Postepy Hig Med Dosw. (online), 2009; 63: 250-257
Review
Full Text PDF  

Dlaczego u człowieka i małp wąskonosych nie ma epitopu Galα1-3Gal, którego obecność u zwierząt jest związana z odrzucaniem ksenoprzeszczepów u ludzi?
Why humans and Catarrhini lack the Galα1-3Gal epitope, related to xenograft rejection?
Anna Suchanowska1  , Marcin Czerwiński1,2  
1Zakład Immunochemii, Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu
2Wydział Wychowania Fizycznego i Fizjoterapii, Politechnika Opolska
Adres do korespondencji
doc. dr hab. Marcin Czerwiński, Zakład Immunochemii Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN im. Ludwika Hirszfelda, ul. Rudolfa Weigla 12, 53-114 Wrocław, e-mail: czerwins@iitd.pan.wroc.pl

Źródło finansowania
Praca została przygotowana w ramach projektu grantowego nr N N302 118835 finansowanego przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego.

Otrzymano:  2009.04.24
Zaakceptowano:  2009.05.26
Opublikowano:  2009.06.04

Streszczenie
Epitop Galα1-3Gal (Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R), którego synteza jest katalizowana przez α1,3- galaktozylotransferazę (α1,3GT), jest strukturą cukrową powszechnie występującą na powierzchni komórek większości ssaków z wyjątkiem wyższych naczelnych: małp człekokształtnych, małp makakowatych i ludzi. Organizmy gatunków, które nie mają epitopu Galα1-3Gal, wytwarzają naturalne przeciwciała skierowane przeciw antygenowi Galα1-3Gal. Obecność tych przeciwciał u ludzi jest główną przeszkodą w wykonywaniu przeszczepów odzwierzęcych. Brak antygenu Galα1-3Gal jest spowodowany inaktywacją genu kodującego α1,3-galaktozylotransferazę. W genomie człowieka i małp bezogoniastych obecny jest pseudogen o sekwencji homologicznej do sekwencji genu kodującego α1,3-galaktozylotransferazę, zawierający wiele mutacji punktowych oraz delecji, które zmieniają ramę odczytu. U człowieka występuje kilka wariantowych form mRNA tego genu, z których większość nie zawiera eksonu kodującego region katalityczny. Skutkiem tych zmian jest brak aktywnego białka.
Słowa kluczowe: epitop Galα1-3Gal • α1,3-galaktozylotransferaza • pseudogen • GGTA1 • ksenoprzeszczep


Summary
The Galα1-3Gal epitope (Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R) is an oligosaccharide determinant present on the cell surface of most mammalian species with the exception of the higher primates, including Old World monkeys, apes, and humans. The synthesis of Galα1-3Gal epitope is catalyzed by α1,3-galactosyltransferase (α1,3GT). Inactivation of the α1,3GT gene in humans and the production of natural anti-Galα1-3Gal antibodies against the Galα1-3Gal epitope has resulted in the formation of a unique immunological barrier that prevents the transplantation of tissues and organs from Galα1-3Gαl-positive animals to humans. The gene encoding α1,3-galactosyltransferase in higher primates is inactive due to point mutations and deletions leading to a change of reading frame. The human transcript of this gene consists of several splicing variants, most of which does not contain an exon encoding the catalytic domain. Thus no active protein is produced.
Key words: Galα1-3Gal epitope • α1,3-galactosyltransferase • pseudogene • GGTA1 • xenotransplant




