Postepy Hig Med Dosw. (online), 2010; 64: 396-407
Review
Full Text PDF  

Farmakologiczna aktywacja supresora nowotworu, natywnego białka p53 jako obiecująca strategia zwalczania nowotworów
Pharmacological activation of tumor suppressor, wild-type p53 as a promising strategy to fight cancer
Alicja Sznarkowska, Robert Olszewski, Joanna Zawacka-Pankau
Katedra Biotechnologii, Pracownia Diagnostyki Molekularnej, Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii, Uniwersytetu Gdańskiego i Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego
Adres do korespondencji
dr Joanna Zawacka-Pankau, Katedra Biotechnologii, Pracownia Diagnostyki Molekularnej, Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii Uniwersytetu Gdańskiego i Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk; e-mail: jzawacka@biotech.ug.gda.pl

Źródło finansowania
Praca współfinansowana z grantu na badania własne Ministra Nauki i Szkolnictwa Wyższego nr 6126/B/PO1/2010/38

Otrzymano:  2010.04.28
Zaakceptowano:  2010.07.12
Opublikowano:  2010.08.20

Streszczenie
Potężny supresor nowotworów - białko p53 jest czynnikiem transkrypcyjnym, odgrywającym główną rolę w inicjacji odpowiedzi komórki na bodźce stresowe, głównie uszkodzenie DNA, niedotlenienie oraz nieprawidłowe sygnały proliferacyjne np. aktywacja onkogenu. Od odkry­cia, trzydzieści jeden lat temu, p53 kojarzone jest z nowotworzeniem, gdyż wykazano zwiększo­ne jego ilości w transformowanych nowotworowo komórkach. Stres komórkowy powoduje stabi­lizację białka p53, a zależnie od poziomu stresu dochodzi do zahamowania cyklu komórkowego bądź do eliminacji komórek nieodwracalnie uszkodzonych w procesie apoptozy. Białko p53 ule­ga inaktywacji w ponad 50% przypadków nowotworów w wyniku wzmożonej degradacji prote­asomalnej lub też przez inaktywujące mutacje punktowe w jego genie. W licznych doniesieniach wykazano, iż związki niskocząsteczkowe wyodrębnione za pośrednictwem modelowania moleku­larnego czy też w testach biologiczno-funkcyjnych bardzo skutecznie aktywują białko p53 typu dzikiego w komórkach nowotworowych, co w rezultacie prowadzi do ich eliminacji w wyniku apoptozy zależnej od p53. W niniejszej pracy opisujemy strukturę i rolę białka p53 w komórce, a także najnowsze doniesienia, dotyczące związków o dużej aktywności przeciwnowotworowej, opartej na selektywnym przywróceniu funkcji supresorowej białka p53 w komórkach nowotwo­rowych.
Słowa kluczowe: białko supresora nowotworu p53 • białko MDM2 • kompleks p53-HDM2 • degradacja w proteasomach • apoptoza • terapia przeciwnowotworowa • związki niskocząsteczkowe


Summary
A powerful tumor suppressor - p53 protein is a transcription factor which plays a critical role in eliciting cellular responses to a variety of stress signals, including DNA damage, hypoxia and aberrant proliferative signals, such as oncogene activation. Since its discovery thirty one years ago, p53 has been connected to tumorigenesis as it accumulates in the transformed tumor cells. Cellular stress induces stabilization of p53 and promotes, depending on the stress level, cell cyc­le arrest or apoptosis in the irreversibly damaged cells. The p53 protein is found inactive in more than 50% of human tumors either by enhanced proteasomal degradation or due to the inacti­vating point mutations in its gene. Numerous data indicate that low molecular weight compo­unds, identified by molecular modeling or in the functional, cell-based assays, efficiently activate non-mutated p53 in cancer cells which in consequence leads to their elimination due to p53-de­pendent apoptosis. In this work we describe the structure and cellular function of p53 as well as the latest discoveries on the compounds with high anti-tumor activities aiming at reactivation of the tumor suppressor function of p53.
Key words: p53 tumor suppressor protein • MDM2 • p53-HDM2 complex • proteasomal degradation • apoptosis • antitumor therapy • low molecular weight compounds




Wykaz skrótów:
cDNA - sekwencja kodująca (coding DNA sequence); GADD45 - białko zatrzymania cyklu komórkowego indukowane uszkodzeniem DNA (growth arrest and DNA damage inducible protein 45); HDM2 - ludzkie białko MDM2 (human double minute 2); MDM2 - mysie białko MDM2 (murine double minute 2); mtp53 - zmutowana postać białka p53 (mutant p53); p53AIP1 - regulowane przez p53 białko indukujące apoptozę 1 (p53-regulated apoptosis-inducing protein 1); PDT - terapia fotodynamiczna (photodynamic therapy); PpIX - protoporfiryna IX; PUMA - regulowany przez p53 modulator apoptozy (p53 upregulated modulator of apoptosis); RITA - aktywacja p53 i indukcja apoptozy komórek nowotworowych (reactivation of p53 and induction of tumor cell apoptosis); wtp53 - typ „dziki" białka p53 (wild type p53).
Wprowadzenie
Już ponad 30 lat białko p53 jest w kręgu zainteresowa­nia naukowców zajmujących się problematyką nowotwo­rów u ludzi. Pierwsze odkrycia dokonane podczas badań na zwierzęcych nowotworach wywołanych przez wirusy (SV40) wskazywały, że białka p53 w komórkach nowo­tworowych jest znacznie więcej niż w prawidłowej hodowli oraz że komórki transformowane wytwarzały przeciwcia­ła przeciwko p53 [24]. W kolejnych latach potwierdzono podwyższone stężenie białka p53 także w guzach innego pochodzenia (adenowirusy, HPV). Doprowadziło to do po­stawienia tezy, że gen TP53 może być onkogenem a nad­mierne wytwarzanie białka p53 prowadzi do transformacji nowotworowej. Po klonowaniu cDNA i genu TP53 zarów­no komórek zdrowych, jak i transformowanych, przetesto­wano ich aktywności [37]. Stwierdzono, że cDNA białka p53 może immortalizować komórki, a także całkowicie je transformować, przy jednoczesnym wprowadzeniu on­kogenu Ras. TP53 został ogłoszony onkogenem. Pięć lat później udowodniono, że białko p53 blokuje transformację szczurzych fibroblastów, a w 1990 roku powiązano muta­cje w genie TP53 z zespołem dziedzicznej predyspozycji do powstawania nowotworów Li-Fraumeni [16].
Główną rolą białka p53 jest zabezpieczenie komórek przed zmianami w genomie, wynikającymi z szeroko pojętych uszkodzeń DNA i obejmującą przede wszystkim zatrzy­manie cyklu komórkowego, indukcję apoptozy i starzenie się komórek. Wprowadzenie allelu genu TP53 z mutacją zerową (null mutation) do mysich komórek macierzystych za pośrednictwem rekombinacji homologicznej, spowodo­wało spontaniczne rozwinięcie różnych typów nowotworów u 75% osobników o fenotypie p53(-/-) przed 6 miesiącem życia [15]. Natomiast wprowadzenie genu, kodującego typ „dziki" białka p53 (wtp53) do mysiej linii białaczki mie­locytarnej pozbawionej aktywnego białka p53, spowodo­wało drastyczny spadek żywotności komórek i pojawie­nie się znamion apoptozy w postaci fragmentacji jądra, kondensacji chromatyny i fragmentacji DNA [52]. W dal­szych badania dowiedziono, że białko p53 reguluje eks­presję, lokalizację i aktywność głównych efektorów pro­cesu apoptozy [31].
Badania z zastosowaniem modeli mysich dowiodły, że przywrócenie endogennego wytwarzania białka p53 pro­wadzi do regresji nowotworów, a mechanizm za to odpo­wiedzialny zależy od typu nowotworu. W przypadku chło­niaka, konsekwencją przywrócenia aktywności białka p53 jest apoptoza komórek nowotworowych, natomiast w przy­padku nowotworu wątroby i mięsaka, dochodzi do zatrzy­mania wzrostu i pojawienia się znamion starzenia komó­rek nowotworowych [48].
Terapię genową ludzkim cDNA, kodującym białko p53 za­stosowano u kobiety z zespołem Li-Fraumeni, cierpiącej na nowotwór komórek z warstwy ziarnistej, przerzutujący do wielu organów [40]. Siedem dni po iniekcji cDNA p53 zaobserwowano wzrost ekspresji białka p53, a także biał­ka p21, wpływającego na zatrzymanie cyklu komórkowego i będącego pod kontrolą transkrypcyjną białka p53. Co wię­cej, zanotowano również wzrost poziomu aktywnej kaspa­zy 3 - molekularnego markera apoptozy oraz spadek po­ziomu inhibitora apoptozy - białka Bcl-2. Zaobserwowano ponadto trwałą, całkowitą remisję nakłutego guza, pod­czas gdy nietraktowane guzy wykazały znaczącą progre­sję. W związku z powyższym, farmakologiczne przywró­cenie aktywności białka p53 wydaje się więc stanowić obiecującą strategię przeciwnowotworową.
