odporności poszczepiennej. Podawanie takim osobom dodatkowych dawek szczepionki BCG nie nasila odporności na gruźlicę. Szczepionki typu „booster" mogłyby również pobudzać mechanizmy odpor­nościowe skuteczniej zabezpieczające przed gruźlicą gdy­by były podawane dzieciom niedługo po noworodkowym podaniu szczepionki BCG [42,47,49].
Wstępne badania skuteczności szczepionki MVA85A przeprowadzono u myszy, świnek morskich i naczelnych [45,65]. Podczas tych testów analizowano trzy grupy osob­ników. Pierwsze immunizowano wyłącznie BCG, drugie zaszczepiono BCG, a następnie doszczepiono MVA85A,natomiast ostatniej grupie nie podawano żadnych prepa­ratów prątkowych. Następnie zwierzęta zainfekowano ae­rozolem zawierającym Mtb. Doświadczenie wykazało, że osobniki doszczepiane szczepionką MVA85A charakte­ryzowały się lepszą protekcją niż zwierzęta zaszczepio­ne wyłącznie BCG [45]. Pierwsze próby kliniczne u lu­dzi z udziałem szczepionki MVA85A zostały podjęte w 2002 r. [43]. Przeprowadzono je u osób nieszczepio­nych BCG, z ujemnym testem tuberkulinowym. Badania wykazały bezpieczeństwo szczepionki oraz jej immuno­reaktywność. Szczepionka indukowała wysoki poziom an­tygenowoswoistych limfocytów T wytwarzających IFN-γ, co jest szczególnie istotne w świetle wiedzy o mechani­zmach odporności przeciwprątkowej. Bowiem wydzie­lany przez pobudzone limfocyty T, głównie typu Th1, IFN-γ nasila aktywność prątkobójczą makrofagów, które tym samym przestają być niszą życiową prątków gruźli­cy [44]. U osób szczepionych w przeszłości BCG, po po­daniu szczepionki MVA85A, obserwowano 5-30-krotne nasilenie wytwarzania IFN-γ przez limfocyty T w stosun­ku do cytokiny wydzielanej przez komórki T osób im­munizowanych tylko BCG [44]. Do kwietnia 2008 r. pre­paratem MVA85A258 zaszczepiono 258 zdrowych osób z terenów endemicznych gruźlicy w Afryce Południowej i Zachodniej, nie zaobserwowano żadnych poważnych objawów niepożądanych z tym związanych, ani u ochot­ników pozostających w rodzinnych kontaktach z chory­mi na gruźlicę ani u osób spoza takiej grupy [11,23,42]. Wyniki najnowszych badań z lat 2006-2008 opublikowa­ne w ub.r. [54] są potwierdzeniem wysoce immunogen­nych właściwości szczepionki MVA85A. Doprowadzała ona do silnej i długotrwałej odpowiedzi immunologicz­nej zarówno u dzieci, jak i u nastolatków nieszczepionych BCG, pochodzących z terenów endemicznych gruźlicy w Afryce Południowej. Indukowała liczne subpopulacje limfocytów T CD4+ wykazujących ekspresję IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-17, GM-CSF, przy czym subpopulacją dominu­jącą były komórki CD4+ wykazujące koekspresję IFN-γ, TNF-α i IL-2. W grupie dzieci zidentyfikowano dodatko­wo subpopulację limfocytów T CD4+, które oprócz tych trzech cytokin wykazywały ekspresję GM-CSF, a w gru­pie młodocianych powyższe trzy cytokiny i IL-17. W żad­nej z badanych grup wiekowych nie stwierdzono natomiast limfocytów T CD8+-swoistych w stosunku do Ag85A, ja­kie wykrywano wcześniej u osób poddanych szczepieniu MVA85A, które w przeszłości otrzymywały standardową szczepionkę BCG [8,11,54]. Spośród dwóch typów lim­focytów
T CD4+ pamięci immunologicznej, centralnych o fenotypie CCR7+CD45RA- i efektorowych charaktery­zujących się brakiem obu markerów (CCR7-CD45RA-), u dzieci i młodocianych poddanych szczepieniu MVA85A, prawie po 2 miesiącach od podania szczepionki, wykry­wano jedynie efektorowe komórki
CCR7-CD45RA- [54]. Kolejnych interesujących danych na temat skuteczności nowej szczepionki MVA85A powinny dostarczyć bada­nia kliniczne fazy IIb [42].