Wykaz skrótów:
α1,3GT – α1,3-galaktozylotransferaza; GGTA1 – gen kodujący glikozylotransferazę UDP-Galaktozo: β-galaktozylo – α1-3-galaktozylotransferazę (α1,3-galaktozylotransferazę); UPG – nieprzetworzony pseudogen; PPG – przetworzony pseudogen; pz – para zasad.
WPROWADZENIE
Epitop Galα1-3Gal (zwany też αGal; Galα 1-3Galβ1- 4GlcNAc-R) występuje u bakterii i pierwotniaków, a także u ssaków, w tym niższych naczelnych (Strepsirrhini, naczelne zamieszkujące Madagaskar i Komory, np. lemur wari, maki złoty, galago), wyrakowatych (Tarsiidae, drapieżne naczelne zamieszkujące Azję Południowo-Wschodnią, np. wyrak upiór) i małp Nowego Świata (Platyrrhini, małpy szerokonose występujące w Ameryce Południowej i Środkowej, np. kapucynka czubata, wyjec czarny). Epitop ten jest nieobecny u małp wąskonosych (Catarrhini), w tym u małp makakowatych, zwanych też ogoniastymi (Cercopithecidae, np. makak, pawian), małp człekokształtnych, zwanych też małpami Starego Świata lub bezogoniastymi (Hominoidea, np. szympans, goryl, orangutan, gibon) i ludzi. Epitop Galα1-3Gal występuje na glikolipidach i glikoproteinach erytrocytów, a także komórek nabłonka układu naczyniowego, błony śluzowej przewodu pokarmowego i narządu nosowo-lemieszowego [20]. Nieobecność tego epitopu jest skutkiem ewolucyjnych zmian, w wyniku których gen kodujący α1,3-galaktozylotransferazę (GGTA1) przestał kodować białko zdolne do biosyntezy epitopu Galα1-3Gal [12].
α1,3-GALAKTOZYLOTRANSFERAZA
Epitop Galα1-3 Gal jest syntetyzowany przez α1,3- galaktozylotransferazę (UDP-Galaktozo: β-galaktozyloα1,3- galaktozylotransferazę, α1,3GT, EC 2.4.1.151). Enzym ten kalalizuje przeniesienie reszty galaktozy z UDP-Gal na glikosfingolipidy lub glikoproteiny zawierające końcowe reszty Galβ1-4GlcNAc-R, przyłączając ją wiązaniem α1–3 [2] (ryc. 1). α1,3-galaktozylotransferaza zaliczana jest do rodziny szóstej glikozylotransferaz (GT6).
Ryc. 1. Schemat reakcji katalizowanej przez α1,3-galaktozylotransferazę (glikozylotransferazę UDP-Galaktozo: β-galaktozylo-α1-3-galaktozylotransferazę, EC 2.4.1.151)

