Postepy Hig Med Dosw. (online), 2010; 64: 504-512
Review
Full Text PDF  

Zastosowanie interferencji RNA w diagnostyce i terapii niektórych chorób człowieka
RNA interference as a potential tool for diagnosis and therapy of some human diseases
Paweł Jóźwiak, Anna Lipińska
Zakład Cytobiochemii, Katedra Cytobiochemii, Uniwersytet Łódzki
Adres do korespondencji
prof. dr hab. Anna Lipińska, Zakład Cytobiochemii, Katedra Cytobiochemii Uniwersytetu Łódzkiego, ul. Banacha 12/16, 90-237 Łódź; e-mail: annal@biol.uni.lodz.pl

Źródło finansowania
Praca powstała w ramach działalności statutowej Katedry Cytobiochemii UŁ.

Otrzymano:  2010.05.05
Zaakceptowano:  2010.09.14
Opublikowano:  2010.10.19

Streszczenie
Interferencja RNA jest jednym z najważniejszych odkryć w dziedzinie biologii molekularnej. Dotąd przeprowadzono wiele badań, które sugerują udział interferencji RNA w różnych proce­sach biologicznych istotnych w rozwoju wielu chorób. Jednak interferencja RNA dzięki swojej specyficzności i dużej efektywności stała się obiecującym narzędziem terapii genowej. Pomyślne wprowadzenie terapeutycznych małych interferencyjnych RNA (siRNAs) do docelowej tkanki wymaga ominięcia pewnych krytycznych barier organizmu. To z kolei przyczynia się do poszu­kiwań nowych wektorów, które powinny w sposób wybiórczy wnikać do określonego typu komó­rek oraz wykluczać odpowiedź immunologiczną. Artykuł jest próbą uporządkowania obecnego stanu wiedzy na temat zastosowania interferencyjnych RNA w diagnostyce i terapii niektórych chorób człowieka.
Słowa kluczowe: RNA interferencja • wyciszanie genu • nowotwory • choroby neurodegeneracyjne • choroby wirusowe • systemy dostarczania leków • wrodzona odpowiedź immunologiczna


Summary
RNA interference is one of the most important discoveries in the field of molecular biology. To date, many studies have been reported which suggest that RNA interference takes part in various biological processes essential for the development of many diseases. On the other hand, owing to its high specificity and efficiency, RNA interference has become a powerful tool in gene the­rapy. However, introduction of small interfering RNAs (siRNAs) to a target tissue requires over­coming some critical biological barriers. This, in turn, contributes to searching for new effective vectors, which should selectively penetrate the tissue and be able to exclude the innate immune response. This study provides a brief overview of the application of RNA interference in the dia­gnosis and therapy of some human diseases.
Key words: RNA interference • gene silencing • cancer • neurodegenerative diseases • viral diseases • drug delivery systems • innate immune response




Wprowadzenie
Interferencja RNA jest naturalnym, starym ewolucyjnie procesem, którego jedną z podstawowych funkcji wyda­je się ochrona genomu przed wirusami i transpozonami. Mimo iż zjawisko to jest szeroko rozpowszechnione w or­ganizmach eukariotycznych, to przez wiele lat umykało ono uwadze naukowców [1]. Pierwsze obserwacje potran­skrypcyjnego wyciszania ekspresji genów, które określo­no kosupresją, opisała grupa naukowców z Uniwersytetu w Kalifornii przeprowadzając badania nad transgeniczną modyfikacją rośliny Petunia hybryda [63]. Przełom w dzie­dzinie potranskrypcyjnego wyciszania ekspresji genów nastąpił w 1998 roku, gdy Fire i wsp. opublikowali na ła­mach tygodnika Nature wyniki swoich badań przeprowa­dzonych na nicieniu Caenorhabditis elegans, z których wynikało, że sensowne i antysensowne sekwencje RNA łączą się ze sobą tworząc dwuniciowy RNA - dsRNA (do­uble stranded RNA) swoiście wyciszający dany gen [28]. Wprowadzili oni powszechnie uznany termin „RNA inter­ferencji". Należy nadmienić, że za swoje osiągnięcia A. Fire i C. C. Mello w 2006 roku otrzymali Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny.
W 2003 roku po raz pierwszy zastosowano interferencje RNA w terapii żółtaczki wątrobowej u myszy. Rok później Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków zatwierdzi­ła pierwsze kliniczne próby z użyciem interferencyjnych RNA [79]. Przeprowadzono już wiele badań w różnych systemach w celu zastosowania interferencji RNA w te­rapii chorób [78].
Mechanizm wyciszania ekspresji genu wprocesie interferencji RNA
Zjawisko interferencji RNA (RNAi) polega na degradacji lub zahamowaniu ekspresji docelowego transkryptu przez egzogenne wprowadzenie lub endogenną syntezę dsRNA o homologicznej sekwencji. Poszczególne etapy tego pro­cesu przedstawiono na ryc. 1. Pierwszy etap interferencji RNA z egzogennym dsRNA zachodzi w cytoplazmie i pro­wadzi do hydrolizy dsRNA do małych interferencyjnych RNA - siRNA (small interfering RNA) z udziałem rybo­nukleazy Dicer, której każda z dwóch domen o aktywno­ści RNazy III tnie pojedynczą nić dupleksu generując jed­no nowe zakończenie. W wyniku enzymatycznego cięcia powstają produkty o długości około 21 nukleotydów ma­jące przy końcu 3' grupę hydroksylową oraz dwa niespa­rowane nukleotydy, a przy końcu 5' grupę fosforanową. Następnie nukleaza Dicer współdziałając z innymi kofak­torami pośredniczy w wiązaniu cząsteczek siRNA z kom­pleksem efektorowym RISC (RNA induced silencing com­plex) [17,25,35,46,49,99].
Ryc. 1. Mechanizm RNA interferencji (opis w tekście)

Endogennym substratem mechanizmu interferencji RNA są cząsteczki mikro RNA - miRNA (micro RNA). Pierwotny transkrypt miRNA - pri-miRNA (primary micro RNA) liczą­cy kilkaset nukleotydów i podlega enzymatycznej obróbce re­alizowanej przez kompleks zwany mikroprocesorem. Rdzeń mikroprocesora stanowi enzym Drosha o aktywności RNazy III oraz białko DGCR8 (DiGeorge syndrome critical region 8). W wyniku hydrolizy powstaje prekursorowy miRNA - pre-miRNA (precursor miRNA) o strukturze spinki do wło­sów, który jest transportowany z jądra komórkowego do cy­toplazmy, gdzie zachodzi drugi etap dojrzewania miRNA z udziałem nukleazy Dicer. Dojrzałe miRNA, podobnie jak egzogenne siRNA są kierowane do kompleksu efektorowe­go RISC, w którym w jednakowy sposób pośredniczą w wy­ciszaniu transkryptu określonego genu [11,17,27,54,69,104].