Agger i wsp. wykorzystali do opracowania nowej szcze­pionki antygeny ESAT-6 i TB-10.4 obecne w regionie RD1 wirulentnych prątków M. tuberculosis i M. bovis, którego brakuje w atenuowanych prątkach M. bovis BCG, bowiem został utracony podczas atenuacji. W myśl koncepcji, iż utrata ta może być przyczyną niedostatecznej skutecz­ności szczepionki BCG, zaproponowano przygotowanie preparatu zawierającego utracone antygeny, który mógłby być podawany łącznie z tradycyjną szczepionką BCG. Do zwiększenia efektywności nowego preparatu użyto również adiuwant nowej generacji - IC31. W jego składzie znalazło się białko kationowe KLKL(5)KLK oraz immunostymu­latorowy oligodeoksynukleotyd ODN1, pełniący funkcję białka sygnałowego poprzez receptor TLR9. Skuteczność szczepionki Ag85B-ESAT-6 podawanej wraz z adiuwantem IC31 sprawdzono u zwierząt, u których obserwowano zna­czące pobudzenie swoistych limfocytów T pomocniczych CD4+ i wydzielanie IFN-γ oraz IL-2 [3]. Szczepionka ta była dobrze tolerowana przez zdrowe osoby z wykluczo­nym zakażeniem latentnym M. tuberculosis i ujemnym od­czynem tuberkulinowym. Szczepionka tego typu mogłaby być w przyszłości stosowana u dzieci, niedługo po szcze­pieniu tradycyjną BCG („early boost") lub u dorosłych, u których działanie protekcyjne tradycyjnej szczepionki uległo osłabieniu („late boost") [1,49,57].
Przykładem szczepionki typu „booster" jest również prepa­rat AERAS-402 bazujący na rekombinowanym adenowi­rusie 35, który utracił swe właściwości replikacyjne i któ­ry dzięki inżynierii genetycznej wykazuje ekspresję trzech białek M. tuberculosis: Ag85A, Ag85B i TB10.4 [40]. Ten rodzaj wirusa wybrany został z myślą o zastosowaniu, jako nośnik antygenów prątkowych, głównie w krajach Afryki Subsaharyjskiej, w których osoby zakażone wirusem HIV wytwarzają przeciwciała przeciwko adenowirusowi 5 i 35 [40]. Z kolei spośród trzech mikolylotransferaz (określanych jako Ag85A, 85B i 85C) wydzielanych przez Mtb na zewnątrz komórki, właśnie Ag85A oraz Ag85B okazują się najsilniej­szymi antygenami, będącymi głównym celem limfocytów T w zakażeniach prątkowych. Białko TB10.4, wraz z TB10.3 i TB12.9, należy do podrodziny białek sekrecyjnych z gru­py ESAT-6 i może być silniej rozpoznawane przez układ odpornościowy niż samo białko ESAT-6 [14]. Szczepionkę opartą na powyższych komponentach (AERAS-402) uży­to do spotęgowania odpowiedzi immunologicznej wywo­łanej tradycyjną szczepionką BCG lub nowo zaprojekto­waną szczepionką AFRO-1. Zawiera ona rekombinowany szczep BCG wykazujący ekspresję białek Ag85A, Ag85B i TB10.4, pochodzących od M. tuberculosis, a ponadto wy­kazuje ekspresję perfryngolizyny (PfoA), której zadaniem jest ułatwienie ucieczki bakterii z pęcherzyków endosomal­nych do cytosolu komórki. Badania przeprowadzone na ma­kakach rezusach wykazały, iż schemat szczepień obejmują­cy pierwotną immunizację szczepionką AFRO-1 oraz dwie dawki szczepionki AERAS-402 okazał się bardziej efektyw­ny niż ten z zastosowaniem standardowej szczepionki BCG. Efektywność ta wyrażała się m.in. bardziej intensywnym wytwarzaniem IFN-γ i silniejszą proliferacją limfocytów T CD8αα+ w odpowiedzi na antygen Ag85B. Jest to szczegól­nie istotne gdyż limfocyty o tym fenotypie stanowią popula­cję limfocytów T biorących udział w formowaniu się anty­genowoswoistych limfocytów T pamięci immunologicznej, zarówno u zwierzą jak i u ludzi [40].