Inaktywacja białka p53 w komórkach nowotworowych jest zjawiskiem powszechnym, przebiegającym w wyniku dzia­łania dwóch głównych mechanizmów - w około 50% przy­padków dochodzi do punktowych mutacji w genie TP53, prowadzących do powstania nieaktywnego transkrypcyj­nie białka, a w pozostałych przypadkach obserwuje się zaburzenia regulacji białka p53 przez jego główny nega­tywny regulator w komórce - białko MDM2 [49]. Z tego też powodu wydaje się więc, iż w ponad 50% przypad­ków przywrócenie funkcji białka p53 umożliwiłoby re­misję nowotworu (wyeliminowanie guza) bez konieczno­ści wykorzystywania terapii o niewielkiej selektywności, takich jak naświetlanie czy chemioterapia, które zabijają, oprócz komórek transformowanych nowotworowo, także wiele zdrowych. Byłaby to niewątpliwa korzyść takiej te­rapii, jednak funkcja białka p53 nie jest jeszcze w pełni poznana, w jego szlakach metabolicznych nadal jest kilka niewyjaśnionych interakcji oraz nie poznano wszystkich białek, z którymi p53 może oddziaływać.
Dodatkowym, bardzo ważnym problemem jest wprowa­dzenie aktywnego białka do komórek nowotworowych. Terapie genowe polegające na wprowadzaniu kopii wtp53 do genomu są w fazie testów klinicznych, jednak takie działanie nastręcza wielu problemów, np. nie wiadomo, czy wprowadzenie DNA za pomocą wektora wirusowe­go (adenowirusa) będzie skuteczne. Ponadto nie jesteśmy w stanie przewidzieć skutków integracji genu do komó­rek zdrowych (w grę wchodzą zmiany spowodowane nie­homologiczną rekombinacją wirusowego DNA do geno­mu komórki) [18].
Wydaje się więc uzasadnione poszukiwanie związków, które selektywnie indukowałyby kumulację a zarazem ak­tywację białka p53 w komórkach nowotworowych przez uwalnianie go z kompleksu z jego głównym regulatorem komórkowym, białkiem MDM2 - ligazą E3 ubikwityny. W pracy opisano najnowsze doniesienia o związkach ni­skocząsteczkowych indukujących apoptozę zależną od p53 w komórkach nowotworowych.
Budowa białka p53
Wszystkie właściwości białka p53 są zapisane w jego ge­nie. Struktura samego białka jest dość złożona biorąc pod uwagę jego niewielkie rozmiary (53 kDa), prawidłowo sfał­dowane białko p53 tworzy tetramery i dopiero w tej posta­ci uzyskuje pełnię swoich aktywności.
Gen P53 (lub TP53) u człowieka znajduje się na chromo­somie 17p13.1 (znaleziono także analogi zwierzęce np. u myszy na chromosomie 11, u szczura na 10, u psa na 5, a u świni na 12). Gen ma niewielkie rozmiary, gdyż w ca­łości liczy zaledwie 20 kbp, a same eksony (jest ich jede­naście, poprzedzielanych dziesięcioma intronami) kodują tylko 393 aminokwasy. Produkt genu zawiera siedem do­men, które spełniając swe funkcje decydują o życiu i śmier­ci komórki [19]. Gen TP53 należy do silnie konserwowa­nej rodziny genów, kodujących jeszcze przynajmniej dwa białka - p63 i p73 [55,57].
Złożoność budowy p53 odzwierciedla funkcjonalną zawi­łość ścieżek sygnalizacyjnych zależnych od tego białka. Aktywne białko p53 występuje w komórce jako tetramer złożony z czterech identycznych podjednostek zbudowa­nych z 393 aminokwasów (ryc. 1).
Ryc. 1. Struktura pierwszorzędowa białka p53 z uwzględnieniem podziału na domeny. Białko p53 składa się z trzech funkcjonalnych domen: N-terminalnej, wiążącej DNA i C-terminalnej. Domena N-terminalna składa się z poddomeny transaktywacyjnej (TAD) i rejonu bogatego w reszty prolinowe (PXXP). Domena wiążąca DNA jest odpowiedzialna za zależne od sekwencji wiązanie się białka p53 do DNA. Domena C-terminalna pełni funkcje regulatorowe; jest odpowiedzialna za tetrameryzacją białka p53; niespecyficzne oddziaływanie z DNA, a także ma miejsca wiązania białek wspomagających aktywność transkrypcyjną białka p53. Liczby oznaczają numery reszt aminokwasowych. NLS-sekwencja sygnałowa lokalizacji jądrowej (nuclear localization signal sequence); NES-sekwencja sygnałowa eksportu z jądra komórkowego (nuclear export signal sequence) (wg [56])

Każda podjednostka składa się z trzech dobrze scharakte­ryzowanych pod względem zawartości aminokwasów do­men strukturalnych: domeny N-terminalnej, rdzenia i do­meny C-terminalnej. W obrębie domeny N-terminalnej znajduje się domena transaktywacyjna (transactivating domain TAD1 i TAD2, aminokwasy 1-42) oraz rejon bo­gaty w reszty prolin (proline-rich region, 61-94), zbudo­wany z wielokrotnych powtórzeń motywu PXXP (gdzie P oznacza prolinę, a X dowolny aminokwas). Domenę tę wy­różnia to, że w białku p53 jest ona odpowiedzialna za in­dukcję apoptozy bez transaktywacji genów, czyli jedynie poprzez oddziaływania z innymi białkami. Białkiem ta­kim jest Bcl-XL (białko antyapoptotyczne mitochondriów) - białko p53 wiąże Bcl-XL w odpowiedzi na stres, np. pro­mieniowanie jonizujące i uniemożliwia ochronę mitochon­driów przed czynnikami proapoptotycznymi, takimi jak białko Bax, które promują uwolnienie cytochromu C z mi­tochondriów i śmierć apoptotyczną komórki. Dodatkowo p53 może się przyłączać do białek proapoptotycznych z ro­dziny Bcl (np. Bax) i promować ich oligomeryzację, co skutecznie promuje apoptozę. Ponadto wykazano, że biał­ko p53 bez aktywnej domeny AD2 nie może indukować apoptozy [19]. Co istotne, domena TAD zawiera trzy ami­nokwasy niezbędne do oddziaływania białka p53 z biał­kiem MDM2 (F19; W23; L26).
Rejon bogaty w proliny (61-94 aminokwasy) wiąże biał­ka zawierające domeny SH3 i pełni funkcje regulatorowe w procesie apoptozy. Dodatkowo jest mediatorem interakcji między p53 a innymi białkami [20]. Delecja tego regionu uniemożliwia p53 inicjację apoptozy na ścieżce mitochon­drialnej, choć nie hamuje transaktywacji Bax [39]. Istotną zmianą w działaniu białka p53 po delecji regionu prolino­wego jest podwyższona podatność na degradację z udzia­łem ligazy ubikwityny MDM2 [2]. Delecja tej domeny za­burza także oddziaływania p53 z genami p21WAF1/Cip1, MDM2, PIG [47].
Na rdzeń białka p53, prawie w całości składa się domena wiążąca DNA (DBD, DNA binding core domain, 102-292). Kolejnym fragmentem białka jest koniec C-terminalny, w którym możemy znaleźć trzy swoiste fragmenty:
• NLS i NES - NLS (nuclear localization signals) to trzy sygnały, które umożliwiają białku dostanie się do we­wnątrz jądra, a NES (nuclear export signal) to sekwen­cje umożliwiające białku wydostanie się z jądra do cyto­plazmy. Są one konieczne, ponieważ białko bierze udział w procesach jądrowych, cytoplazmatycznych oraz mi­tochondrialnych.
• Fragment TET - zbudowany z łańcucha beta, za któ­rym znajduje się alfa helisa - takie połączenie umoż­liwia białku p53 dimeryzację a następnie dimeryzację dimerów, przez co powstaje tetramer, czyli właściwa, aktywna postać białka.
• Fragment wiążący nieswoiście DNA - sekwencja z jed­nej strony wiążąca się do uszkodzonego DNA i promują­ca jego naprawę lub śmierć komórki, a z drugiej zmniej­szająca powinowactwo rdzenia białka do DNA (wiązanie fragmentów transaktywacyjnych na DNA jest silniejsze niż wiązanie fragmentów niespecyficznych dla p53, dla­tego musi zostać atenuowane, aby możliwe było znaj­dowanie uszkodzeń) [49].
Na złożoność budowy białka p53 wpływają dodatkowo liczne modyfikacje potranslacyjne, z których najważniej­szymi wydają się fosforylacja, acetylacja i ubikwitynacja [6,56]. Zależne od miejsca i czasu modyfikacje odpowied­nich reszt aminokwasowych wpływają na aktywność i czas półtrwania białka p53, będąc jednocześnie markerami od­powiedzi stresowej komórki.
Funkcja i regulacja białka p53 wkomórce
Aktywność transkrypcyjna
Domena centralna wiążąca DNA (DBD) białka p53 wy­kazuje duże powinowactwo do konsensusowych sekwencji DNA, do których się przyłącza, natomiast C-terminalna do­mena zasadowa wiąże DNA nieswoiście [25].