W komórkach człowieka RISC jest dużym wieloskładni­kowym zespołem białek, którego aktywność warunkuje obecność białka Ago-2 należącego do rodziny Argonaut. Wszystkie białka Argonaut zawierają domeny: PAZ, MID i PIWI. Domena PIWI wykazuje wysoki stopień homolo­gii do RNazy H. Pozostałe domeny odgrywają rolę w wią­zaniu nici mi/siRNA wchodzącej do kompleksu efektoro­wego. W aktywnym kompleksie RISC może uczestniczyć tylko jedna z nici siRNA, o wyborze której decyduje stabil­ność par zasad na końcach dupleksów. Nić, której koniec 5' jest mniej stabilny termodynamicznie zostaje związana z białkiem Ago-2 i aktywnie pośredniczy w procesie wy­ciszania transkryptu docelowego genu, podczas gdy dru­ga nić oddysocjowuje od kompleksu [17,37]. Włączona w kompleks RISC pojedyncza nić mi/siRNA pełni funk­cję „przewodnika", dzięki któremu zachodzi identyfikacja komplementarnej sekwencji w obrębie rejonu 3' niepodle­gającego translacji - 3' UTR (3' untranslated region) nici mRNA. W przypadku pełnej komplementarności mRNA z nicią mi/siRNA faworyzowane jest bezpośrednie endo­nukleolityczne cięcie docelowego transkryptu generowa­ne między miejscami sparowania z 10. i 11. nukleotydem mi/siRNA licząc od końca 5'. W wyniku działania endo­nukleazy powstają dwa fragmenty mRNA, z których każdy jest podatny na trawienie 3'- lub 5'-egzonukleazą. W ko­mórkach zwierzęcych, gdzie niekompletne sparowanie za­sad między nicią si/miRNA włączoną do kompleksu RISC a docelowym mRNA jest w zasadzie regułą, dochodzi do zahamowania translacji danego transkryptu bez jego de­gradacji [17,22,26,27,33,60,69,93,97].
Rola interferencji RNA w diagnozowaniu i terapii nowotworów
Dotychczasowe wyniki badań wskazują na odmienny po­ziom ekspresji miRNA w nowotworach w porównaniu z po­ziomem ich ekspresji w tkankach prawidłowych (tabela 1).
Tabela 1. Zmiany ekspresji miRNA w wybranych nowotworach (na podstawie wielu danych literaturowych)

Zmiany te mogą wynikać z umiejscowienia genów miRNA w tzw. miejscach łamliwych (fra sides), często ulegających amplifikacji, delecji lub translokacji w przebiegu transfor­macji nowotworowej. Mimo to, w większości przypadków nie są znane mechanizmy prowadzące do zaburzeń synte­zy miRNA. Przypuszcza się, że istotny wpływ na te zmia­ny mają mechanizmy epigenetyczne oraz defekty związa­ne z dojrzewaniem miRNA [75,107].
Obecnie uważa się, że profil ekspresji miRNA w komór­kach nowotworowych może być użyteczny w celu diagno­zowania, monitorowania oraz odpowiedzi chorego na zasto­sowany rodzaj terapii [20,57]. Według badań Iorio i wsp. [38] odmienny profil ekspresji zaledwie 15 miRNA po­zwolił bezbłędnie odróżnić 76 preparatów nowotworów złośliwych piersi od 10 preparatów prawidłowej tkanki. Ponadto zróżnicowana ekspresja miRNA stanowiła mar­ker ważnych cech histopatologicznych, takich jak zdolność do przerzutowania i angiogenezy oraz stadium nowotwo­ru. Podobne badania oparte na mikromacierzach miRNA przeprowadzili Rosenfeld i wsp. [74], którzy na podstawie 48 różnych sekwencji miRNA przyporządkowali 253 pró­by do 22 typów nowotworów z trafnością sięgającą 90%. Inna grupa badawcza analizując ekspresję trzech miRNA (miR-21, miR-155 i miR-221) wyróżniła 2 podtypy rozla­nego chłoniaka olbrzymiokomórkowego typu B - DLBCL (diffuse large B cell lymphoma), tj. ABC (activated B cell-like) i GCB (germinal center B cell-like) [47].
Jednymi z najlepiej poznanych miRNA uczestniczących w etiopatogenezie nowotworów człowieka są miR-15 i miR-16. Geny tych miRNA są umiejscowione na chro­mosomie 13. (13q14) w regionie podlegającym delecji w przebiegu większości przewlekłych białaczek limfocy­towych B-komórkowych - B-CLL (B-cell chronic lympho­cytic leukemia). Cimmino i wsp [15] wykazali, że miR-15a i miR-16-1 pełnią funkcję negatywnych regulatorów genu BCL-2, którego nadekspresja prowadzi do wzrostu opor­ności limfocytów białaczkowych na apoptozę.
Inne badania sugerują, że let-7 miRNA może kontrolować rozwój nowotworu płuc. Stwierdzono, że spadek ekspre­sji genu let-7 korelował ze skróceniem pooperacyjnego czasu przeżycia pacjenta. Doświadczenia przeprowadzo­ne in vitro potwierdziły tę obserwację; nadekspresja let-7 miRNA w komórkach linii A549 gruczolakoraków płuc znacznie hamowała proliferację [89]. W celu wyjaśnienia powyższych obserwacji wykazano udział let-7 miRNA w negatywnej regulacji onkogenów ras i myc - głównych onkogenów w raku płuc [19,41]. Sugeruje się również udział let-7 miRNA w regulacji kinazy LIM należącej do enzymów modulujących kształt i mobilność komórek [98].
W przeciwieństwie do miRNA let-7 o aktywności supre­sorowej, ekspresja policistronowego skupiska miR 17-92 znacząco przyspiesza rozwój nowotworu płuc, zwłasz­cza najbardziej agresywnej jego postaci, tj. typu drobno­komórkowego. Wzrost ekspresji tych miRNA jest zwią­zany z umiejscowieniem ich genów na chromosomie 13. (13Q31), w locus, które często podlega amplifikacji, m.in. w chłoniakach B-komórkowych. Badania na mysim mode­lu chłoniaka wywodzącego się z limfocytów B wykazały, że zwiększona ekspresja miR 17-92 połączona z ekspre­sją onkogenu c-myc pozytywnie koreluje z agresywniej­szą progresją guza. Prawdopodobnie skupisko miR 17-92 negatywnie reguluje transkrypcję genów supresorowych PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chro­mosome ten) i RB2. Zaobserwowano również, ze onko­gen c-myc precyzyjnie kontroluje sygnał do proliferacji poprzez aktywację transkrypcji genu czynnika E2F1 i ha­mowanie jego translacji [66,106].
Wyniki dotychczasowych eksperymentów zgodnie wska­zują na zastosowanie miRNA jako biomarkerów chorób nowotworowych. Odmienny profil ekspresji miRNA po­zwala z dużą dokładnością zakwalifikować nowotwór do odpowiedniego podtypu, a także umożliwia badanie nowo­tworów nisko zróżnicowanych, dla których wynik badania histopatologicznego jest mało precyzyjny [57].
Jeden z wielu celów terapii z wykorzystaniem RNAi sta­nowią onkogeny. Obecnie szacuje się, że 30% nowotwo­rów człowieka ma mutację punktową w obrębie onkoge­nów ras. Mutacja K-ras jest szczególnie istotna w rozwoju ponad 90% przypadków raków trzustki, ponieważ warun­kuje pojawienie się kolejnych defektów w genomie ko­mórki [13]. Badania przeprowadzone przez Fleminga i wsp. [29] na dwóch liniach komórkowych raka trzust­ki (Panc-1 i MiaPace-2) wykazały spadek zdolności do proliferacji i pojawianie się zmian w białkach cyklu ko­mórkowego po transfekcji swoistymi dla mutacji w K-ras siRNA. Odnotowano obniżenie ekspresji białka K-ras, co przekładało się na zahamowanie migracji komórek i roz­wój raka trzustki.
Inne podejście terapeutyczne kieruje interferencje RNA w stronę genów pośredniczących w kontroli cyklu komór­kowego, którego zaburzenia warunkują immortalizację ko­mórek. Przykładem jest białko Skp-2 (S-phase kinase-asso­ciated protein 2), stanowiące podjednostkę kompleksu ligazy ubikwitynowej negatywnie regulującej poziom białka p27Kip1 zaangażowanego w kontrolę cyklu komórkowego w punk­cie G1/S. Obniżona ekspresja p27Kip1 stwierdzona w wielu typach nowotworów ściśle korelowała z agresywnością no­wotworu i gorszym rokowaniem. Wyciszenie genu kodują­cego białko Skp-2 metodą interferencji RNA wpływało na wzrost ekspresji genu p27Kip1, co w rezultacie przyczyniło się do zahamowania rozwoju guza nowotworowego [87].