Ze względu na pojawiające się koncepcje zastosowania białka ESAT-6 do projektowania nowych narzędzi diagno­stycznych i narzędzi monitorujących efektywność szczepień w zakażeniach gruźliczych, coraz większą uwagę przywią­zuje się do białka TB10.4, jako tego, które z powodzeniem może zastępować białko ESAT-6 w nowo opracowywanych szczepionkach. Przykładem takiej strategii jest Hybrid 1 - szczepionka podjednostkowa oparta na białku fuzyjnym Ag85B-TB10.4. Mimo iż TB10.4 i ESAT-6 są kodowane przez geny tej samej rodziny, to w szczepie BCG ekspre­sji podlega tylko gen TB10.4, podczas gdy gen kodują­cy ESAT-6 uległ delecji w trakcie wieloletniej atenuacji. W badaniach u myszy wykazano, że immunizacja biał­kiem fuzyjnym Ag85B-TB10.4 (oczyszczony produkt po­zyskiwany z hodowli rekombinowanego szczepu E. coli), w połączeniu z adiuwantem DDA/MPL, skutkowała roz­wojem odpowiedzi protekcyjnej na poziomie porównywal­nym z odpowiedzią wywołaną BCG. Ponadto okazało się, że fuzja białka TB10.4 z Ag85B zwiększała immunogen­ność TB10.4 (w porównaniu do samego TB10.4), w prze­ciwieństwie do ESAT-6, który poddany fuzji z Ag85B wydaje się tracić swą immunodominującą rolę. Powyższe obserwacje sprawiają, że Hybrid 1 może się stać dobrym kandydatem na nową szczepionkę przeciwko gruźlicy [14].
Wśród białek mikobakteryjnych rozpatrywanych jako kan­dydaci do opracowania nowych szczepionek znalazły się również Pst-3, białko38kDa, czy białka szoku cieplne­go 60, 65 i 70. Preparaty genetyczne (DNA) z ich udzia­łem, często w połączeniu z genami kodującymi Ag85B lub ESAT-6, były badane z wykorzystaniem modeli zwie­rzęcych. Niedawno opracowano szczepionkę zawierającą proteinę PPE44 należącą do rodziny białek rodziny PPE. Immunizacja myszy preparatem DNA zawierającym pla­zmid kodujący natywne lub rekombinowane białko PPE44 generowała ochronę przeciwzakaźną zbliżoną do uzyskiwa­nej po immunizacji BCG [56]. Obiektem zainteresowania są również białka mikobakterii, o których jeszcze stosun­kowo niewiele wiadomo: MPT64 i MPT83. Białko MPT83 (Rv2873), chociaż wydzielane jest do środowiska wzrostu w niedużych ilościach, to charakteryzuje się wysoką im­munogennością [25]. W oparciu o ten antygen opracowano dwa warianty szczepionki: MPT83-DNA i MPT83-RNA. Obie indukowały antygenowoswoistą odpowiedź immu­nologiczną zarówno komórkową jak i humoralną, co wy­kazano na modelu zwierzęcym. Na podobnym poziomie kształtowało się wytwarzanie swoistych przeciwciał, IL-2 i IFN-γ. Szczepionka typu RNA wydaje się jeszcze bar­dziej bezpieczna od DNA ze względu na krótkotrwałą na­turę ekspresji białek z nośnika RNA, jednak okres protek­cji będący efektem takiego szczepienia jest mniej trwały [69]. Białko MPT64 (Rv1980c) M. tuberculosis ma rów­nież charakter sekrecyjny i podlega ekspresji wyłącznie w okresie aktywnych podziałów komórkowych [67]. Gen białka MPT64 znalazł się w dwuskładnikowej szczepion­ce DNA obejmującej dodatkowo gen kodujący Ag85B bądź MPT83. Pierwsze obserwacje u zwierząt wykazują, iż szczepionki takie mają wysoki potencjał indukowania mechanizmów protekcyjnych na poziomie porównywalnym bądź nawet przewyższającym ten indukowany przez BCG [61,62]. Co ciekawe, białko MPT64 jest również w III fazie badań klinicznych mających na celu określenie jego przy­datności w detekcji aktywnej gruźlicy, jako czynnika mo­gącego zastąpić tuberkulinę [67].
Podsumowanie
Potrzeba opracowania nowej szczepionki skutecznie indu­kującej mechanizmy protekcyjne przeciwko Mycobacterium tuberculosis wydaje się oczywista. Masowe szczepienia w skali światowej, mimo iż prowadzone od niemalże wieku, nie przyniosły spodziewanych efektów w postaci zmini­malizowania liczby zachorowań na gruźlicę w wymiarze globalnym. Przyczyn tego stanu rzeczy należy poszuki­wać w wielu płaszczyznach, społeczno-ekonomicznych, specyfice samego drobnoustroju, a może przede wszyst­kim w ograniczonej efektywności protekcyjnej tradycyjnej szczepionki BCG. Obecność szczepów MDR-TB i XDR-TB stanowi dodatkowy bodziec do poszukiwań efektyw­niejszych rozwiązań immunizacyjnych.