Należy zaznaczyć, że białko p53 w prawidłowej komórce niepoddanej żadnemu stresowi jest nieaktywne - związane z białkiem MDM2, który promuje ubikwitynację p53 i jego degradację w proteasomach. Istotne zatem jest to w jaki sposób dochodzi do jego aktywacji. Krytycznym momen­tem w aktywacji p53 jest fosforylacja końca N-terminalnego przez kinazy białkowe. Ufosforylowane p53 nie podlega ubikwitynacji, więc czas jego życia w komórce znacznie się zwiększa, a biorąc pod uwagę wysoki poziom trans­krypcji genu P53, w szybkim czasie prowadzi to do nagro­madzenia się dużej ilości białka w komórce [38].
Od odkrycia pierwszych genów znajdujących się pod kon­trolą transkrypcyjną białka p53 we wczesnych latach dzie­więćdziesiątych ub.w., ich lista bardzo wzrosła i ciągle się wydłuża. Znajdują się na niej geny zaangażowane w za­trzymanie cyklu komórkowego, naprawę DNA, a także apoptozę i starzenie się komórek. Geny, których ekspresja ulega indukcji na skutek aktywności białka p53, to m.in. CDKN1A (kodujący białko p21Waf1/Cip1, decydujące o zatrzy­maniu cyklu komórkowego w fazie G1), GADD45 (growth arrest and DNA damage inducible gene) oraz liczne geny, których produkty są zaangażowane w proces apoptozy: BAX (Bcl-2-associated X protein), DR5/KILLER (death receptor 5), CD95 (cell-death signaling receptor), PIG3 (p53-inducible gene), PUMA (p53-upregulated modula­tor of apoptosis), NOXA i wiele innych. Oprócz pośred­niej lub bezpośredniej aktywacji transkrypcji, białko p53 może również indukować represję transkrypcji niektórych genów. Ich produktami są białka, takie jak Bcl-2, Bcl-X, cyklina B1 czy MAP4 (microtubule associated protein 4) oraz surwiwina [20].
Inicjacja transkrypcji przez białko p53 rozpoczyna się przez jego związanie do sekwencji konsensusowej DNA. Sekwencje te składają się z dwóch palindromowych ele­mentów o długości 10 pz. i budowie PuPuPuCA/TA/AGPyPyPy (Pu to puryna, a Py to pirymidyna), oddzielo­nych rejonem spacerowym o długości 0-13 nukleotydów [20]. Mechanizm, dzięki któremu białko p53 promuje trans­krypcję, opiera się na założeniu, że region promotorowy genu, którego transkrypcję ma regulować białko p53, jest zazwyczaj niedostępny dla głównych czynników trans­krypcyjnych i polimerazy RNA. Związanie białka p53 do sekwencji konsensusowej w obrębie rejonu promotoro­wego umożliwiłoby otwarcie promotora poprzez rekruta­cję czynników remodelujących chromatynę lub transace­tylazy histonów i/lub metylotransferazy. Oddziaływanie białka p53 z transacetylazą histonów, białkiem p300 oraz metylotransferazami PRMT1 i CARM1, zostało bardzo dobrze udokumentowane. Dlatego też modyfikacje histo­nów i w konsekwencji zmiany w strukturze i funkcjonowa­niu chromatyny, wydają się jednym z głównych następstw związania się białka p53 do jego sekwencji konsensuso­wych. Dodatkowo udowodniono, że białko p53 ułatwia for­mowanie kompleksu preinicjacyjnego oraz bezpośrednio stymuluje transkrypcję poprzez rekrutację głównych czyn­ników transkrypcyjnych, takich jak TFIIA i TFIID [25].
Represja transkrypcji przez białko p53 nie jest dokładnie poznana, choć opisuje się możliwe mechanizmy. Pierwszy opiera się na bezpośredniej interakcji z czynnikami trans­krypcyjnymi, co uniemożliwia aktywację promotora. Drugi polega na usunięciu czynników transkrypcyjnych z rejonu promotorowego, jeśli sekwencje DNA, do których się wią­żą, przylegają lub nachodzą na konsensusowe sekwencje wiązania białka p53. Białko p53 może również interfero­wać ze składaniem machiny transkrypcyjnej oraz rekru­tować deacetylazy histonów, co w efekcie prowadzi do re­presji transkrypcji [24].
Oprócz oddziaływania z DNA, białko p53 może oddziały­wać z innymi białkami komórkowymi. Interakcje te odpo­wiadają m.in. za inhibicję i aktywację białka p53, a także za wypełnianie niektórych funkcji białka p53 - np. induk­cję śmierci apoptotycznej na ścieżce mitochondrialnej.
Rola białka p53 w regulacji procesów wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych
Białko p53 reguluje wiele procesów i jest zaangażowane w utrzymanie stabilności genetycznej komórki nie tylko przez indukcję zahamowania proliferacji komórek i areszt cyklu komórkowego połączone z naprawą DNA, ale także w wyniku zapoczątkowania procesu apoptozy, który elimi­nuje zmienione genetycznie komórki z organizmu. Procesy wewnątrzkomórkowe regulowane przez p53 to m.in. sta­rzenie komórki, przechodzenie przez kolejne punkty kon­trolne cyklu komórkowego (p53 może zatrzymać komór­kę na dwóch punktach kontrolnych cyklu komórkowego G1/S oraz G2/M), naprawa DNA, indukcja apoptozy (p53 determinuje, zależnie od stopnia nasilenia stresu i wielko­ści uszkodzenia, czy komórka zostanie zatrzymana w cy­klu komórkowym i rozpocznie naprawę uszkodzonego DNA, czy wejdzie w stadium apoptozy - jeśli uszkodze­nie jest zbyt poważne), a także - według najnowszych do­niesień - nadmierne wytwarzanie pigmentu w komórkach skóry i wytwarzanie opalenizny. Głównym celem działań zewnątrzkomórkowych białka p53 jest hamowanie angio­genezy i indukcja szoku tlenowego.
Białko p53 odgrywa główną rolę w indukcji apoptozy. Kontroluje ono główne szlaki indukcji apoptotycznej śmier­ci komórkowej. Wykazano, że inicjacja apoptozy może za­chodzić w dwojaki sposób: w wyniku transaktywacji, bądź oddziaływań z innymi białkami komórki. Wykazano też, że bez aktywności transaktywacyjnej białko p53 jest w stanie zainicjować apoptozę, co doprowadziło do stwierdzenia, że w przypadku indukcji śmierci komórkowej (a także za­trzymania cyklu komórkowego), oddziaływania typu biał­ko-białko pełnią w zasadzie pomocniczą rolę przyspiesza­jąc kilkakrotnie proces transkrypcyjny [9].
Pierwszym zidentyfikowanym, aktywowanym przez p53 genem, jest gen bax, proapoptotyczny członek rodzi­ny Bcl-2. W ciągu kilku lat odnaleziono kolejne - Noxa [36] oraz PUMA [53], oba działające jako białka pomoc­nicze w procesie śmierci apoptotycznej na ścieżce mito­chondrialnej. Białka powstające po aktywacji promotorów tych genów, wraz z produktem genu p53AIP1, są trans­portowane do mitochondriów i powodują otwarcie porów w błonie wewnętrznej. Otwarcie porów powoduje zabu­rzenia fosforylacji oksydacyjnej, spadek potencjału elek­trochemicznego na błonie mitochondrialnej oraz uwolnie­nie cytochromu c. Zdarzenia te powodują całkowitą utratę funkcji mitochondriów oraz aktywację kaskady Apaf1/ka­spaza 9. Kaspazy to proteazy cysteinowe, które nieswoiście tną białka powodując degradację wnętrza komórki i w re­zultacie jej śmierć [4].
Następną grupą genów, aktywującą p53 to PIGs (p53 in­duced genes), które kodują białka enzymatyczne odpo­wiedzialne za kontrolę reakcji typu redox w komórce. Reaktywne formy tlenu (ROS) wytwarzane przez PIGs uszkadzają mitochondria, co indukuje apoptozę. Substancje antyoksydacyjne potrafią zahamować zależną od p53 apop­tozę, a także cofnąć zmiany wywołane w błonie mito­chondrialnej (przywrócić potencjał błonowy oraz zamknąć pory). Dodatkowo, p53 może być transportowane do mitochondriów, gdzie indukuje apoptozę niezależnie od transkrypcji [28].
Białko p53 jest także zaangażowane w ścieżkę zależną od błonowych receptorów śmierci. Już w latach dziewięć­dziesiątych ubiegłego stulecia wykazano, że p53 wzmaga ekspresję genów kodujących receptory śmierci, takie jak FAS/APO1, DR5/KILLER, a także liganda jednego z tych receptorów - FASL. Promotor genu DR5 okazał się bezpo­średnio aktywowanym przez p53, natomiast ekspresja na powierzchni komórki receptora FAS jest promowana przez zwiększenie jego transportu z aparatu Golgiego do błony komórkowej [41]. Aktywacja receptorów śmierci prowadzi do ich trimeryzacji i inicjacji kaskady kaspaz. Dodatkowo aktywacja PIDD - białka zawierającego domenę śmierci - przez p53 również prowadzi do apoptozy podobnej do ścieżki receptorów śmierci.
Dodatkową funkcją białka p53 w aktywacji procesów apop­totycznych jest hamowanie transkrypcji czynników wzro­stowych i promujących przeżycie komórki. Do czynników takich należą m.in. IGF1 (insulin-like growth factor 1) in­sulinopodobny czynnik wzrostu, surwiwiny - białka nale­żące do rodziny IAP (inhibitor of apoptosis protein), które powodują inhibicję aktywacji kaspaz, przez co negatyw­nie regulują procesy proapoptotyczne, a także hamują ak­tywność telomeraz.