Obecnie duży problem kliniczny w leczeniu nowotworów stanowi oporność komórek na apoptozę, która uniemoż­liwia skuteczne zastosowanie leków chemioterapeutycz­nych. Powszechnie wiadomo, że komórki nowotworowe potrafią omijać proces apoptozy w wyniku wielu mecha­nizmów angażujących nadekspresję białek antyapopto­tycznych, na przykład należących do rodziny Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) lub IAP (inhibitor of apoptosis protein) [51]. Według badań Cioca i wsp. [16] spadek ekspresji białek Bcl-2 i Raf-1 w liniach komórkowych białaczki szpiko­wej po transfekcji interferencyjnymi RNA prowadził do wzrostu spontanicznej apoptozy i uwrażliwienia komórek na chemioterapię daunorubicyną i etopisidem. W innych badaniach siRNA nacelowany na gen białka Bcl-2, obni­żając ekspresję tego białka, zwiększał wrażliwość komó­rek HepG2 na 5-fluorouracyl i 10-hydroksykamptotecynę [24]. Ponadto interferencja RNA umożliwiła efektywne wyciszenie genu glikoproteiny P odgrywającej rolę w na­bywaniu przez komórkę nowotworową oporności wielole­kowej. Nadekspresję tego genu obserwuje się w wielu ty­pach nowotworów [101].
Interferencja RNA w terapii chorób wirusowych
Ze względu na brak w pełni skutecznych leków w tera­pii niektórych chorób wywołanych wirusami, wirusolo­gia pokłada wielkie nadzieje w nowej strategii wycisza­nia ekspresji genów.
Obecnie dużym zainteresowaniem cieszą się badania do­tyczące wykorzystania interferencji RNA w walce z wiru­sem HIV-1 (human immunodeficiency virus) człowieka. Wśród zidentyfikowanych sekwencji docelowych znajdują się geny kodujące białka: strukturalne (Gag i Env), regu­latorowe (Tat i Rev), pomocnicze (Nef i Vif) oraz odwrot­ną transkryptazę Pol [58]. Jednak podczas infekcji, mate­riał genetyczny wirusa HIV (RNA) wnika do cytoplazmy komórek gospodarza w postaci kompleksu nukleoprote­inowego utrudniając rozpoznanie sekwencji docelowych przez interferencyjne RNA [48]. Genom HIV-1 cechu­ją ponadto częste mutacje ograniczające sprawne działa­nie swoistych siRNA. W celu zminimalizowania wpływu tej zmienności na skuteczność terapii sugeruje się jedno­czesną ekspresję kilku różnych antywirusowych siRNA (trzech lub czterech) kodowanych w shRNA (short hairpa­in RNA) [55]. Alternatywne podejście zakłada wykorzy­stanie interferencyjnych RNA ograniczających ekspresję genów gospodarza niezbędnych w cyklu życiowym wiru­sa. Wyciszenie ekspresji receptora powierzchniowego CD4 (cluster of differentiation 4) i/lub jednego z koreceptorów CCR5 i CXCR4 (chemokine receptor) znacznie osłabiało wnikanie wirusa do komórek [7,105]. Okazało się, że wi­rus HIV-1 ma zdolność modulacji mechanizmu RNA in­terferencji poprzez wpływ na poziom białka TRBP (HIV-1 transactivating response RNA-binding protein), co znacz­nie utrudnia zahamowanie jego replikacji [56,76].
Komplikacje w potranskrypcyjnym wyciszaniu ekspresji genu, związane z aktywnością mutacyjną, dotyczą rów­nież wirusa zapalenia wątroby - HCV (hepatitis C virus). Niemniej jednak pewne sekwencje zlokalizowane w regio­nie 5' UTR, istotne dla replikacji HCV, wykazują wysoki stopień konserwatywności, co czyni je celem współcze­snej terapii z wykorzystaniem interferencji RNA [44,96]. Wykazano, że siRNA skierowane przeciwko sekwencjom IRES (internal rybosome entry side) występujące w obrę­bie regionu 5'UTR skutecznie hamowały replikację róż­nych genotypów HCV [72].
Kolejnym celem terapii z wykorzystaniem RNA interferen­cji stały się wirusy grypy, które chociaż nie stanowią dużego zagrożenia dla życia pacjenta, mają zdolność do tworzenia nowych postaci mutacyjnych, co skłania do ciągłego poszu­kiwania leków antywirusowych [91,109]. siRNA skierowane przeciwko transkryptowi wysoce konserwatywnego wiru­sowego genu M2 długotrwale hamowało replikację w ob­rębie podtypów H1N1 i H5N1 wirusa grypy typu A [88].
Inne obiecujące wyniki badań przedstawili Yamato i wsp. [103], którzy stosując swoiste siRNA skierowane przeciwko onkogenom E6 i E7 wirusa brodawczaka człowieka efek­tywnie zahamowali wzrost linii komórkowych nowotwo­rów szyjki macicy.
Interferencja RNA w chorobach neurodegeneracyjnych
Z powodu braku efektywnej terapii, choroby neurodege­neracyjne są jednym z głównych problemów zdrowotnych starzejącej się populacji krajów zachodnich. Sprzyja to roz­wojowi nowych strategii leczenia opartych na specyficz­nym wyciszeniu ekspresji genu zaangażowanego w prze­bieg schorzenia [40]. Najbardziej powszechną chorobą neurodegeneracyjną jest choroba Alzheimera charaktery­zująca się m.in. tworzeniem toksycznych β-amyloidowych płytek w regionie hipokampa i kory mózgowej. β-amyloid powstaje w wyniku proteolitycznego cięcia swoistego biał­kowego prekursora przez sekretazy typu β i γ. W neuro­nach β-sekretaza, zwana także białkiem BACE1 (B-site APP cleaving enzyme 1), jest atrakcyjnym celem terapeu­tycznym interferencyjnych RNA [67]. Badania przeprowa­dzone na modelu mysiej amyloidozy zgodnie potwierdziły, że zahamowanie ekspresji białka BACE1 redukuje neuro­degeneracyjne i behawioralne defekty, co potwierdza po­tencjalne zastosowanie interferencji RNA w terapii cho­roby Alzheimera [23].
W przypadku chorób neurodegeneracyjnych o podłożu ge­netycznym, które dziedziczą się w sposób autosomalny do­minujący terapia z udziałem interferencyjnych RNA polega na wyciszeniu ekspresji zmutowanego allelu [31]. Strategii tej podlegają m.in. choroby neurodegeneracyjne spowodo­wane ekspansją powtórzeń CAG w obrębie odpowiedniego genu, kodujących rozciągnięty ciąg reszt glutaminy w biał­ku - polyQ [8]. Eksperymenty przeprowadzone na mode­lu ataksji móżdżkowo-rdzeniowej typu 1 u myszy - SCA1 (spinocerebellar ataxia 1) (należącej również do chorób polyQ) wykazały, że shRNA skierowane przeciwko geno­wi SCA1 kodującego ataksynę 1 skutecznie przywracało sprawność motoryczną oraz redukowało patologiczne inklu­zje w komórkach Purkinjego [40,42]. Wyciszenie ekspre­sji zmutowanego allelu dotyczy również innych jednostek chorobowych nienależących do grupy polyQ, na przykład sklerozy lateralnej miotroficznej [71].
Wprowadzanie siRNA do komórki in vivo i in vitro
Od kiedy interferencja RNA stała się potencjalnie efektyw­nym narzędziem zarówno w terapii chorób, jak i w bada­niu funkcji genów, poszukuje się różnorodnych systemów jej zastosowania in vivo i in vitro. Powinny one działać nie tylko specyficznie w stosunku do danej tkanki czy typu komórek, ale także wykluczać aktywację odpowiedzi im­munologicznej.