Rozwiązania te można przedstawić w postaci dwóch nurtów: pierwszy - dążący do opracowania szczepionki mającej za­stąpić dotychczas stosowaną i drugi - mający na celu uzu­pełnienie i spotęgowanie efektywności szczepionki BCG.
W pierwszy nurt poszukiwawczy wpisują się szczepion­ki bazujące na żywych, atenuowanych szczepach M. tuberculosis bądź rekombinantach tradycyjnego szcze­pu M. bovis BCG, wykazujących pożądane cechy, w tym ekspresję określonych antygenów Mtb lub białek gospoda­rza. Opracowując szczepionki bazujące na atenuowanych szczepach Mtb należy jednak pamiętać o możliwości re­wersji otrzymanych mutantów do postaci w pełni zjadli­wej. Stąd też proponuje się by takie drobnoustroje zawierały przynajmniej dwie mutacje, jedną dotyczącą ważnych szla­ków metabolicznych i drugą dotyczącą ich właściwości im­munogennych [13,52].
Idea drugiego nurtu zasadza się na koncepcji preparatów typu „booster", które służyć mają nie tyle zastąpieniu szcze­pienia BCG, co zintensyfikowaniu i uzupełnieniu protek­cyjnego działania szczepionki o korzeniach z początku ubiegłego stulecia. Koncepcja ta obfituje wielością propo­nowanych rozwiązań i kombinacji starannie wyselekcjono­wanych białek w postaci szczepionek podjednostkowych, białek fuzyjnych oraz tzw. szczepionek genetycznych bazu­jących głównie na DNA, ale również i na RNA. Preparaty tego typu zdają się przynosić wielowymiarowe korzyści, nie tylko z punktu widzenia bezpieczeństwa ich stosowania, ale również precyzji mechanizmów protekcyjnych skiero­wanych przeciwko ściśle wybranym antygenom.
Mnogość proponowanych rozwiązań pozwala patrzeć w przyszłość z ostrożnym optymizmem (część szczepio­nek przeszła już pierwsze fazy testów klinicznych u ludzi), a także z wiarą, że wiek XXI przyniesie skuteczne narzę­dzie w walce z globalnym problemem, jakim gruźlica nie­stety nadal pozostaje.
PIŚMIENNICTWO
[1] Aagaard C., Dietrich J., Doherty M., Andersen P.: TB vaccines: current status and future perspectives. Immunol. Cell Biol., 2009; 87: 279-286
[PubMed]  
[2] Abu-Raddad L.J., Sabatelli L., Achterberg J.T., Sugimoto J.D., Longini I.M.Jr., Dye C., Halloran M.E.: Epidemiological benefits of more-effective tuberculosis vaccines, drugs, and diagnostics. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2009; 106: 13980-13985
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[3] Agger E.M., Rosenkrands I., Olsen A.W., Hatch G., Williams A., Kritsch C., Lingnau K., von Gabain A., Andersen C.S., Korsholm K.S., Andersen P.: Protective immunity to tuberculosis with Ag85B-ESAT-6 in a synthetic cationic adjuvant system IC31. Vaccine, 2006; 24: 5452-5460
[PubMed]  
[4] Aguilar D., Infante E., Martin C., Gormley E., Gicquel B., Hernandez Pando R.: Immunological responses and protective mmunity against tuberculosis conferred by vaccination of Balb/C mice with the attenuated Mycobacterium tuberculosis (phoP) SO2 strain. Clin. Exp. Immunol., 2006; 147: 330-338
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[5] Alves-Dunkerson J., Dunkerson D.: Tuberculosis (09.10.2010)
http://www.dentallearning.org/course/fde0014/course.htm
[6] Barreto M.L., Pereira S.M., Ferreira A.A.: BCG vaccine: efficacy and indications for vaccination and revaccination. J. Pediatr., 2006; 82: S45-S54
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[7] Belisle J.T., Vissa V.D., Sievert T., Takayama K., Brennan P.J., Besra G.S.: Role of the major antigen of Mycobacterium tuberculosis in cell wall biogenesis. Science, 1997; 276: 1420-1422
[PubMed]  
[8] Beveridge N.E., Fletcher H.A., Hughes J., Pathan A.A., Scriba T. J., Minassian A., Sander C.R., Whelan K.T., Dockrell H.M., Hill A.V., Hanekom W.A., McShane H.: A comparison of IFNγ detection methods used in tuberculosis vaccine trials. Tuberculosis, 2008; 88: 631-640
[PubMed]  