Enzymy należące do tej rodziny przenoszą resztę galaktozy lub N-acetylogalaktozaminy z urydylodifosforanu na łańcuchy cukrowe z utworzeniem wiązania α1–3 [15]. α1,3- galaktozylotransferaza zaliczana jest do transferaz zachowujących („retaining”) konfigurację anomeryczną reszty cukrowej związanej z nukleotydem. W tym przypadku enzym zachowuje konfigurację , która jest obecna w cząsteczce UDP-D-galaktozy.
α1,3-galaktozylotransferaza, podobnie jak inne glikozylotransferazy, jest białkiem transmembranowym typu II. Zbudowana jest z krótkiego N-końcowego odcinka cytoplazmatycznego, domeny transmembranowej i części C-końcowej zawierającej centrum aktywne enzymu, skierowanej do światła aparatu Golgiego [29].
KLINICZNE ZNACZENIE ANTYGENU αGAL I PRZECIWCIAŁ ANTY-GAL
Ssaki naczelne, których komórki nie mają na powierzchni epitopu Galα1-3Gal, wytwarzają naturalne przeciwciała skierowane przeciwko tej determinancie. Stanowią one około 1% przeciwciał IgG występujących w osoczu ludzi [10]. Przeciwciała te powstają w wyniku kontaktu z drobnoustrojami, a prawdopodobnie także z żywnością [28]. Wykazują one podobieństwo do izoaglutynin anty-A i anty- B występujących u ludzi w przypadku nieobecności determinanty A lub B (antygenów układu grupowego ABO). Wykazano, że u osób chorych na choroby pasożytnicze, takie jak choroba Chagasa, leiszmanioza lub malaria, występuje podwyższone stężenie przeciwciał anty-Galα1-3Gal, co sugeruje rolę tych przeciwciał w obronie przed pasożytami [1,33].
Inaktywacja genu kodującego α1,3-galaktozylotransferazę u ludzi oraz wytwarzanie naturalnych przeciwciał rozpoznających determinantę Galα1-3Gal tworzą barierę immunologiczną, która jest główną przeszkodą w wykonywaniu przeszczepów odzwierzęcych, ponieważ przeciwciała anty-Galα1-3Gal są odpowiedzialne za ostre odrzucanie ksenoprzeszczepów pochodzących od dawców Galα1- 3Gal-pozytywnych [6]. Odrzucenie ksenoprzeszczepu jest wynikiem lizy komórek w wyniku aktywacji dopełniacza oraz niszczenia komórek przez makrofagi i komórki NK w wyniku cytotoksyczności zależnej od przeciwciał (ADCC – antibody-dependent cellular cytotoxicity) [29]. Medyczne i etyczne powody uniemożliwiają użycie organów pochodzących od innych naczelnych, dlatego też prowadzi się badania pozwalające na transplantacje organów pochodzących od świni. Zwierzęta te są potencjalnie najlepszymi dawcami organów ze względu na podobny do ludzkich rozmiar narządów [34]. Obecność u ludzi przeciwciał anty-Galα1-3Gal, które rozpoznają epitop Galα1- 3Gal obecny na powierzchni komórek świni wywołuje ostrą odpowiedź układu odpornościowego i prowadzi do odrzucenia przeszczepionego narządu [9].
Podejmowane są próby tworzenia zwierząt transgenicznych przez zablokowanie genu kodującego α1,3- galaktozylotransferazę. Sharma i wsp. wykazali, że komórki homozygotycznej świni, pomimo inaktywacji genu GGTA1, mają na powierzchni epitop Galα1-3Gal, co świadczy o tym, że α1,3-galaktozylotransferaza nie jest jedynym enzymem zdolnym do syntezy epitopu Galα1-3Gal [35]. Enzymem, który prawdopodobnie odpowiada za syntezę połączenia Galα1-3Gal u zwierząt z inaktywowanym genem GGAT1, jest syntaza glikosfingolipidu iGb3, która również należy do rodziny szóstej glikozylotransferaz [30]. Izoglobozyd iGb3 jest neutralnym glikosfingolipidem o wzorze strukturalnym GalNAcβ1-3Galα1-3Galβ1- 4Glcβ1-Ceramid. U człowieka enzym ten jest nieaktywny w wyniku mutacji obecnych w regionie katalitycznym [5].
GENY KODUJĄCE α1,3-GALAKTOZYLOTRANSFERAZĘ
W genomie człowieka występują dwa homologiczne geny kodujące α1,3-galaktozylotransferazę, umiejscowione na chromosomach 9 i 12. Oba zawierają kilka mutacji zmieniających ramę odczytu i powodujących powstanie przedwczesnego kodonu stop oraz wiele mutacji, które powodują zmianę reszt aminokwasowych. Gen umiejscowiony na chromosomie 9 (9q33-q34) wykazuje taką samą organizację ekson-intron jak aktywny gen α1,3-galaktozylotransferazy. Gen ten nazywany jest GGTA1, HGT-10 lub UPG (unprocessed pseudogene, nieprzetworzony pseudogen). Gen na chromosomie 12 (12q14-q15) powstał w wyniku przekształcenia pozbawionej intronów cząsteczki mRNA kodującej α1,3GalT w cDNA, a następnie wbudowania tej cząsteczki do chromosomu 12. Gen ten zawiera wszystkie eksony występujące w genie GGTA1 u gatunków, które mają epitop Galα1-3Gal i nazywany jest GGTA1P lub PPG (processed pseudogene, przetworzony pseudogen) [18]. Podsumowanie danych na temat genów kodujących α1,3-galaktozylotransferazę umieszczono w tabeli 1.
Tabela 1. Geny kodujące α1,3-galaktozylotransferazę