Wektory wirusowe
Spośród dużej liczby systemów wirusowych, w przypadku RNAi na uwagę zasługują: retrowirusy łącznie z lentiwi­rusami, adenowirusy, parwowirus związany z adenowiru­sem - AAV (adeno-associated virus) oraz wirus opryszczki typu pierwszego. Genom retrowirusów stanowi jednonicio­wy RNA, który po infekcji podlega reakcji odwrotnej trans­krypcji i integracji z genomem gospodarza. Warunkiem re­trowirusowej integracji i ekspresji wirusowego DNA jest podział komórki. To ograniczenie wydaje się bardzo ko­rzystne w odniesieniu do szybko dzielących się komórek no­wotworowych, które mogą być efektywnie transdukowane. Jednakże retrowirusy są inaktywowane w surowicy przez białko c1 dopełniacza. Trudności te mogą być pokonane przez opracowanie wektorów retrowirusowych odpornych na działanie dopełniacza, co może być sposobem do bardziej efektywnego wprowadzenia shRNA [45]. Immunogenność i cytotoksyczność towarzyszą także wektorom lentiwiruso­wym oraz wirusowi opryszczki typu I [90]. Niektóre par­wowirusy, tzn. parwowirusy związane z adenowirusami nie wywołują odpowiedzi układu immunologicznego. Mimo to, utrzymanie wysokiego miana AAV w hodowli in vitro jest bardzo problematyczne [21,90]. Najlepszymi wektora­mi pozwalającymi na stabilną ekspresję interferencyjnych RNA w komórkach docelowych są lentiwirusy, ponieważ w odróżnieniu od retrowirusów wykazują tendencję do inte­gracji z genomem gospodarza w miejscu odległym od pro­motorów, w obszarze intronów, co potencjalnie ogranicza ich onkogenność [62]. Konstrukcja uniwersalnego wekto­ra wirusowego jest bardzo trudna. Chociaż wektory wiru­sowe wyróżniają się dużą efektywnością, ich kliniczne za­stosowanie jest utrudnione z powodu aktywacji odpowiedzi immunologicznej oraz zmiany ekspresji genów wskutek lo­sowej integracji z genomem gospodarza. Poszukuje się za­tem innych niewirusowych nośników [2].
Wektory niewirusowe
Nagie dupleksy siRNA to makromolekuły o masie cząstecz­kowej około 13 kDa i polianionowej naturze. Badania na myszach dowiodły, że dożylne wprowadzenie nagich siRNA powodowało ich akumulację, a następnie degradację w na­rządach z rozwiniętym układem siateczkowo-śródbłonko­wym, takich jak wątroba, płuca, śledziona, nerki [4]. Co więcej, nagie siRNA wprowadzone do organizmu przez po­danie ogólnoustrojowe zachowują się jak typowe makro­molekuły o masie cząsteczkowej poniżej 50 kDa, a więc podlegają filtracji przez kłębuszki nerkowe i są wydalane z moczem. Prowadzi to do obniżenia biologicznego okre­su półtrwania terapeutycznych interferujących RNA [43]. W związku z powyższym obecnie duży nacisk kładzie się na projektowanie wektorów niewirusowych umożliwiają­cych poprawę ich właściwości farmakokinetycznych i bio­dystrybucji w organizmie [64]. W przypadku RNAi do naj­częściej stosowanych nośników należą kationowe polimery i liposomy. Główna zasada generowania wektorów niewiru­sowych polega na tworzeniu kompleksów siRNA z kompo­nentami o ładunku dodatnim. Pozwala to uniknąć wydale­nia przez nerki (ze względu na masę molekularną) całego kompleksu oraz poprawia przenikanie do komórek poprzez elektrostatyczne oddziaływania siatki dodatnich ładunków z ujemnie naładowaną błoną komórkową [3]. Jednakże wy­soki pozytywny ładunek nośników może prowadzić do opso­nizacji białkami osocza, takimi jak: IgM, IgG, fibronekty­na lub komplement C3, co powoduje ich degradację przez układ fagocytów jednojądrzastych w wątrobie, śledzionie i płucach [92]. Dlatego w celu wyeliminowania niepożąda­nych oddziaływań systemów dostarczania leków ze skład­nikami krwi stosuje się opłaszczanie nośników hydrofilo­wymi polimerami, których celem jest maskowanie siatki powierzchniowych ładunków. Jednym z najczęściej stoso­wanych polimerów o takiej funkcji jest glikol polietyleno­wy - PEG (polyethylene glycol) [65]. Kationowe lipidy stabilizowane przez PEG określane jako SNALPs (solid nucleic acid lipid particles) skutecznie zastosowano do do­starczania siRNA w celu wyciszenia genu apolipoproteiny B - apoB u myszy i naczelnych. Pojedyncza dawka 2,5 mg/kg siRNA zamknięta w SNALPs zredukowała ekspresję genu apoB w wątrobie małp gatunku Cynomolgus o ponad 90%. To z kolei prowadziło do obniżenia stężeń apolipoproteiny B, cholesterolu i lipoprotein o małej gęstości - LDL (low density lipoprotein) przy czym efekt ten utrzymywał się przez 11 dni od chwili wprowadzenia do organizmu inter­ferujących RNA [110]. Niestety, zastosowanie PEG w do­starczaniu leków często koreluje ze znaczącym spadkiem wnikania kompleksów do komórek. Spowodowało to roz­wój nowych strategii w projektowaniu nośników opartych na wykorzystaniu ligandów, dzięki którym wektory mogą się przyłączać do swoistych typów komórek prezentują­cych na swojej powierzchni odpowiedni receptor. Pozwala to zmniejszyć dawkę terapeutyku i uniknąć nieswoistego wyciszenia ekspresji genów w innych tkankach niż doce­lowe. Wśród obecnie stosowanych ligandów można wyróż­nić związki niskocząsteczkowe (np.: galaktoza, LDL) oraz peptydy i białka (np.: transferryna, fragmenty przeciwciał) [53,95]. Po raz pierwszy koniugaty z przeciwciałami zo­stały wykorzystane w badaniach Songa i wsp. [86], którzy wykazali, że związanie fragmentów przeciwciał Fab (frag­ment antigen binding) i scFv (single-chain variable frag­ment) z protaminą i utworzenie białka fuzyjnego pozwala na specyficzne wprowadzenie w systemie in vivo anty-HIV siRNA do słabo transfekowalnych komórek T o immuno­fenotypie CD4+.
Dystrybucja systemów dostarczania dupleksów siRNA z krwiobiegu do narządów polega głównie na wykorzy­staniu zwiększonej przepuszczalności naczyniowej i za­trzymaniu cząsteczek w tkance - EPR (enhanced vascu­lar permeability and retention), co jest charakterystyczne dla chorób o podłożu zapalnym oraz chorób nowotworo­wych [61,64]. W celu zwiększenia efektywności pobiera­nia kompleksów z siRNA przez komórkę, głównie w pro­cesie endocytozy i makropinocytozy, istotne znaczenie ma średnica stosowanych kompleksów. W przypadku interna­lizacji nanosystemów do komórek guza nowotworowego preferowany rozmiar cząsteczek powinien być możliwie mały o średnicy nieprzekraczającej 100 nm [73].