[9] Brennan M.J.: The tuberculosis vacine challenge. Tuberculosis, 2005; 85: 7-12
[PubMed]  
[10] Britton W.J., Palendira U.: Improving vaccines against tuberculosis. Immunol. Cell Biol., 2003; 81: 34-45
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[11] Brookes R.H., Hill P.C., Owiafe P.K., Ibanga H.B., Jeffries D.J., Donkor S.A., Fletcher H.A., Hammond A.S., Lienhardt C., Adegbola R.A., McShane H., Hill A.V.: Safety and immunogenicity of the candidate tuberculosis vaccine MVA85A in West Africa. PLoS, 2008; 3: e2921
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[12] Cole S.T., Brosch R., Parkhill J., Garnier T., Churcher C., Harris D., Gordon S.V., Eiglmeier K., Gas S., Barry C.E.3rd, Tekaia F., Badcock K., Basham D., Brown D., Chillingworth T., Connor R., Davies R., Devlin K., Feltwell T., Gentles S., Hamlin N., Holroyd S., Hornsby T., Jagels K., Krogh A., McLean J., Moule S., Murphy L., Oliver K., Osborne J., Quail M.A., Rajandream M.A., Rogers J., Rutter S., Seeger K., Skelton J., Squares R., Squares S., Sulston J.E., Taylor K., Whitehead S., Barrell B.G.: Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature, 1998; 393: 537-544
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[13] Delogu G., Fadda G.: The quest for a new vaccine against tuberculosis. J. Infect. Dev. Ctries, 2009; 3: 5-15
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[14] Dietrich J., Aagaard C., Leah R., Olsen A.W., Stryhn A., Doherty T.M., Andersen P.: Exchanging ESAT6 with TB10.4 in an Ag85B fusion molecule-based tuberculosis subunit vaccine: efficient protection and ESAT6-based sensitive monitoring of vaccine efficacy. J. Immunol., 2005; 174: 6332-6339
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[15] Dietrich J., Doherty T.M.: Interaction of Mycobacterium tuberculosis with the host: consequences for vaccine development. APMIS, 2009; 117: 440-457
[PubMed]  
[16] Flynn J.L., Chan J.: Immune evasion by Mycobacterium tuberculosis: living with the enemy. Curr. Opin. Immunol., 2003; 15: 450-455
[PubMed]  
[17] Flynn J.L., Chan J.: Immunology of tuberculosis. Annu. Rev. Immunol., 2001; 19: 93-129
[PubMed]  
[18] Fol M.: Mycobacterium tuberculosis - jak przetrwać na wrogim terenie? Postępy Mikrobiol., 2008; 47: 387-392
[19] Frieden T.R., Sterling T., Munsiff S.S., Watt C.J., Dye C.: Tuberculosis. Lancet, 2003; 362: 887-899
[PubMed]  
[20] Gaciong Z.: Szczepionki. W: Immunologia. Red.: M. Jakóbisiak. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1998, 419-434
[21] Global tuberculosis control: epidemiology, strategy, financing. WHO report 2009. WHO, Geneva, 2009 (30.01.2011)
http://www.who.int./tb/publications/global_report/en/
[22] Grode L., Seiler P., Baumann S., Hess J., Brinkmann V., Eddine A.N., Mann P., Goosmann C., Bandermann S., Smith D., Bancroft G.J., Reyrat J., van Soolingen D., Raupach B., Kaufmann S.H.: Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacilli Calmette-Guérin mutants that secrete listeriolysin. J. Clin. Invest., 2005; 115: 2472-2479
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[23] Hawkridge T., Scriba T.J., Gelderbloem S., Smit E., Tameris M., Moyo S., Lang T., Veldsman A., Hatherill M., Merwe L., Fletcher H.A., Mahomed H., Hill A.V., Hanekom W.A., Hussey G.D., McShane H.: Safety and immunogenicity of a new tuberculosis vaccine, MVA85A, in healthy adults in South Africa. J. Infect. Dis., 2008; 198: 544-552
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[24] Hewinson R.G.: TB vaccines for the World. Tuberculosis, 2005; 85: 1-6
[25] Hewinson R.G., Michell S.L., Russell W.P., McAdam R.A., Jacobs Jr. W.R.: Molecular characterization of MPT83: a seroreactive antigen of Mycobacterium tuberculosis with homology to MPT70. Scand. J. Immunol., 1996; 43: 490-499
[PubMed]  