Zależne od p53 zatrzymanie cyklu komórkowego jest ściśle związane z funkcją transaktywacyjną tego białka. Spośród wielu celów transaktywacji białka p53, p21WAF1/Cip1 jest tym, który zasługuje na uwagę. Aktywowany gen generuje pro­dukt białkowy, mający zdolność do zatrzymania cyklu ko­mórkowego zarówno w fazie G1, jak i G2. P21WAF1/Cip1 nale­ży do rodziny CDK (cyclin dependent kinase), czyli kinaz zależnych od cyklin. Indukcja zatrzymania cyklu komór­kowego przebiega w sposób analogiczny do przebiegu za­trzymania cyklu komórkowego po aktywacji białka p53. Komórki z delecją genu p21WAF1/Cip1 nie mają możliwości zatrzymania cyklu komórkowego na żadnym punkcie kon­trolnym, dokładnie tak, jak komórki z nieaktywnym biał­kiem p53 [50,58].
Ważnym białkiem biorącym udział w zatrzymaniu cyklu komórkowego jest 14-3-3 sigma. Czynnik ten bierze udział w transdukcji sygnału (jak cała rodzina białek 14-3-3), m.in. poprzez przyłączanie i oddzielanie ufosforylowanych bia­łek (rozdzielanie agregatów, rozłączanie kompleksów biał­kowych). Białko 14-3-3 sigma pełni istotną rolę w utrzy­maniu aresztu cyklu komórkowego. Badania wykazały, że komórki, w których gen białka został usunięty, potrafi­ły zainicjować areszt G2, ale nie potrafiły go utrzymać na tyle długo, aby mogło dojść do efektywnej naprawy DNA [10]. Białka z rodziny 14-3-3 mogą się wiązać do p53 i ak­tywować jego funkcje transaktywacyjne, zwłaszcza po ir­radiacji promieniowaniem jonizującym. Aktywacja p53 zapobiega wznowieniu cyklu komórkowego w uszkodzo­nych komórkach [51].
To, czy komórka przejdzie proces apoptozy, czy zostanie zatrzymana w cyklu komórkowym zależy od wielu czyn­ników, m.in. od pozakomórkowych czynników przeżycio­wych (np. IGF), zmian nowotworowych w komórce, do­stępności czynników i kofaktorów transkrypcyjnych. Jednak białko p53 wpływa także na wybór ścieżki, którą podąży komórka. Zarówno typ, jak i intensywność stresu, które­mu poddawana jest komórka ma znaczenie dla poziomu odpowiedzi wywołanej przez p53. Do indukcji apoptozy konieczny jest znacznie wyższy poziom aktywnego biał­ka p53 niż do zatrzymania komórki w cyklu, co dowodzi, że p53 słabiej wiąże się do promotorów genów proapop­totycznych, niż kontrolujących zatrzymanie cyklu komór­kowego [50].
Dodatkowo zmiana aktywności białka p53 wynika z mody­fikacji (fosforylacje, zmiany konformacyjne), którym jest ono poddawane podczas aktywacji. Fosforylacja p53 na Ser46 jest konieczna do transaktywacji proapoptotycznego genu p53AIP1 (p53-regulated apoptosis-inducing protein 1) oraz inhibicję kinazy odpowiedzialnej za fosforylację Ser46 przez WIP1 (inhibicja indukowana przez p53). Ta pętla zwrotna zapewnia kontrolę nad aktywnością białka p53 oraz zmniejsza jego aktywność proapoptotyczną [35].
Białko p53 jest nie tylko odpowiedzialne za zatrzymanie komórek w cyklu komórkowym i uniemożliwienie im po­wielania zmienionego materiału genetycznego, ale bie­rze też bezpośrednio udział w naprawie uszkodzeń DNA. Komórki bez funkcjonalnego p53 nie mają zdolności typu NER (nucleotide excision repair), naprawy DNA przez wy­cinanie nieprawidłowych nukleotydów, która jest odpowie­dzialna za naprawę po uszkodzeniach spowodowanych pro­mieniowaniem UV [50], a także BER (base excision repair) - wycinania zasad uszkodzonych przez czynniki alkilujące, wolne rodniki tlenowe lub hydrolizę [58]. Koniec C' biał­ka p53 wiąże się bezpośrednio do wielorakiego uszkodzo­nego DNA, m.in. jednoniciowego DNA, końców pęknięć podwójnej helisy DNA oraz powstałych w wyniku niepra­widłowych insercji bądź delecji „oczek" w DNA. Oprócz tego białko p53 ma aktywność egzonukleazy 3'-5', co wspomaga funkcje naprawcze.
Ważnym elementem funkcji p53 w naprawie DNA jest możliwość przyłączania się do różnych białek zaangażowa­nych w naprawę uszkodzonego DNA. Do grupy tych białek należą m.in. CSB (zależny od ATP czynnik remodelowa­nia chromatyny), Ref-1 (białko biorące udział w naprawie spontanicznych uszkodzeń DNA), XPB/ERCC3 (aktywu­je helikazy DNA). Dodatkowo p53 może wchodzić w inte­rakcje z samymi helikazami DNA - doświadczenia Linke i wsp. [27] wykazały koimmunoprecypitację z helikazami hRAD51 oraz hRAD54. Ścieżki regulowane przez białko p53 przedstawia ryc. 2.
Ryc. 2. Główne procesy komórkowe regulowane przez uaktywnione białko p53 (schemat). Indukcja białka p53 przez czynniki stresowe powoduje jego aktywację polegającą na włączeniu jego zdolności transaktywacji bądź też transrepresji genów mających odpowiednią sekwencję konsensusową. W wyniku aktywacji p53 może dojść do zahamowania cyklu komórkowego bądź też indukcji apoptozy w zależności od stopnia uszkodzenia komórki. Aktywne białko p53 może też być bezpośrednio zaangażowane w naprawę DNA

Regulacja białka p53 w komórce
W prawidłowych warunkach białko p53 jest utrzymywane w komórce na niskim poziomie i występuje w postaci nie­aktywnej. W czasie trwania cyklu komórkowego jego po­ziom jest ściśle kontrolowany. W prawidłowych komórkach, czas półtrwania białka p53 jest ograniczony do minut, pod­czas gdy w komórkach narażonych na stres lub ekspozycję na czynniki uszkadzające DNA, czas ten wydłuża się do godzin. Podwyższony poziom białka p53 jest utrzymywa­ny głównie przez wydłużenie jego czasu półtrwania [25].
Za regulację poziomu i aktywności białka p53 jest odpo­wiedzialna cała sieć komórkowych białek, takich jak WT-1, MDM2, JNK, Pirh-2, PARP-1, MDM4. Szczególnie istotne w regulacji poziomu białka p53 w komórce w świetle ostat­nich badań wydają się białka MDM2 i MDM4 (MDMX).
Gen Mdm2 (murine double minute 2) odkryto w 1987 r. jako jeden z trzech genów (Mdm1-3) ulegających koamplifika­cji w spontanicznie transformowanej linii mysiej 3T3-DM [8]. W ciągu pięciu lat udowodniono potencjał onkogen­ny Mdm2, a także wykazano, iż białko MDM2 wiąże i po­woduje inhibicję aktywności białka p53. Przedstawiono również, że ludzki homolog MDM2, białko HDM2 (hu­man double minute 2) ulega amplifikacji w guzach typu mięsak. Dalsze badania dowiodły, że Mdm2 ulega ampli­fikacji w 7,2% z 3889 ludzkich nowotworów, w których występuje typ 'dziki' białka p53 [33]. Najczęściej ampli­fikacja dotyczyła nowotworów tkanek miękkich (20%), mięsaka kościopochodnego (16%) i nowotworu przełyku (13%). Wykazano również, ze polimorfizm jednego nukle­otydu w rejonie promotorowym Mdm2 prowadzi do dwu-, trzykrotnego wzrostu ekspresji białka MDM2, co z kolei koreluje ze wzmożonym powstawaniem nowotworów [44]. Nadekspresja białka MDM2 zachodzi również bez ampli­fikacji genu Mdm2 [17].
Zważywszy, że p53 reguluje dodatnio ekspresję genu Mdm2, powiązanie tych dwu białek tworzy sprzężenie zwrotne - pętlę, w której p53 samo kontroluje swą ilość w komórce. Analogiczna sytuacja występuje gdy pod uwagę wzięte zostaną wzajemne relacje białka p53 z ligazami ubikwityny np. Pirh2 i COP-1, które ubikwitynują białko p53 promując jego degra­dację, a wysoki poziom białka p53 indukuje ich ekspresję.
W późnych latach dziewięćdziesiątych ub.w., screening w poszukiwaniu białek wiążących białko p53 z użyciem my­siej biblioteki cDNA doprowadził do odkrycia białka, dzie­lącego strukturalną homologię z białkiem MDM2. Białko to nazwano początkowo MDMX, a następnie nadano oficjalną nazwę MDM4 (ludzkie homologii to odpowiednio HDMX lub HDM4). Ogromna rola tego białka w procesie nowo­tworzenia ujawniła się w ostatnich kilku latach. Okazało się, że gen Mdm4 ulega amplifikacji w 10-20% z 800 prze­badanych nowotworów, takich jak rak płuca, okrężnicy, żo­łądka czy piersi. W przypadku siatkówczaka, amplifika­cję genu Mdm4 stwierdzono aż w 65% przypadków [44].