Wewnątrzkomórkowo, podstawowym warunkiem umożli­wiającym włączenie transfekowanego siRNA do cytopla­zmatycznego kompleksu RISC jest rozpad nośnika oraz opuszczenie endosomu przez siRNA. Proces ten może za­chodzić z udziałem różnych mechanizmów zależnych od typy nośnika [30]. Na przykład, polimery kationowe, ta­kie jak PEI (polyethylene imine) buforują niskie pH endo­somów przez zwiększenie napływu protonów i wody, co prowadzi do osmotycznego pęcznienia, a następnie pęknię­cia endosomów i uwolnienia kompleksów z siRNA do cy­toplazmy [32]. W odróżnieniu od polipleksów, lipopleksy podlegają innemu mechanizmowi, którego podstawę stano­wi destabilizacja błony endosomu oparta na ruchach „flip-flop". Powoduje to rozpad kompleksu i uwolnienie siRNA do cytoplazmy [34,102]. Ponadto osiągnięcie dobrych wła­ściwości fuzogennych lipopleksów umożliwiają pH wraż­liwe, fuzogenne lipidy pomocnicze, których podstawową funkcją jest promowanie tworzenia odwróconej fazy hek­sagonalnej (H IIb) [68,80,94,111].
Niepożądane działanie interferencyjnych RNA w komórce
Poza selektywnym wyciszaniem specyficznych genów, siRNA może aktywować szlaki sygnalizacji z udziałem kinazy białkowej zależnej od dwuniciowych RNA - PKR (double-stranded RNA-dependent protein kinase) oraz re­ceptorów Toll-like - TLR (Toll-like receptor) [2].
W większości komórek człowieka kinaza PKR pozosta­je nieaktywna. Jednak po stymulacji dwuniciowym RNA dochodzi do homodimeryzacji i pełnej aktywacji PKR w wyniku autofosforylacji licznych reszt seryny i treoniny oraz fosforylacji wielu substratów łącznie z podjednostką a czynnika inicjującego translację eIF-2α. W rezultacie następuje całkowite zahamowanie syntezy białek i śmierć komórki. Kinaza PKR może fosforylować inhibitor kina­zy NF-κB - IKK-β (inhibitor of nuclear factor kappa B ki­nase subunit beta) aktywując w ten sposób szlak sygnali­zacji NF-κB [84,85].
Indukcja wrodzonej odpowiedzi immunologicznej może za­chodzić w wyniku kaskady przekazywania sygnału aktywo­wanej przez receptory Toll-like ulegające głównie ekspre­sji na powierzchni komórki. U człowieka zidentyfikowano jedenaście receptorów Toll-like, z których cztery: TLR3, TLR7, TLR8 i TLR9 przemieszczają się do wnętrza ko­mórki, do endosomów. Aktywacja odpowiedzi immunolo­gicznej wywołana transfekcją cząsteczek siRNA w wekto­rze niewirusowym zachodzi przeważnie z udziałem TLR7 i TLR8 [81]. Pewne sekwencje siRNA stymulują monocy­ty poprzez TLR8 do wytwarzania prozapalnych cytokin, podczas gdy komórki dendrytyczne poprzez TLR7 - do uwalniania znacznej ilości interferonu α. Przeprowadzone badania ujawniły, że za efekty immunostymulacyjne od­powiadają reszty urydyny występujące w sekwencji czą­steczek siRNA [82,83]. W związku z powyższym obec­nie dużo uwagi poświęca się modyfikacjom chemicznym cząsteczek siRNA, które głównie dotyczą substytucji gru­py hydroksylowej przy drugim atomie węgla pierścienia rybozy nukleozydów [6,59]. Potwierdzono eksperymen­talnie, że cząsteczki siRNA z modyfikacją urydyn w tej pozycji mogą z różnym powinowactwem wiązać się z re­ceptorami Toll-like, lecz nie powodują dalszej sygnalizacji [10,83,84]. Pozostałe modyfikacje dotyczą grup fosfodie­strowych siRNA, rzadziej zasad azotowych [18].
Powszechnie wiadomo, że interferencja RNA toleruje pew­ne niedopasowanie pomiędzy cząsteczkami siRNA, a do­celowym mRNA, co może prowadzić do potranskrypcyj­nego wyciszenia ekspresji innych genów niż zakładane [39,52]. Okazało się, że sparowanie zaledwie jedenastu ko­lejnych nukleotydów cząsteczki siRNA z cząsteczką mRNA jest wystarczające do skutecznego wyciszenia transkryptu. Doprowadziło to do rozwoju wielu metod prognozowania efektywności działania siRNA, które opierają się na charakte­rystyce ich sekwencji oraz struktury drugorzędowej docelowe­go mRNA i są określane z zastosowaniem algorytmów [50].
Niemniej w analizie z zastosowaniem mikromacierzy wy­kazano, że systemy dostarczania siRNA mogą zmieniać ekspresję genów traktowanych komórek, co ogranicza za­stosowanie tej metody w terapii in vivo [43].
Podsumowanie
Odkrycie naturalnego, specyficznego zjawiska interferen­cji RNA miało istotny wpływ na rozwój badań klinicznych. Obszerne dowody potwierdzają udział cząsteczek miRNA w regulacji procesów patologicznych, w tym chorób no­wotworowych. Proces interferencji RNA ma duży po­tencjał terapeutyczny zarówno w diagnostyce, jak i te­rapii celowanej. Niemniej skuteczne wykorzystanie możliwości tego procesu w przyszłości zależy głównie od postępu w dziedzinie systemów dostarczania leków.
PIŚMIENNICTWO
[1] Agrawal N., Dasaradhi P.V., Mohmmed A., Malhotra P., Bhatnagar R.K., Mukherjee S.K.: RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2003; 67: 657-685
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[2] Aigner A.: Delivery systems for the direct application of siRNAs to induce RNA interference (RNAi) in vivo. J. Biomed. Biotechnol., 2006; 2006: 71659
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[3] Akhtar S., Benter I.: Toxicogenomics of non-viral drug delivery systems for RNAi: potential impact on siRNA-mediated gene silencing activity and specificity. Adv. Drug Deliv. Rev., 2007; 59: 164-182
[PubMed]  
[4] Akhtar S., Benter I.F.: Nonviral delivery of synthetic siRNAs in vivo. J. Clin. Invest., 2007; 117: 3623-3632
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[5] Arndt G.M., Dossey L., Cullen L.M., Lai A., Druker R., Eisbacher M., Zhang C., Tran N., Fan H., Retzlaff K., Bittner A., Raponi M.: Characterization of global microRNA expression reveals oncogenic potential of miR-145 in metastatic colorectal cancer. BMC Cancer, 2009; 9: 374
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[6] Behlke M.A.: Chemical modification of siRNAs for in vivo use. Oligonucleotides, 2008; 18: 305-319
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[7] Bennasser Y., Yeung M.L., Jeang K.T.: RNAi therapy for HIV infection: principles and practicalities. BioDrugs, 2007; 21: 17-22
[PubMed]  
[8] Bonini N.M., La Spada A.R.: Silencing polyglutamine degeneration with RNAi. Neuron, 2005; 48: 715-718
[PubMed]  
[9] Calin G.A., Ferracin M., Cimmino A., Di Leva G., Shimizu M., Wojcik S.E., Iorio M.V., Visone R., Sever N.I., Fabbri M., Iuliano R., Palumbo T., Pichiorri F., Roldo C., Garzon R., Sevignani C., Rassenti L., Alder H., Volinia S., Liu C.G., Kipps T.J., Negrini M., Croce C.M.: A microRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia. N. Engl. J. Med., 2005; 353: 1793-1801
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[10] Cekaite L., Furset G., Hovig E., Sioud M.: Gene expression analysis in blood cells in response to unmodified and 2'-modified siRNAs reveals TLR-dependent and independent effects. J. Mol. Biol., 2007; 365: 90-108
[PubMed]  
[11] Chan S.P., Slack F.J.: And now introducing mammalian mirtrons. Dev. Cell, 2007; 13: 605-607
[PubMed]  
[12] Chow T.F., Youssef Y.M., Lianidou E., Romaschin A.D., Honey R.J., Stewart R., Pace K.T., Yousef G.M.: Differential expression profiling of microRNAs and their potential involvement in renal cell carcinoma pathogenesis. Clin. Biochem., 2010; 43: 150-158