[26] Hinchey J., Lee S., Jeon B.Y., Basaraba R.J., Venkataswamy M.M., Chen B., Chan J., Braunstein M., Orme I.M., Derrick S.C., Morris S.L., Jacobs W.R.Jr, Porcelli S.A.: Enhanced priming of adaptive immunity by a proapoptotic mutant of Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Invest., 2007; 117: 2279-2288
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[27] Hoft D.: Tuberculosis vaccine development: golas, immunological design, and evaluation. Lancet, 2008; 372: 164-175
[PubMed]  
[28] Hoft D.F., Blazevic A., Abate G., Hanekom W.A., Kaplan G., Soler J.H., Weichold F., Geiter L., Sadoff J.C., Horwitz M.A.: A new recombinant bacilli Calmette-Guerin vaccine safely induces significantly enhanced tuberculosis-specific immunity in human volunteers. J. Infect. Dis., 2008; 198: 1491-1501
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[29] Hondalus M.K., Bardarov S., Russell R., Chan J., Jacobs W.R.Jr, Bloom B.R.: Attenuation of and protection induced by a leucine auxotroph of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun., 2000; 68: 2888-2898
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[30] Horwitz M.A., Harth G.: A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun., 2003; 71: 1672-1679
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[31] Horwitz M.A., Harth G., Dillon B.J., Masleša-Galić S.: A novel live recombinant mycobacterial vaccine against bovine tuberculosis more potent than BCG. Vaccine, 2006; 24: 1593-1600
[PubMed]  
[32] Horwitz M.A., Harth G., Dillon B.J., Masleša-Galić S.: Extraordinarily few organisms of a live recombinant BCG vaccine against tuberculosis induce maximal cell-mediated and protective immunity. Vaccine, 2006; 24: 443-451
[PubMed]  
[33] Horwitz M.A., Harth G., Dillon B.J., Masleša-Galić S.: Recombinant bacillus Calmette-Guérin (BCG) vaccines expressing the Mycobacterium tuberculosis 30-kDa major secretory protein induce greater protective immunity against tuberculosis than conventional BCG vaccines in a highly susceptible animal model. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000; 97: 13853-13858
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[34] Horwitz M.A., Harth G., Tullius M.V., Dillon B.J., Masleša-Galić S.: New more potent and safer recombinant BCG vaccines against tuberculosis. W: Tuberculosis: From Lab Research to Field Trials. Kaufmann S.H.E., Smith I., Nathan C.F., Keystone Symposia on Molecular and Cellular Biology. March 20-25, 2007, Vancouver, Canada, p.60
[35] Jackson M., Raynaud C., Laneelle M.A., Guilhot C., Laurent-Winter C., Ensergueix D., Gicquel B., Daffe M.: Inactivation of the antigen 85C gene profoundly affects the mycolate content and alters the permeability of the M. tuberculosis cell envelope. Mol. Microbiol., 1999; 31: 1573-1587
[PubMed]  
[36] Janaszek W., Szczuka I.: Szczepionka przeciw gruźlicy - BCG. W: Szczepionki i immunoglobuliny. Red.: W. Magdzik. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 1999, 13-23
[37] Jean Antoine Villemin. Br. Med. J., 1892; 2(1663): 1091 (09.10.2010)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2421387/
[38] Lin P.L., Flynn J.L.: Understanding latent tuberculosis: a moving target. J. Immunol., 2010; 185: 15-22
[PubMed]  
[39] Liu J.: New vaccine against tuberculosis: current developments and future challenges. Sci. Found. China, 2009; 17: 50-58
[40] Magalhaes I., Sizemore D.R., Ahmed R.K., Mueller S., Wehlin L., Scanga C., Weichold F., Schirru G., Pau M.G., Goudsmit J., Kuhlmann-Berenzon S, Spangberg M., Andersson J., Gaines H., Thorstensson R., Skeiky Y.A., Sadoff J., Maeurer M.: rBCG induces strong antigen-specific T cell responses in rhesus macaques in a prime-boost setting with an adenovirus 35 tuberculosis vaccine vector. PLoS, 2008; 3: e3790