To, co czyni białka MDM2 i MDM4 wyjątkowymi, to to, że poza często zmienionym profilem ekspresji w nowotworach, okazały się działać jako główne i swoiste inhibitory białka p53 w rozwoju embrionalnym. Zarówno brak białka MDM2 (Mdm2-/-), jak i białka MDM4 (Mdm4-/-), w obecności aktywnego białka p53 w komórkach (TP53+/+), prowadzi do śmierci myszy in utero. Jednak ani fenotyp MDM2-/-, ani MDM4-/- nie jest śmiertelny w przypadku braku ak­tywnego białka p53 w komórkach (p53-/-) [29].
Jak wspomniano wcześniej, gen Mdm2 znajduje się pod kontrolą transkrypcyjną białka p53. W komórce niena­rażonej na stres białka p53 i MDM2 oscylują na podob­nym, niskim poziomie. Dzieje się tak dlatego, że wytwa­rzane w niewielkiej ilości w prawidłowej komórce białko p53, indukuje transkrypcję genu Mdm2. Białko MDM2 jest negatywnym regulatorem białka p53, działającym na dwa główne sposoby. Po pierwsze, wiąże się ono do domeny N-terminalnej białka p53, blokując interakcje z czynnika­mi transkrypcyjnymi i kofaktorami transkrypcji oraz powo­dując eksport białka do cytoplazmy. W ten sposób MDM2 zmniejsza aktywność transkrypcyjną białka p53. Drugi me­chanizm wpływa na stabilność białka p53 i wykorzystuje zdolność MDM2 do ubikwitynacji białka p53, dzięki aktyw­ności E3 ligazy ubikwityny. Ubikwitynacja N-terminalnej domeny białka p53 promuje jego degradację w proteaso­mach. Mniejsza ilość białka p53 oznacza również zmniej­szoną ekspresję genu Mdm2. W ten sposób tworzy się ne­gatywna pętla regulatorowa między dwoma białkami [29]
Mimo iż odkryto inne ligazy ubikwityny, katalizujące ubi­kwitynację białka p53 (Pirh2, Cop-1 czy ARF/BP1), żadna z nich nie jest w stanie wydajnie, jeśli w ogóle, rekompen­sować braku białka MDM2 in vivo (ryc. 3) [45].
Ryc. 3. Kooperacja pomiędzy białkami MDM2 i MDM4 w kontroli białka p53. Przy braku sygnałów stresowych, podstawową funkcją białka MDM2 jest utrzymanie niskiego poziomu białka p53, poprzez katalizację jego ubikwitynacji. W sytuacji stresu komórkowego, białko p53 katalizuje transkrypcję genów biorących udział w zatrzymaniu cyklu komórkowego lub apoptozie, a także genu kodującego białko MDM2, przez co wytwarza się negatywna pętla regulatorowa. Białko MDMX (MDM4) przyczynia się do zahamowania aktywności białka p53 niezależnie od białka MDM2. Białko MDM4 przez przyłączenie się do domeny transaktywacyjnej, powoduje inhibicję aktywności transkrypcyjnej białka p53, podczas gdy udział białka MDM2 w inhibicji aktywności transkrypcyjnej białka p53 pozostaje niepewny (linia przerywana). Inne ligazy ubikwityny (Pirh2 i Cop-1) także znajdują się pod kontrolą transkrypcyjną białka p53, ale ich aktywność wydaje się zależna od białka MDM2 (wg [29])

Wspomniane białko MDM4 towarzyszy białku MDM2 w inhibicji aktywności białka p53 (ryc. 4). Gen Mdm4 nie znajduje się jednak pod kontrolą transkrypcyjną biał­ka p53. Nadmierne wytwarzanie białka MDM4 prowadzi do zahamowania aktywności transkrypcyjnej białka p53. Co więcej, w oparciu o doświadczenia z zastosowaniem dwuhybrydowego systemu drożdżowego, udało się do­wieść, że białko MDM4 bezpośrednio oddziałuje z biał­kiem MDM2. Wkrótce potem oddziaływanie to potwierdzo­no in vivo. Heterooligomeryzacja białek MDM2 i MDM4 okazała się prowadzić do powstania dużo stabilniejszego produktu niż homooligomeryzacja każdego z tych białek [42]. Białko MDM4 oddziałuje więc bezpośrednio zarów­no z białkiem p53, jak i z białkiem MDM2, co sugeruje, że bierze udział w regulacji interakcji MDM2-p53 [56].
Ryc. 4. Schematyczne porównanie zdarzeń komórkowych dotyczących regulacji aktywności białka p53 zachodzących w komórce w warunkach fizjologicznych jak i w warunkach stresu. W komórce nienarażonej na stres, poziom białka p53 regulowany jest przez negatywną pętlę regulatorową utworzoną przede wszystkim między białkami p53 i MDM2. W warunkach stresu dodatkowo białko MDM2 poprzez tworzenie heterodimerów katalizuje degradację białka MDMX i autodegradację, co prowadzi do fosforylacji (P) i następnie akumulacji białka p53. W odpowiedzi na stres wzrasta poziom białka MDM2, co prowadzi do jeszcze bardziej efektywnej degradacji MDMX i jednoczesnej pełnej aktywacji p53. Aktywne białko p53 ulega translokacji do jądra, gdzie reguluje transkrypcją genów, których produkty są zaangażowane w regulację cyklu komórkowego bądź apoptozę (wg [56])

Stabilność białka MDM4 zależy od białka MDM2, które może katalizować jego ubikwitynację i promować degradację w proteasomach. Według modelu Toledo i Wahla, [44], biał­ka MDM2 i MDM4 regulują poziom białka p53 odmiennie, acz komplementarnie: MDM4 wpływa na aktywność biał­ka p53, a MDM2 reguluje głównie jego stabilność. Jednak dokładna rola białka MDM4 w regulacji aktywności bia­łek MDM2 i p53 pozostaje ciągle nie w pełni zbadana [29].
W warunkach stresu białko MDM2 ulega autodegradacji, a także poprzez formowanie heterooligomerów z białkiem MDM4, katalizuje degradację białka MDM4. Prowadzi to do akumulacji białka p53 w komórce. Ze względu na to, że gen Mdm2 znajduje się pod transkrypcyjną kontrolą białka p53, wzrasta ekspresja genu Mdm2 i poziom biał­ka MDM2 w komórce. Skutkuje to jeszcze bardziej efek­tywną degradacją białka MDM4 i jednoczesną pełną ak­tywacją białka p53 [29,44] (ryc. 4).
Mapowanie interakcji MDM2-p53 wskazuje, że w formo­waniu kompleksu bierze udział trzynaście kluczowych ami­nokwasów N-terminalnego końca białka MDM2 i amino­kwasy 19-25 domeny transaktywacyjnej białka p53 [44]. Krystalizacja kompleksu pozwoliła uwidocznić, że za od­działywanie ściśle odpowiedzialna jest hydrofobowa kie­szeń na powierzchni białka MDM2 oraz trzy główne hy­drofobowe aminokwasy białka p53: Phe19, Leu22 i Trp23.
Inaktywacja białka p53 wnowotworach jako klucz do efektywnej terapii przeciwnowotworowej
Jak wspomniano wcześniej, w większości nowotworów ludz­kich aktywność białka p53 nie jest pełna. Jest to warunek konieczny do progresji nowotworu, dlatego zwykle jedną z pierwszych mutacji jest taka, która umożliwia obejście mechanizmów komórki odpowiedzialnych za wykrywanie i naprawę uszkodzeń DNA podczas zatrzymania cyklu ko­mórkowego lub indukcję apoptozy w nieprawidłowych ko­mórkach. Istnieje kilka możliwości mutacji, których efek­tem będzie dezaktywacja białka p53 bezpośrednio (białko p53 występuje w komórce w postaci nieprawidłowej) lub pośrednie hamowanie jego funkcji (białko p53 zachowuje wszystkie swoje funkcje, ale mimo to nie może zahamować podziałów komórkowych ani indukować śmierci komórki).
W sytuacji, kiedy nie obserwujemy mutacji w genie TP53, ale komórka jest w stanie przejść przez punkty kontrolne cy­klu oraz nie wchodzi w stadium apoptozy mimo uszkodzenia DNA, oznacza to, że funkcje białka p53 zostały zablokowane.
Jednym z częstszych powodów braku aktywności białka p53 jest nadekspresja czynników je wiążących, takich jak MDM2 i MDM4. Zwiększona ilość MDM2 w komórce powoduje, że większość białka p53 jest związana i w re­zultacie nieaktywna, a ponadto powoduje znaczny wzrost trawienia p53 w proteasomach.