[PubMed]  
[13] Chromik I.: Zastosowanie interferencji RNA (RNAi) w raku trzustki - nowa strategia leczenia. Gastroenterologia Polska, 2008; 15: 337-342
[14] Ciafre S.A., Galardi S., Mangiola A., Ferracin M., Liu C.G., Sabatino G., Negrini M., Maira G., Croce C.M., Farace M.G.: Extensive modulation of a set of microRNAs in primary glioblastoma. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005; 334: 1351-1358
[PubMed]  
[15] Cimmino A., Calin G.A., Fabbri M., Iorio M.V., Ferracin M., Shimizu M., Wojcik S.E., Aqeilan R.I., Zupo S., Dono M., Rassenti L., Alder H., Volinia S., Liu C.G., Kipps T.J., Negrini M., Croce C.M.: miR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting BCL2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005; 102: 13944-13949
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[16] Cioca D.P., Aoki Y., Kiyosawa K.: RNA interference is a functional pathway with therapeutic potential in human myeloid leukemia cell lines. Cancer Gene Ther., 2003; 10: 125-133
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[17] Collins R.E., Cheng X.: Structural and biochemical advances in mammalian RNAi. J. Cell. Biochem., 2006; 99: 1251-1266
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[18] Corey D.R.: Chemical modification: the key to clinical application of RNA interference? J. Clin. Invest., 2007; 117: 3615-3622
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[19] Dalmay T.: MicroRNAs and cancer. J. Intern. Med., 2008; 263: 366-375
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[20] Drakaki A., Iliopoulos D.: MicroRNA gene networks in oncogenesis. Curr. Genomics, 2009; 10: 35-41
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[21] Duniec K.: Wirusowe nośniki genów w neurobiologii. Konferencja " Nowe metody w neurobiologii", 2004; 13-17
[22] Eulalio A., Huntzinger E., Izaurralde E.: Getting to the root of miRNA-mediated gene silencing. Cell, 2008; 132: 9-14
[PubMed]  
[23] Farah M.H.: RNAi silencing in mouse models of neurodegenerative diseases. Curr. Drug Deliv., 2007; 4: 161-167
[PubMed]  
[24] Feng L.F., Zhong M., Lei X.Y., Zhu B.Y., Tang S.S., Liao D.F.: Bcl-2 siRNA induced apoptosis and increased sensitivity to 5-fluorouracil and HCPT in HepG2 cells. J. Drug Target., 2006; 14: 21-26
[PubMed]  
[25] Filip A.: Mikro-RNA - małe cząsteczki o wielkim znaczeniu. Postepy Biol. Kom., 2006; 33: 45-58
[Abstract]  
[26] Filip A.: MikroRNA: nowe mechanizmy regulacji ekspresji genów. Postepy Biochem., 2007; 53: 413-419
[PubMed]  
[27] Filipowicz W., Jaskiewicz L., Kolb F.A., Pillai R.S.: Post-transcriptional gene silencing by siRNAs and miRNAs. Curr. Opin. Struct. Biol., 2005; 15: 331-341
[PubMed]  
[28] Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C.: Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 1998; 391: 806-811
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[29] Fleming J.B., Shen G.L., Holloway S.E., Davis M., Brekken R.A.: Molecular consequences of silencing mutant K-ras in pancreatic cancer cells: justification for K-ras-directed therapy. Mol. Cancer Res., 2005; 3: 413-423
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[30] Gary D.J., Puri N., Won Y.Y.: Polymer-based siRNA delivery: perspectives on the fundamental and phenomenological distinctions from polymer-based DNA delivery. J. Control. Release, 2007; 121: 64-73
[PubMed]  
[31] Gonzalez-Alegre P.: Therapeutic RNA interference for neurodegenerative diseases: from promise to progress. Pharmacol. Ther., 2007; 114: 34-55
[PubMed]  
[32] Grabe M., Oster G.: Regulation of organelle acidity. J. Gen. Physiol., 2001; 117: 329-344
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[33] Gregory R.I., Chendrimada T.P., Cooch N., Shiekhattar R.: Human RISC couples microRNA biogenesis and posttranscriptional gene silencing. Cell, 2005; 123: 631-640
[PubMed]  
[34] Hafez I.M., Maurer N., Cullis P.R.: On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids. Gene Ther., 2001; 8: 1188-1196
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[35] Hammond S.M.: Dicing and slicing: the core machinery of the RNA interference pathway. FEBS Lett., 2005; 579: 5822-5829
[PubMed]  
[36] Hayashita Y., Osada H., Tatematsu Y., Yamada H., Yanagisawa K., Tomida S., Yabate Y., Kawahara K., Sekido Y., Takahashi T.: A polycistronic microRNA cluster, miR-17-92, is overexpressed in human lung cancers and enhances cell proliferation. Cancer Res., 2005; 65: 9628-9632
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[37] Höck J., Meister G.: The Argonaute protein family. Genome Biol., 2008; 9: 210
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[38] Iorio M.V., Ferracin M., Liu C.G., Veronese A., Spizzo R., Sabbioni S., Magri E., Pedriali M., Fabbri M., Campiglio M., Ménard S., Palazzo J.P., Rosenberg A., Musiani P., Volinia S., Nenci I., Calin G.A., Querzoli P., Negrini M., Croce C.M.: MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer. Cancer Res., 2005; 65: 7065-7070
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[39] Jackson A.L., Burchard J., Schelter J., Chau B.N., Cleary M., Lim L., Linsley P.S.: Widespread siRNA "off-target" transcript silencing mediated by seed region sequence complementarity. RNA, 2006; 12: 1179-1187
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[40] Jagannath A., Wood M.: RNA interference based gene therapy for neurological disease. Brief Funct. Genomic. Proteomic., 2007; 6: 40-49
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[41] Johnson S.M., Grosshans H., Shingara J., Byrom M., Jarvis R., Cheng A., Labourier E., Reinert K.L., Brown D., Slack F.J.: RAS is regulated by the let-7 microRNA family. Cell, 2005; 120: 635-647
[PubMed]  
[42] Kang S., Hong S.: Molecular pathogenesis of spinocerebellar ataxia type 1 disease. Mol. Cells, 2009; 27: 621-627
[PubMed]  
[43] Kawakami S., Hashida M.: Targeted delivery systems of small interfering RNA by systemic administration. Drug Metab. Pharmacokinet., 2007; 22: 142-151
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[44] Khaliq S., Khaliq S.A., Zahur M., Ijaz B., Jahan S., Ansar M., Riazuddin S., Hassan S.: RNAi as a new therapeutic strategy against HCV. Biotechnol. Adv., 2010; 28: 27-34
[PubMed]  
[45] Kumar L.D., Clarke A.R.: Gene manipulation through the use of small interfering RNA (siRNA): from in vitro to in vivo applications. Adv. Drug Deliv. Rev., 2007; 59: 87-100
[PubMed]  
[46] Laraki G., Clerzius G., Daher A., Melendez-Pena C., Daniels S., Gatignol A.: Interactions between the double-stranded RNA-binding proteins TRBP and PACT define the Medipal domain that mediates protein-protein interactions. RNA Biol., 2008; 5: 92-103
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[47] Lawrie C.H., Soneji S., Marafioti T., Cooper C.D., Palazzo S., Paterson J.C., Cattan H., Enver T., Mager R., Boultwood J., Wainscoat J.S., Hatton C.S.: MicroRNA expression distinquishes between germinal center B cell-like and activated B cell-like subtypes of diffuse large B cell lymphoma. Int. J. Cancer, 2007; 121: 1156-1161