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[41] Martin C., Williams A., Hernandez-Pando R., Cardona P.J., Gormley E., Bordat Y., Soto C.Y., Clark S.O., Hatch G.J., Aguilar D., Ausina V., Gicquel B.: The live Mycobacterium tuberculosis phoP mutant strain is more attenuated than BCG and confers protective immunity against tuberculosis in mice and guinea pigs. Vaccine, 2006; 24: 3408-3419
[PubMed]  
[42] McShane H.: Vaccine strategies against tuberculosis. Swiss Med. Wkly., 2009; 139: 156-160
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[43] McShane H., Pathan A.A., Sander C.R., Goonetilleke N.P., Fletcher H.A., Hill A.V.: Boosting BCG with MVA85A: the first candidate subunit vaccine for tuberculosis in clinical trials. Tuberculosis, 2005; 85: 47-52
[PubMed]  
[44] McShane H., Pathan A.A., Sander C.R., Keating S.M., Gilbert S.C., Huygen K., Fletcher H.A., Hill A.V.: Recombinant modified vaccinia virus Ankara expressing antigen 85B boosts BCG-primed and naturally acquired antimycobacterial immunity in humans. Nat. Med., 2004; 10: 1240-1244
[PubMed]  
[45] McShane H., Pathan A., Sander C., Whelan K., Beveridge N., Minassian A., Fletcher H., Price D., Ota M., Hawkridge T., Adegbola R., Hanekom W., Roederer M., Hussey G., Hill A.: Boosting BCG with MVA85A - Results from clinical tials. W: Tuberculosis: From Lab Research to Field Trials. Kaufmann S.H.E., Smith I., Nathan C.F., Keystone Symposia on Molecular and Cellular Biology. March 20-25, 2007, Vancouver, Canada, p.61
[46] National Cancer Institute Drug Dictionary (10.10.2010)
http://www.cancer.gov/drugdictionary/?CdrID=571076
[47] Pathan A.A., Sander C.R., Fletcher H.A., Poulton I., Alder N.C., Beveridge N.E., Whelan K.T., Hill A.V., McShane H.: Boosting BCG with recombinant modified vaccinia Ankara expressing antigen 85A: different boosting intervals and implications for efficacy trials. PLoS, 2007; 2: e1052
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[48] Pavelka M.S.Jr, Chen B., Kelley C.L., Collins F.M., Jacobs J.W.Jr: Vaccine efficacy of a lysine auxotroph of M. tuberculosis. Infect. Immun., 2003; 71: 4190-4192
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[49] Rudnicka W., Rudnicka K.: 60 lat szczepień BCG. Osiągnięcia, przegrane i nadzieje- nowe szczepionki przeciwgruźlicze w programach klinicznych. Postępy Mikrobiol., 2008; 47: 379-385
[50] Rudnicka W., Szpakowski P., Włodarczyk M., Kowalewicz-Kulbat M., Druszczyńska M., Fol M.: Genetyczne i cytokinowe wyznaczniki odpowiedzi na szczepionkę BCG u studentów Uniwersytetu Łódzkiego. Nowa Medycyna, 2009; 2: 90-94
[51] Salyers A.A, Whitt D.D.: Gruźlica powrót dawnego wroga. W: Mikrobiologia. Różnorodność, chorobotwórczość i środowisko. Red.: Z. Markiewicz. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2003, 336-340
[52] Sambandamurthy V.K., Derrick S.C., Jalapathy K.V., Chen B., Russell R.G., Morris S.L., Jacobs W.R. Jr: Long-term protection against tuberculosis following vaccination with a severely attenuated double lysine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun., 2005; 73: 1196-1203
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[53] Sambandamurthy V.K., Wang X., Chen B., Russell R.G., Derrick S., Collins F.M., Morris S.L., Jacobs W.R.Jr: A pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis is highly attenuated and protects mice against tuberculosis. Nat. Med., 2002; 8: 1171-1174
[PubMed]  
[54] Scriba T.J., Tameris M., Mansoor N., Smit E., van der Merwe L., Isaacs F., Keyser A., Moyo S., Brittain N., Lawrie A., Gelderbloem S., Veldsman A., Hatherill M., Hawkridge A., Hill A.V., Hussey G.D., Mahomed H., McShane H., Hanekom W.A.: Modified vaccinia Ankara-expressing Ag85A, a novel tuberculosis vaccine, is safe in adolescents and children, and induces polyfunctional CD41 T cells. Eur. J. Immunol., 2010; 40: 279-290
[PubMed]  
[55] Singh I.G., Mukherjee R., Talwar G.P., Kaufmann S.H.: In vitro characterization of T cells from Mycobacterium w-vaccinated mice. Infect. Immun., 1992; 60: 257-263