Wiele przytoczonych wyżej dowodów wskazuje, iż biał­ko MDM2 jest głównym negatywnym regulatorem biał­ka p53 oraz głównym supresorem jego aktywności w no­wotworach z nadekspresją białka MDM2 [3]. Uwalniając białko p53 z kompleksu z białkiem MDM2 można by więc stabilizowć supresor nowotworów oraz aktywować ścież­kę sygnalizacyjną białka p53, prowadzącą do zatrzyma­nia cyklu komórkowego i apoptozy. Hipoteza ta została zweryfikowana wielokrotnie [5,11,12]. Wyniki wskazują, że uwolnione z kompleksu białko p53 ulega gwałtownej akumulacji w jądrach komórek nowotworowych, skutku­jąc zatrzymaniem cyklu komórkowego i indukcją apopto­zy. Dobrze scharakteryzowana interakcja białek stała się podstawą do zaprojektowania niebiałkowych, niskoczą­steczkowych inhibitorów interakcji MDM2-p53, a także MDM4-p53, prowadzących do reaktywacji p53 i będą­cych potencjalnymi lekami przeciwnowotworowymi [45]. Schemat potencjalnego działania inhibitora oddziaływań p53-MDM2 przedstawiono na ryc. 5.
Ryc. 5. Selektywne, farmakologiczne zahamowanie interakcji p53-MDM2 jako obiecująca strategia przeciwnowotworowa. Związki niskocząsteczkowe zaburzające tworzenie kompleksu p53-MDM2 (antagoniści) przywracają aktywność białku wtp53 w komórkach nowotworowych, prowadząc do masywnej akumulacji białka ze względu na aktywowane w nich onkogeny a potem do zatrzymania cyklu komórkowego bądź apoptozy (wg [56])

Można wyodrębnić trzy główne strategie ograniczenia od­działywań między MDM2 i p53 oparte na: zahamowaniu ekspresji MDM2, inhibicji oddziaływania MDM2 - p53 oraz blokowaniu aktywności MDM2 jako ligazy ubikwity­ny. Zostaną one szczegółowo opisane w kolejnym rozdziale.
Związki niskocząsteczkowe aktywujące białko p53 wkomórkach nowotworowych
Pierwsza ze wspomnianych strategii terapeutycznych opie­ra się na zahamowaniu ekspresji białka MDM2. Blokadę ekspresji z genu Mdm2 uzyskano m.in. za pomocą antysen­sownych oligonukleotydów zarówno w kulturach in vitro jak i w modelach mysich. Wprowadzenie hipomorficznego allelu genu Mdm2 do modelu mysiego spowodowało ob­niżenie poziomu białka do -30% w porównaniu z myszą typu dzikiego i w rezultacie nieznaczny wzrost aktywno­ści p53, który wystarczył do prawidłowego wzrostu i za­hamowania rozwoju nowotworu w modelach mysich [30].
Interakcje p53-MDM2 to obecnie jeden z głównych kie­runków badań nad potencjałem terapeutycznym białka p53 w zwalczaniu chorób nowotworowych. Odkryto już wiele związków i molekuł, które w różny sposób ingerują w oddziaływania MDM2 - p53 typu dzikiego (tabela 1).
Tabela 1. Związki niskocząsteczkowe aktywujące białko p53 typu niezmutowanego (w oparciu o [7])

Białko MDM2 wiąże się z N-terminalną domeną p53 i po­przez to wiązanie blokuje zdolności transaktywacyjne białka p53. Aminokwasy 25-109 białka MDM2 tworzą hydrofo­bowe wgłębienie, w które mieści się cała domena transak­tywacyjna p53, mimo że nie cała bierze udział w wiązaniu (trzy aminokwasy pełnią istotną rolę w wiązaniu MDM2, są to Phe19, Trp23 oraz Leu26).
Jak wspomniano, obecnie wykorzystuje się trzy główne spo­soby poszukiwania molekuł aktywujących białko p53 w ko­mórkach nowotworowych. Pierwsza oparta jest na screenin­gu in vitro związków, które wiążą się do białka MDM2 bądź blokują aktywność E3 ligazy tego białka. Doprowadziło to w 2004 r. do identyfikacji grupy związków o rdzeniu cis-imidazolinowym, zwanych nutlinami [46]. Nutliny to związki łączące się bezpośrednio do białka MDM2 i przez to hamujące jego aktywność regulatorową względem białka p53. Dzięki budowie mimikującej trzy reszty aminokwaso­we domeny transaktywacyjnej białka p53, wiążą się do hy­drofobowej kieszeni białka MDM2 i w konsekwencji blo­kują jego interakcję z białkiem p53. Inhibitory te zaburzają tworzenie się kompleksu między białkiem MDM2 a p53 już w stężeniach nanomolowych (IC50=90 nM dla nutliny 3a, aktywnego enancjomera nutliny 3) [45]. Dowiedziono, iż nutliny są pobierane przez wiele typów komórek nowo­tworowych, prowadząc do stabilizacji białka p53 i aktywa­cji jego ścieżki sygnałowej. Proliferujące komórki nowo­tworowe, po ekspozycji na mikromolowe stężenia nutliny, były efektywnie zatrzymywane w fazie G1 i G2 oraz ule­gały apoptozie. Niestety, związki te okazały się słabymi antagonistami interakcji p53 - MDM4 oraz wykazywały dużą toksyczność systemową u myszy [7].
Druga strategia poszukiwania związków o wysokim po­tencjale przeciwnowotworowym oparta jest na screeningu związków chemicznych dostępnych w bazie NCI (National Cancer Institute) w testach biologicznych na modelach ko­mórkowych. W ten sposób zidentyfikowano związek o na­zwie RITA (reactivation of p53 and induction of tumor cell apoptosis), niegenotoksyczny aktywator białka p53, który wiążąc się do jego domeny transaktywacyjnej, uniemoż­liwia interakcję z białkiem MDM2 [22]. RITA wiąże się do białka p53 w obrębie domeny N-terminalnej i zaburza oddziaływanie p53 z MDM2 zarówno in vitro jak i w ko­mórkach. Udowodniono, że RITA indukuje ekspresję ge­nów znajdujących się pod kontrolą transkrypcyjną białka p53 oraz apoptozę w wielu liniach komórek nowotworo­wych, zachowujących typ dziki białka p53 [22]. Ponadto doniesienia tej grupy wykazały, iż RITA jest bardzo sku­tecznym chemioterapeutykiem również ex vivo i hamuje rozwój guzów u myszy w sposób zależny od białka p53.
Szeroko zakrojone przeszukiwanie biblioteki związków naturalnych zaowocowało identyfikacją aktynomycyny D, antybiotyku pozyskiwanego z promieniowca Streptomyces parvulus jako silnego aktywatora białka p53. Związek ten powoduje zahamowanie syntezy rybosomalnego RNA, co uniemożliwia biogenezę rybosomów i uwalnia białka ry­bosomalne RPL11 i RPL5, które wiążą i inaktywują biał­ko MDM2. Mimo iż aktynomycyna D powoduje uszko­dzenie DNA i jest związkiem toksycznym w wysokich stężeniach, w małych dawkach okazała się bardzo swo­istym aktywatorem białka p53 w komórkach nowotworo­wych [13]. Ponadto jest ona obecnie wykorzystywana w le­czeniu pacjentów z chorobami nowotworowymi (tabela 1).
Trzecia strategia, mająca na celu identyfikację związków ni­skocząsteczkowych, zaburzających interakcję p53 - MDM2 polega na modelowaniu molekularnym w oparciu o struk­turę obu białek. Owocem tej techniki jest odkrycie spiro-oxindoli, inhibitorów białka MDM2 [14]. Wykazano, iż związki te po podaniu do komórek nowotworowych, in­dukują zatrzymanie cyklu komórkowego i śmierć komór­kową, natomiast w przypadku zdrowych komórek, jedynie zatrzymanie cyklu komórkowego. Działanie tych inhibito­rów jest ściśle zależne od reaktywacji białka p53 w trakto­wanych komórkach. Spiro-oxindole zaburzają kompleksy p53-MDM2 w wielu liniach komórkowych przy warto­ściach IC50 wynoszących już 30-2000 nM. Najbardziej obiecującą pochodną tych inhibitorów okazał się związek MI-219, wykazujący najlepszą farmakodynamikę i biodo­stępność w modelach mysich. Wykazano, iż MI-219 indu­kuje regresję nowotworu, nie generując jednocześnie tok­syczności specyficznej tkankowo. Jednak poziom białka p53 indukowany przez MI-219 jest niski i niewystarczają­cy do aktywacji apoptozy nawet we wrażliwych tkankach, takich jak grasica [7].
Jak już wcześniej wspomniano, białko p53 ulega wielu mo­dyfikacjom potranslacyjnym, wpływającym na jego aktyw­ność. Okazuje się, iż na wzrost stężenia białka p53 w ko­mórkach nowotworowych można wpływać nie tylko przez zaburzanie formowania się kompleksu z białkiem MDM2, ale także celując w inne białka regulatorowe. Przykładem takich związków są zidentyfikowane w oparciu o testy ko­mórkowe, tenovina 1 i jej lepiej rozpuszczalna w roztwo­rach wodnych pochodna, tenovina 6 [23]. Tenoviny po­wodują nagły wzrost poziomu białka p53 w komórkach traktowanych już stężeniami mikromolowymi związku. Co więcej, tenorina 6 podawana dootrzewnowo w dawce 50 mg/dzień znacząco opóźniała wzrost ksenografów ludz­kich komórek czerniaka w modelach mysich [23]. W dwu­hybrydowym teście drożdżowym wykazano, iż tenovi­ny powodują zahamowanie aktywności NAD+-zależnych deacetylaz SIRT1 i SIRT2, należących do rodziny sirtu­in - trzeciej klasy deacetylaz histonów. Deacetylacja biał­ka p53 powoduje jego destabilizację i hamuje aktywność transkrypcyjną, więc inhibicja sirtuin powinna prowadzić do akumulacji białka p53 i indukcji p53-zależnej apopto­zy. Rzeczywiście, traktowanie tenovinami komórek raka piersi (MCF7) powodowało akumulację w nich acetylowa­nego białka p53 oraz acetylowanej tubuliny - substratów odpowiednio SIRT1 i SIRT2. Po identyfikacji dokładnego mechanizmu działania tych związków, dalsza chemiczna optymalizacja ich aktywności polegająca na strukturalnej modyfikacji w celu podniesienia np. swoistości substrato­wej, jest obecnie możliwa [7].