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[48] Lee N.S., Rossi J.J.: Control of HIV-1 replication by RNA interference. Virus Res., 2004; 102: 53-58
[PubMed]  
[49] Lee Y., Hur I., Park S.Y., Kim Y.K., Suh M.R., Kim V.N.: The role of PACT in the RNA silencing pathway. EMBO J., 2006; 25: 522-532
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[50] Li W., Cha L.: Predicting siRNA efficiency. Cell. Mol. Life Sci., 2007; 64: 1785-1792
[PubMed]  
[51] Lima R.T., Martins L.M., Guimaraes J.E., Sambade C., Vasconcelos M.H.: Specific downregulation of bcl-2 and xIAP by RNAi enhances the effects of chemotherapeutic agents in MCF-7 human breast cancer cells. Cancer Gene Ther., 2004; 11: 309-316
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[52] Lin X., Ruan X., Anderson M.G., McDowell J.A., Kroeger P.E., Fesik S.W., Shen Y.: siRNA-mediated off-target gene silencing triggered by a 7 nt complementation. Nucleic Acids Res., 2005; 33: 4527-4535
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[53] Liu B.: Exploring cell type-specific internalizing antibodies for targeted delivery of siRNA. Brief Funct. Genomic. Proteomic., 2007; 6: 112-119
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[54] Liu X., Fortin K., Mourelatos Z.: MicroRNAs: biogenesis and molecular functions. Brain Pathol., 2008; 18: 113-121
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[55] Liu Y.P., von Eije K.J., Schopman N.C., Westerink J.T., ter Brake O., Haasnoot J., Berkhout B.: Combinatorial RNAi against HIV-1 using extended short hairpin RNAs. Mol. Ther., 2009; 17: 1712-1723
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[56] Ludwig L.B.: RNA silencing and HIV: a hypothesis for the etiology of the severe combined immunodeficiency induced by the virus. Retrovirology, 2008; 5: 79
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[57] Lynam-Lennon N., Maher S.G., Reynolds J.V.: The roles of microRNA in cancer and apoptosis. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc., 2009; 84: 55-71
[PubMed]  
[58] Ma Y., Chan C.Y., He M.L.: RNA interference and antiviral therapy. World J. Gastroenterol., 2007; 13: 5169-5179
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[59] Manoharan M.: RNA interference and chemically modified small interfering RNAs. Curr. Opin. Chem. Biol., 2004; 8: 570-579
[PubMed]  
[60] Meister G.: miRNAs get an early start on translational silencing. Cell, 2007; 131: 25-28
[PubMed]  
[61] Morille M., Passirani C., Vonarbourg A., Clavreul A., Benoit J.P.: Progress in developing cationic vectors for non-viral systemic gene therapy against cancer. Biomaterials, 2008; 29: 3477-3496
[PubMed]  
[62] Morris K.V., Rossi J.J.: Lentiviral-mediated delivery of siRNAs for antiviral therapy. Gene Ther., 2006; 13: 553-558
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[63] Napoli C., Lemieux C., Jorgensen R.: Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into Petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans. Plant Cell, 1990; 2: 279-289
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[64] Nevozhay D., Kańska U., Budzyńska R., Boratyński J.: Współczesny stan badań nad koniugatami i innymi systemami dostarczania leków w leczeniu schorzeń nowotworowych i innych jednostek chorobowych. Postepy Hig. Med. Dośw., 2007; 61: 350-360
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[65] Nimesh S., Goyal A., Pawar V., Jayaraman S., Kumar P., Chandra R., Singh Y., Gupta K.C.: Polyethylenimine nanoparticles as efficient transfecting agents for mammalian cells. J. Control. Release, 2006; 110: 457-468
[PubMed]  
[66] O'Donnell K.A., Wentzel E.A., Zeller K.I., Dang C.V., Mendell J.T.: c-Myc-regulated microRNAs modulate E2F1 expression. Nature, 2005; 435: 839-843
[PubMed]  
[67] Orlacchio A., Bernardi G., Orlacchio A., Martino S.: RNA interference as a tool for Alzheimer's disease therapy. Mini Rev. Med. Chem., 2007; 7: 1166-1176
[PubMed]  
[68] Ortiz A., Killian J.A., Verkleij A.J., Wilschut J.: Membrane fusion and the lamellar-to-inverted-hexagonal phase transition in cardiolipin vesicle systems induced by divalent cations. Biophys. J., 1999; 77: 2003-2014
[PubMed]  
[69] Ouellet D.L., Perron M.P., Gobeil L.A., Plante P., Provost P.: MicroRNAs in gene regulation: when the smallest governs it all. J. Biomed. Biotechnol., 2006; 2006: 69616
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[70] Pallante P., Visone R., Ferracin M., Ferraro A., Berlingieri M.T., Troncone G., Chiappetta G., Liu C.G., Santoro M., Negrini M., Croce C.M., Fusco A.: MicroRNA deregulation in human thyroid papillary carcinomas. Endocr. Relat. Cancer, 2006; 13: 497-508
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[71] Raoul C., Barker S.D., Aebischer P.: Viral-based modelling and correction of neurodegenerative diseases by RNA interference. Gene Ther., 2006; 13: 487-495
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[72] Ray R.B., Kanda T.: Inhibition of HCV replication by small interfering RNA. Methods Mol. Biol., 2009; 510: 251-262
[PubMed]  
[73] Reischl D., Zimmer A.: Drug delivery of siRNA therapeutics: potentials and limits of nanosystems. Nanomedicine, 2009; 5: 8-20
[PubMed]  
[74] Rosenfeld N., Aharonov R., Meiri E., Rosenwald S., Spector Y., Zepeniuk M., Benjamin H., Shabes N., Tabak S., Levy A., Lebanony D., Goren Y., Silberschein E., Targan N., Ben-Ari A., Gilad S., Sion-Vardy N., Tobar A., Feinmesser M., Kharenko O., Nativ O., Nass D., Perelman M., Yosepovich A., Shalmon B., Polak-Charcon S., Fridman E., Avniel A., Bentwich I., Bentwich Z., Cohen D., Chajut A., Barshack I.: MicroRNAs accurately identify cancer tissue origin. Nat. Biotechnol., 2008; 26: 462-469
[PubMed]  
[75] Rouhi A., Mager D.L., Humphries R.K., Kuchenbauer F.: MiRNAs, epigenetics, and cancer. Mamm. Genome, 2008; 19: 517-525
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[76] Scherer L., Rossi J.J., Weinberg M.S.: Progress and prospects: RNA-based therapies for treatment of HIV infection. Gene Ther., 2007; 14: 1057-1064
[PubMed]  
[77] Shi M., Guo N.: MicroRNA expression and its implications for the diagnosis and therapeutic strategies of breast cancer. Cancer Treat. Rev., 2009; 35: 328-334
[PubMed]  
[78] Shrey K., Suchit A., Nishant M., Vibha R.: RNA interference: emerging diagnostics and therapeutics tool. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2009; 386: 273-277
[PubMed]  
[79] Shrivastava N., Srivastava A.: RNA interference: an emerging generation of biologicals. Biotechnol. J., 2008; 3: 339-353
[PubMed]  
[80] Simoes S., Moreira J.N., Fonseca C., Düzgünes N., de Lima M.C.: On the formulation of pH-sensitive liposomes with long circulation times. Adv. Drug Deliv. Rev., 2004; 56: 947-965
[PubMed]  
[81] Sioud M.: Induction of inflammatory cytokines and interferon responses by double stranded and single-stranded siRNAs is sequence-dependent and requires endosomal localization. J. Mol. Biol., 2005; 348: 1079-1090