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[56] Singhal N., Bisht D., Joshi B.: Immunoprophylaxis of tuberculosis: an update of emerging trends. Arch. Immunol. Ther. Exp., 2010; 58: 97-106
[PubMed]  
[57] Skeiky Y.A., Sadoff J.C.: Advances in tuberculosis vaccine strategies. Nat. Rev. Microbiol., 2006; 4: 469-476
[PubMed]  
[58] Smith D.A., Parish T., Stoker N.G., Bancroft G.J.: Characterization of auxotrophic mutants of M. tuberculosis and their potential as vaccine candidates. Infect. Immun., 2001; 69: 1142-1150
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[59] Taylor J.L., Turner O.C., Basaraba R.J., Belisle J.T., Huygen K., Orme I.M.: Pulmonary necrosis resulting from DNA vaccination against tuberculosis. Infect. Immun., 2003; 71: 2192-2198
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[60] Teo S.S., Shingadia D.: BCG vaccine. W: Hot topics in infection and immunity in children II. Adv. Exp. Med. Biol., 2005; 568: 117-134
[PubMed]  
[61] Tian X., Cai H., Zhu Y.X.: Protection of mice with a divalent tuberculosis DNA vaccine encoding antigens Ag85B and MPT64. Acta Biochim. Biophys. Sin., 2004; 36: 269-276
[PubMed]  
[62] Tian X., Cai H., Zhu Y.X.: Immunogenicity and protection of divalent DNA vaccine encoding antigens MPT83 and MPT64 of Mycobacterium tuberculosis. Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 2005; 85: 1410-1413
[PubMed]  
[63] Tuberculosis prevention trial. Trial of BCG vaccines in south India for tuberculosis prevention: first report. Bulletin WHO, 1979; 57: 819-827
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[64] Tullius M.V., Harth G., Horwitz M.A.: Glutamine synthetase GlnA1 is essential for growth of M. tuberculosis in human THP-1 macrophages and guinea pigs. Infect. Immun., 2003; 71: 3927-3936
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[65] Verreck F.A., Vervenne R.A., Kondova I., van Kralingen K.W., Remarque E.J., Braskamp G., van der Werff N.M., Kersbergen A., Ottenhoff T.H., Heidt P.J., Gilbert S.C., Gicquel B., Hill A.V., Martin C., McShane H, Thomas A.W.: MVA85A boosting of BCG and an attenuated, phoP deficient M. tuberculosis vaccine both show protective efficacy against tuberculosis in rhesus macaques. PLoS, 2009; 4: e5264
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[66] Wang J., Qie Y., Zhang H., Zhu B., Xu Y, Liu W., Chen J., Wang H.: PPE protein (Rv3425) from DNA segment RD11 of Mycobacterium tuberculosis: a novel immunodominant antigen of Mycobacterium tuberculosis induces humoral and cellular immune responses in mice. Microbiol. Immunol., 2008; 52: 224-230
[PubMed]  
[67] Wang Z., Potter B.M., Gray A.M., Sacksteder K.A., Geisbrecht B.V., Laity J.H.: The solution structure of antigen MPT64 from Mycobacterium tuberculosis defines a new family of beta-grasp proteins. J. Mol. Biol., 2007; 366: 375-381
[PubMed]  
[68] Williams A., Hatch G.J., Clark S.O., Gooch K.E., Hatch K.A., Hall G.A., Huygen K., Ottenhoff T.H., Franken K.L., Andersen P., Doherty T.M., Kaufmann S.H., Grode L., Seiler P., Martin C., Gicquel B., Cole S.T., Brodin P., Pym A.S., Dalemans W., Cohen J., Lobet Y., Goonetilleke N., McShane H., Hill A., Parish T., Smith D., Stoker N.G., Lowrie D.B., Källenius G., Svenson S., Pawlowski A., Blake K., Marsh P.D.: Evaluation of vaccines in the EU TB Vaccine Cluster using a guinea pig aerosol infection model of tuberculosis. Tuberculosis, 2005; 85: 29-38
[PubMed]  
[69] Xue T., Stavropoulos E., Yang M., Ragno S., Vordermeier M., Chambers M., Hewinson G., Lowrie D.B., Colston M.J., Tascon R.E.: RNA encoding the MPT83 antigen induces protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis infection. Infect. Immun., 2004; 72: 6324-6329
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.