Interesującym sposobem identyfikacji specyficznych ak­tywatorów białka p53, jest testowanie znanych molekuł, regulujących zjawiska wpływające na aktywność p53. Najlepszym przykładem opisywanym w literaturze jest leptomycyna B i jej pochodne - inhibitory eksportu białek z jądra. Leptomycyna B jest inhibitorem eksportyny CRM1, a jej pochodne wykazały korzystne działanie w badaniach przedklinicznych z użyciem modeli zwierzęcyh [34].
Nasze wieloletnie badania nad mechanizmami leżącymi u podstaw terapii fotodynamicznej (PDT) wykazały, iż fo­touczulacz, protoporfiryna IX (PpIX), bezpośrednio od­działuje z typem „dzikim" białka p53 in vitro oraz indu­kuje śmierć komórek raka okrężnicy (HCT 116) w sposób zależny i niezależny od białka p53 [54]. W pracy wykaza­liśmy, iż PpIX może bezpośrednio wiązać się z białkiem p53, przez co zaburza formowanie kompleksu z białkiem MDM2. Zapobiega to degradacji białka p53 i prowadzi do jego stabilizacji. PpIX działa więc analogicznie do opisywa­nych wcześniej niskocząsteczkowych inhibitorów interak­cji p53 - MDM2, potencjalnych leków przeciwnowotworo­wych. W efekcie obserwuje się indukcję zależnej od białka p53 apoptozy jeszcze w ciemności, przed wzbudzeniem protoporfiryny światłem. Wzbudzenie światłem o energii 2 J/cm2 indukuje apoptozę w komórkach zawierających biał­ko p53 (p53+/+), jak i jego pozbawionych (p53-/-), co dowie­dziono badając indukcję proapoptotycznego genu PUMA, będącego jednocześnie pod kontrolą transkrypcyjną białka p53. Ostatnie badania wskazują, że białko p73, homolog białka p53, może prowadzić do indukcji apoptozy przez transaktywację genu PUMA. Białko p73 ulega ekspresji zarówno w linii HCT 116 p53+/+, jak i p53-/-. Możliwe jest więc, że w komórkach niemających aktywnego białka p53, dochodzi do indukcji apoptozy poprzez aktywację białka p73 przez protoporfirynę IX [54,55,57].
W zgodzie z tymi obserwacjami są badania Mitsunaga i wsp. [32], w których wykazano, że indukcja wczesnej apoptozy w komórkach HCT 116 na skutek PDT jest za­leżna od obecności proapoptotycznego białka Bax i białka p53. W porównaniu do typu dzikiego, komórki HCT 116 Bax-/- i p53-/- wykazały dużo większą żywotność w od­powiedzi na PDT.
Ostatnie doniesienia literaturowe podają, że inhibitory od­działywań p53 - MDM2 oraz p53 - MDM4 mogłyby być stosowane w leczeniu około 2-3 milionów pacjentów dia­gnozowanych z nowotworem każdego roku [43].
Wnioski
Powszechnie przyjęto, iż białko p53 jest najistotniejszym sensorem stresu w komórkach. Jego celowa inaktywacja w komórkach nowotworowych w wyniku nagromadzenia się zmian genetycznych, potwierdza jego istotną rolę w rozwoju i przerzutowaniu guzów. Dlatego też wydaje się, iż strategie terapeutyczne opierające się na reaktywacji białka p53 w ko­mórkach nowotworowych powinny stanowić w przyszłości skuteczne narzędzie w zwalczaniu tzw. dżumy XXI wieku.
PIŚMIENNICTWO
[1] Bennett M., Macdonald K., Chan S.W., Luzio J.P., Simari R., Weissberg P.: Cell surface trafficking of Fas: a rapid mechanism of p53-mediated apoptosis. Science, 1998; 282: 290-293
[PubMed]  
[2] Berger M., Vogt Sionov R., Levine A.J., Haupt Y.: Role for the polyproline domain of p53 in its regulation by MDM2. J. Biol. Chem., 2001; 276: 3785-3790
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[3] Bond G.L., Hu W., Levine A.J.: MDM2 is a central node in the p53 pathway: 12 years and counting. Curr. Cancer Drug Targets, 2005; 5: 3-8
[PubMed]  
[4] Bossy-Wetzel E., Green D.R.: Apoptosis: checkpoint at the mitochondrial frontier. Mutat. Res., 1999; 434: 243-251
[PubMed]  
[5] Böttger A., Böttger V., Sparks A., Liu W.L., Howard S.F., Lane D.P.: Design of a synthetic Mdm2-binding mini protein that activates the p53 response in vivo. Curr. Biol., 1997; 1: 860-869
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[6] Brooks C.L., Gu W.: Ubiquitination, phosphorylation and acetylation: the molecular basis for p53 regulation. Curr. Opin. Cell Biol., 2003; 15: 164-171
[PubMed]  
[7] Brown C.J., Lain S., Verma C.S., Fersht A.R., Lane D.P.: Awakening guardian angels: drugging the p53 pathway. Nat. Rev. Cancer, 2009; 9: 862-873
[PubMed]  
[8] Cahilly-Snyder L., Yang-Feng T., Francke U., George D.L.: Molecular analysis and chromosomal mapping of amplified genes isolated from a transformed mouse 3T3 cell line. Somat. Cell Mol. Genet., 1987; 13: 235-244
[PubMed]  
[9] Chan T.A., Hermeking H., Lengauer C., Kinzler K.W., Vogelstein B.: 14-3-3 sigma is required to prevent mitotic catastrophe after DNA damage. Nature, 1999; 401: 616-620
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[10] Chao C., Saito S., Kang J., Anderson C.W., Appella E., Xu Y.: p53 transcriptional activity is essential for p53-dependent apoptosis following DNA damage. EMBO J., 2000; 19: 4967-4975
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[11] Chene P.: Inhibiting the p53-MDM2 interaction: an important target for cancer therapy. Nat. Rev. Cancer, 2003; 3: 102-109
[PubMed]  
[12] Chene P., Fuchs J., Bohn J., García-Echeverría C., Furet P., Fabbro D.: A small synthetic peptide, which inhibits the p53-hdm2 interaction, stimulates the p53 pathway in tumour cell lines. J. Mol. Biol., 2000; 299: 245-253
[PubMed]  
[13] Choong M.L., Yang H., Lee M.A., Lane D.P.: Specific activation of the p53 pathway by low dose actinomycin D: a new route to p53 based cyclotherapy. Cell Cycle, 2009; 8: 2810-2818
[PubMed]  
[14] Ding K., Lu Y., Nikolovska-Coleska Z., Qiu S., Ding Y., Gao W., Stuckey J., Krajewski K., Roller P.P., Tomita Y., Parrish D.A., Deschamps J.R., Wang S.: Structure-based design of potent non-peptide MDM2 inhibitors. J. Am. Chem. Soc., 2005; 127: 10130-10131
[PubMed]  
[15] Donehower L.A., Harvey M., Slagle B.L., McArthur M.J., Montgomery C.A. Jr., Butel J.S., Bradley A.: Mice deficient for p53 are developmentally normal but susceptible to spontaneous tumours. Nature, 1992; 356: 215-221
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[16] Finlay C.A., Hinds P.W., Levine A.J.: The p53 protooncogene can act as a suppressor of transformation. Cell, 1989; 57: 1083-1093
[PubMed]  
[17] Freedman D.A., Wu L., Levine A.J.: Functions of the MDM2 oncoprotein. Cell. Mol. Life. Sci., 1999; 55: 96-107
[PubMed]  
[18] Gebow D., Miselis N., Liber H.L.: Homologous and nonhomologous recombination resulting in deletion: effects of p53 Status, microhomology, and repetitive DNA length and orientation. Mol. Cell. Biol., 2000; 20: 4028-4035
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[19] Harms K.L., Chen X.: The C terminus of p53 family proteins is a cell fate determinant. Mol. Cell. Biol., 2005; 25: 2014-2030
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[20] Hoh J., Jin S., Parrado T., Edington J., Levine A.J., Ott J.: The p53 MH algorithm and its application in detecting p53-responsive genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002; 99: 8467-8472
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[21] Hsieh J.K., Chan F.S., O'Connor D.J., Mittnacht S., Zhong S., Lu X.: Rb regulates the stability and the apoptotic function of p53 via MDM2. Mol. Cell, 1999; 3: 181-193
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[22] Issaeva N., Bozko P., Enge M., Protopopova M., Verhoef L.G., Masucci M., Pramanik A., Selivanova G.: Small molecule RITA binds to p53, blocks p53-HDM2 interaction and activates p53 function in tumors. Nat. Med., 2004; 10: 1321-1328
[PubMed]  
[23] Lain S., Hollick J.J., Campbell J., Staples O.D., Higgins M., Aoubala M., McCarthy A., Appleyard V., Murray K.E., Baker L., Thompson A., Mathers J., Holland S.J., Stark M.J., Pass G., Woods J., Lane D.P., Westwood N.J.: Discovery, in vivo activity, and mechanism of action of a small-molecule p53 activator. Cancer Cell., 2008; 13: 454-463