[PubMed]  
[82] Sioud M.: Innate sensing of self and non-self RNAs by Toll-like receptors. Trends Mol. Med., 2006; 12: 167-176
[PubMed]  
[83] Sioud M.: RNA interference and innate immunity. Adv. Drug Deliv. Rev., 2007; 59: 153-163
[PubMed]  
[84] Sioud M., Furset G., Cekaite L.: Suppression of immunostimulatory siRNA-driven innate immune activation by 2'-modified RNAs. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2007; 361: 122-126
[PubMed]  
[85] Sledz C.A., Williams B.R.: RNA interference and double-stranded-RNA-activated pathways. Biochem. Soc. Trans., 2004; 32: 952-956
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[86] Song E., Zhu P., Lee S.K., Chowdhury D., Kussman S., Dykxhoorn D.M., Feng Y., Palliser D., Weiner D.B., Shankar P., Marasco W.A., Lieberman J.: Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors. Nat. Biotechnol., 2005; 23: 709-717
[PubMed]  
[87] Sumimoto H., Yamagata S., Shimizu A., Miyoshi H., Mizuguchi H., Hayakawa T., Miyagishi M., Taira K., Kawakami Y.: Gene therapy for human small-cell lung carcinoma by inactivation of Skp-2 with virally mediated RNA interference. Gene Ther., 2005; 12: 95-100
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[88] Sui H.Y., Zhao G.Y., Huang J.D., Jin D.Y., Yuen K.Y., Zheng B.J.: Small interfering RNA targeting M2 gene induces effective and long term inhibition of influenza A virus replication. PLoS One, 2009; 4: e5671
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[89] Takamizawa J., Konishi H., Yanagisawa K., Tomida S., Osada H., Endoh H., Harano T., Yatabe Y., Nagino M., Nimura Y., Mitsudomi T., Takahashi T.: Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival. Cancer Res., 2004; 64: 3753-3756
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[90] Tomar R.S., Matta H., Chaudhary P.M.: Use of adeno-associated viral vector for delivery of small interfering RNA. Oncogene, 2003; 22: 5712-5715
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[91] Tompkins S.M., Lo C.Y., Tumpey T.M., Epstein S.L.: Protection against lethal influenza virus challenge by RNA interference in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004; 101: 8682-8686
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[92] Tseng Y.C., Mozumdar S., Huang L.: Lipid-based systemic delivery of siRNA. Adv. Drug Deliv. Rev., 2009; 61: 721-731
[PubMed]  
[93] Valencia-Sanchez M.A., Liu J., Hannon G.J., Parker R.: Control of translation and mRNA degradation by miRNAs and siRNAs. Genes Dev., 2006; 20: 515-524
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[94] Wang X.L., Ramusovic S., Nguyen T., Lu Z.R.: Novel polymerizable surfactants with pH-sensitive amphiphilicity and cell membrane disruption for efficient siRNA delivery. Bioconjug. Chem., 2007; 18: 2169-2177
[PubMed]  
[95] Wang X.L., Xu R., Lu Z.R.: A peptide-targeted delivery system with pH-sensitive amphiphilic cell membrane disruption for efficient receptor-mediated siRNA delivery. J. Control. Release, 2009; 134: 207-213
[PubMed]  
[96] Watanabe T., Umehara T, Kohara M.: Therapeutic application of RNA interference for hepatitis C virus. Adv. Drug Deliv. Rev., 2007; 59: 1263-1276
[PubMed]  
[97] Wu L., Belasco J.G.: Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs. Mol. Cell, 2008; 29: 1-7
[PubMed]  
[98] Wu W., Sun M., Zou G.M., Chen J.: MicroRNA and cancer: current status and prospective. Int. J. Cancer, 2007; 120: 953-960
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[99] Wyszko E., Szaflarski W., Barciszewski J.: Interferencyjny RNA - molekularny regulator ekspresji genu. Postepy Biochem., 2003; 49: 2-8
[PubMed]  
[100] Xia L., Zhang D., Du R., Pan Y., Zhao L., Sun S., Hong L., Liu J., Fan D.: miR-15b and miR-16 modulate multidrug resistance by targeting BCL2 in human gastric cancer cells. Int. J. Cancer, 2008; 123: 372-379
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[101] Xiao H., Wu Z., Shen H., Luo A.L., Yang Y.F., Li X.B., Zhu D.Y.: In vivo reversal of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance by efficient delivery of stealth RNAi. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol., 2008; 103: 342-348
[PubMed]  
[102] Xu Y., Szoka F.C. Jr.: Mechanism of DNA release from cationic liposome/DNA complexes used in cell transfection. Biochemistry, 1996; 35: 5616-5623
[PubMed]  
[103] Yamato K., Yamada T., Kizaki M., Ui-Tei K., Natori Y., Fujino M., Nishihara T., Ikeda Y., Nasu Y., Saigo K., Yoshinouchi M.: New highly potent and specific E6 and E7 siRNAs for treatment of HPV16 positive cervical cancer. Cancer Gene Ther., 2008; 15: 140-153
[PubMed]  
[104] Yeom K.H., Lee Y., Han J., Suh M.R., Kim V.N.: Characterization of DGCR8/Pasha, the essential cofactor for Drosha in primary miRNA processing. Nucleic Acids Res., 2006; 34: 4622-4629
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[105] Yeung M.L., Bennasser Y., Le S.Y., Jeang K.T.: siRNA, miRNA and HIV: promises and challenges. Cell Res., 2005; 15: 935-946
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[106] Zhang B., Pan X., Cobb G.P., Anderson T.A.: microRNAs as oncogenes and tumor suppressors. Dev. Biol., 2007; 302: 1-12
[PubMed]  
[107] Zhang L., Volinia S., Bonome T., Calin G.A., Greshock J., Yang N., Liu C.G., Giannakakis A., Alexiou P., Hasegawa K., Johnstone C.N., Megraw M.S., Adams S., Lassus H., Huang J., Kaur S., Liang S., Sethupathy P., Leminen A., Simossis V.A., Sandaltzopoulos R., Naomoto Y., Katsaros D., Gimotty P.A., DeMichele A., Huang Q., Bützow R., Rustgi A.K., Weber B.L., Birrer M.J., Hatzigeorgiou A.G., Croce C.M., Coukos G.: Genomic and epigenetic alterations deregulate microRNA expression in human epithelial ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008; 105: 7004-7009
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[108] Zhang Y., Li M., Wang H., Fisher W.E., Lin P.H., Yao Q., Chen C.: Profiling of 95 microRNAs in pancreatic cancer cell lines and surgical specimens by real-time PCR analysis. World J. Surg., 2009; 33: 698-709
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[109] Zhou K., He H., Wu Y., Duan M.: RNA interference of avian influenza virus H5N1 by inhibiting viral mRNA with siRNA expression plasmids. J. Biotechnol., 2008; 135: 140-144
[PubMed]  
[110] Zimmermann T.S., Lee A.C., Akinc A., Bramlage B., Bumcrot D., Fedoruk M.N., Harborth J., Heyes J.A., Jeffs L.B., John M., Judge A.D., Lam K., McClintock K., Nechev L.V., Palmer L.R., Racie T., Röhl I., Seiffert S., Shanmugam S., Sood V., Soutschek J., Toudjarska I., Wheat A.J., Yaworski E., Zedalis W., Koteliansky V., Manoharan M., Vornlocher H.P., MacLachlan I.: RNAi-mediated gene silencing in non-human primates. Nature, 2006; 441: 111-114
[PubMed]  
[111] Zuhorn I.S., Bakowsky U., Polushkin E., Visser W.H., Stuart M.C., Engberts J.B., Hoekstra D.: Nonbilayer phase of lipoplex-membrane mixture determines endosomal escape of genetic cargo and transfection efficiency. Mol. Ther., 2005; 11: 801-810
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.