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[24] Lane D.P., Crawford L.V.: T antigen is bound to a host protein in SV40-transformed cells. Nature, 1979; 278: 261-263
[PubMed]  
[25] Laptenko O., Prives C.: Transcriptional regulation by p53: one protein, many possibilities. Cell Death Differ., 2006; 13: 951-961
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[26] Lin Y., Ma W., Benchimol S.: Pidd, a new death-domain-containing protein, is induced by p53 and promotes apoptosis. Nat. Genet., 2000; 26: 122-127
[PubMed]  
[27] Linke S.P., Sengupta S., Khabie N., Jeffries B.A., Buchhop S., Miska S., Henning W., Pedeux R., Wang X.W., Hofseth L.J., Yang Q., Garfield S.H., Stürzbecher H.W., Harris C.C.: p53 interacts with hRAD51 and hRAD54, and directly modulates homologous recombination. Cancer Res., 2003; 63: 2596-2605
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[28] Marchenko N.D., Zaika A., Moll U.M.: Death signal-induced localization of p53 protein to mitochondria. J. Biol. Chem., 2000; 275: 16202-16212
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[29] Marine J.C., Francoz S., Maetens M., Wahl G., Toledo F., Lozano G.: Keeping p53 in check: Essential and synergistic functions of Mdm2 and Mdm4. Cell Death Differ., 2006; 13: 927-934
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[30] Mendrysa S.M., O'Leary K.A., McElwee M.K., Michalowski J., Eisenman R.N., Powell D.A., Perry M.E.: Tumor suppression and normal aging in mice with constitutively high p53 activity. Genes Dev., 2006; 20: 16-21
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[31] Meulmeester E., Jochemsen A.G.: p53: a guide to apoptosis. Curr. Cancer Drug Targets, 2008; 8: 87-97
[PubMed]  
[32] Mitsunaga M., Tsubota A., Nariai K., Namiki Y., Sumi M., Yoshikawa T., Fujise K.: Early apoptosis and cell death induced by ATX-S10Na (II)-mediated photodynamic therapy are Bax- and p53-dependent in human colon cancer cells. World J. Gastroenterol., 2007; 13: 692-698
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[33] Momand J., Jung D., Wilczynski S., Niland J.: The MDM2 gene amplification database. Nucleic Acids Res., 1998; 26: 3453-3459
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[34] Mutka S.C., Yang W.Q., Dong S.D., Ward S.L., Craig D.A., Timmermans P.B., Murli S.: Identification of nuclear export inhibitors with potent anticancer activity in vivo. Cancer Res., 2009; 69: 510-517
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[35] Oda K., Arakawa H., Tanaka T., Matsuda K., Tanikawa C., Mori T., Nishimori H., Tamai K., Tokino T., Nakamura Y., Taya Y.: p53AIP1, a potential mediator of p53-dependent apoptosis, and its regulation by Ser-46-phosphorylated p53. Cell, 2000; 102: 849-862
[PubMed]  
[36] Oda E., Ohki R., Murasawa H., Nemoto J., Shibue T., Yamashita T., Tokino T., Taniguchi T., Tanaka N.: Noxa, a BH3-only member of the Bcl-2 family and candidate mediator of p53-induced apoptosis. Science, 2000; 288: 1053-1058
[PubMed]  
[37] Oren M., Levine A.J.: Molecular cloning of a cDNA specific for the murine p53 cellular tumor antigen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983; 80: 56-59
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[38] Sakaguchi K., Sakamoto H., Lewis M.S., Anderson C.W., Erickson J.W., Appella E., Xie D.: Phosphorylation of serine 392 stabilizes the tetramer formation of tumor suppressor protein p53. Biochemistry, 1997; 36: 10117-10124
[PubMed]  
[39] Sakamuro D., Sabatini P., White E., Prendergast G.C.: The polyproline region of p53 is required to activate apoptosis but not growth arrest. Oncogene, 1997; 15: 887-898
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[40] Senzer N., Nemunaitis J., Nemunaitis M., Lamont J., Gore M., Gabra H., Eeles R., Sodha N., Lynch F.J., Zumstein L.A., Menander K.B., Sobol R.E., Chada S.: p53 therapy in a patient with Li-Fraumeni syndrome. Mol. Cancer Ther., 2007; 6: 1478-1482
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[41] Takimoto R., El-Deiry W.S.: Wild-type p53 transactivates the KILLER/DR5 gene through an intronic sequence-specific DNA-binding site. Oncogene, 2000; 19: 1735-1743
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[42] Tanimura S., Ohtsuka S., Mitsui K., Shirouzu K., Yoshimura A., Ohtsubo M.: MDM2 interacts with MDMX through their RING finger domains. FEBS Lett., 1999; 447: 5-9
[PubMed]  
[43] Toledo F., Wahl G.M.: Regulating the p53 pathway: In vitro hypotheses, in vitro veritas. Nat. Rev. Cancer, 2006; 6: 909-923
[PubMed]  
[44] Toledo F., Wahl G.M.: MDM2 and MDM4: p53 regulators as targets in anticancer therapy. Int. J. Biochem. Cell Biol., 2007; 39: 1476-1482
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[45] Vassilev L.T.: MDM2 inhibitors for cancer therapy. Trends Mol. Med., 2007; 13: 23-31
[PubMed]  
[46] Vassilev L.T., Vu B.T., Graves B., Carvajal D., Podlaski F., Filipovic Z., Kong N., Kammlott U., Lukacs C., Klein C., Fotouhi N., Liu E.A.: In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science, 2004; 303: 844-848
[PubMed]  
[47] Venot C., Maratrat M., Dereuil C., Conseiller E., Bracco L., Debussche L.: The requirement for the p53 proline-rich functioal domain for mediation of apoptosis is correlated with specific PIG3 gene. EMBO J., 1998; 17: 4668-4679
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[48] Ventura A., Kirsch D.G., McLaughlin M.E., Tuveson D.A., Grimm J., Lintault L., Newman J., Reczek E.E., Weissleder R., Jacks T.: Restoration of p53 function leads to tumour regression in vivo. Nature, 2007; 445: 661-665
[PubMed]  
[49] Vousden K.H., Lu X.: Live or let die: the cell's response to p53. Nat. Rev. Cancer, 2002; 2: 594-604
[PubMed]  
[50] Wani M.A., Zhu Q.Z., El-Mahdy M., Wani A.A.: Influence of p53 tumor suppressor protein on bias of DNA repair and apoptotic response in human cells. Carcinogenesis, 1999; 20: 765-772
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[51] Waterman M.J., Stavridi E.S., Waterman J.L., Halazonetis T.D.: ATM-dependent activation of p53 involves dephosphorylation and association with 14-3-3 proteins. Nat. Gen., 1998; 19: 175-178
[PubMed]  
[52] Yonish-Rouach E., Resnitzky D., Lotem J., Sachs L., Kimchi A., Oren M.: Wild-type p53 induces apoptosis of myeloid leukaemic cells that is inhibited by interleukin-6. Nature, 1999; 352: 345-347
[PubMed]  
[53] Yu J., Zhang L., Hwang P.M., Kinzler K.W., Vogelstein B.: PUMA induces the rapid apoptosis of colorectal cancer cells. Mol. Cell., 2001; 3: 673-682
[PubMed]  
[54] Zawacka-Pankau J., Issaeva N., Hossain S., Pramanik A., Selivanova G., Podhajska A.J.: Protoporphyrin IX interacts with wild-type p53 protein in vitro and induces cell death of human colon cancer cells in a p53-dependent and -independent manner. J. Biol. Chem., 2007; 282: 2466-2472
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[55] Zawacka-Pankau J., Kostecka A., Sznarkowska A., Hedström E., Kawiak A.: p73 tumor suppressor protein: A close relative of p53 not only in structure but also in anti-cancer approach? Cell Cycle, 2010; 9: 720-728
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[56] Zawacka-Pankau J., Krachulec J., Grulkowski I., Bielawski K.P., Selivanova G.: The p53-mediated cytotoxicity of photodynamic therapy of cancer: recent advances. Toxicol. Appl. Pharmacol., 2008; 232: 487-497
[PubMed]  
[57] Zawacka-Pankau J., Maleńczyk K., Sznarkowska A.: The structure and cellular regulation of p73: Their implication in anticancer therapy. Postepy Hig. Med. Dosw., 2010; 64: 78-86
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[58] Zurer I., Hofseth L.J., Cohen Y., Xu-Welliver M., Hussain S.P., Harris C.C., Rotter V.: The role of p53 in base excision repair following genotoxic stress. Carcinogenesis, 2004; 25: 11-19
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.