Numeracja sekwencji genu GGTA1 u różnych gatunków jest trudna, ponieważ geny człowieka i małp wąskonosych zawierają insercje, które są nieobecne w genach kodujących aktywne białka. Dlatego w niniejszej pracy zastosowano numerację reszt aminokwasowych taką jak w genie krowy (standardowy gen kodujący aktywne białko), natomiast nukleotydy numerowane są tak jak w genie ludzkim. Należy zwrócić uwagę, że podział intronów i eksonów w sekwencji zamieszczonej w bazie danych Ensembl jest taki jak w publikacji Lanteri i wsp. [22].
MOLEKULARNA CHARAKTERYSTYKA GENU GGTA1
U gatunków, u których występuje epitop Galα1-3Gal, gen kodujący α1,3-galaktozylotransferazę składa się z dziewięciu eksonów, z których pierwsze trzy nie ulegają translacji. Ekson 9 koduje największą część regionu katalitycznego enzymu. U gatunków, które nie mają epitopu Galα1-3Gal, ekson 1 nie występuje. Długość łańcucha polipeptydowego u gatunków, które mają epitop Galα1-3Gal, wynosi około 370 reszt aminokwasowych. Homologia sekwencji aminokwasowych części katalitycznej genów kodujących aktywne enzymy wynosi około 70% [41].
Mutacje w eksonie 6 i 8, a zwłaszcza przedwczesna terminacja łańcucha polipeptydowego, są głównymi przyczynami powodującymi utratę aktywności enzymu [23]. Największe znaczenie mają delecje; w porównaniu do genu krowy, który koduje aktywne białko, u człowieka, goryla i szympansa znajdują się trzy jednonukleotydowe delecje, a u orangutana dwie [22]. Jeżeli przyjmiemy jako początek genu pierwszy nukleotyd z kodonu ATG, to delecje te są umiejscowione w pozycji 240 (ekson 6) oraz 767 i 845 (ekson 8; numeracja według sekwencji genu człowieka). Delecja w pozycji 240 znajduje się we fragmencie eksonu 6, który nie ma odpowiednika w eksonie krowy; fragment ten jest insertem znajdującym się między 74 a 75 resztą aminokwasową genu krowy. Następne delecje odpowiadają resztom aminokwasowym 248. i 274. w sekwencji genu krowy (ryc. 2) [22]. Delecje w pozycjach 240, 767 i 845 występują u człowieka i szympansa, natomiast u orangutana nie ma delecji 767. Delecja w pozycji 240 zmienia ramę odczytu, co prowadzi do inaktywacji domeny katalitycznej białka [23] oraz powoduje pojawienie się trzech kolejnych kodonów stop w pozycjach 106, 108 i 139 (ekson 7) oraz dalszych pięciu w pozycjach 156, 184, 208, 211, 247 (ekson 8). Dodatkowo w eksonach 6, 7 i 8 obecne są liczne mutacje, które powodują zmianę reszt aminokwasowych, z tym że nie mają one znaczenia z powodu wcześniejszej zmiany ramy odczytu. Wszystkie te mutacje powodują, że transkrypt zawierający wszystkie eksony nie może kodować białka o aktywności enzymatycznej. Sekwencja nukleotydowa 5’-fragmentu eksonu 8 o długości 370 pz człowieka wykazuje jedną różnicę w stosunku do sekwencji odpowiedniego genu szympansa, 10 różnic w stosunku do sekwencji orangutana, 23 różnice w stosunku do sekwencji wyjca i 46 różnic w stosunku do sekwencji krowy [12]. Istnieje teoria, że gen GGTA1 przestał kodować aktywne białko w wyniku pojawienia się kodonu stop w pozycji 260 w eksonie 8 (nukleotyd 800 u człowieka) [17].
Ryc. 2. Schemat budowy ludzkiego genu GGTA1 wraz z wariantami splicingowymi i delecjami powodującymi zmianę ramy odczytu. Czerwonymi kropkami zaznaczono przedwczesne kodony stop. Zaznaczono też kodon stop w pozycji 260, który był prawdopodobną przyczyną utraty aktywności białka kodowanego przez gen GGTA1. U gatunków, które nie mają epitopu Galα1-3Gal, występuje dodatkowy ekson niepodlegający translacji, zaznaczony szarym kolorem. Dodatkowy ekson 6a, obecny u ludzi i małp wąskonosych, zaznaczono czerwonym kolorem. Numeracja nukleotydów według genu człowieka, numeracja reszt aminokwasowych według genu krowy

Transkrypt genu GGTA1 u człowieka powinien zawierać 8 eksonów, jednak transkryptu takiego nie udało się sklonować z mRNA człowieka ani małp Starego Świata [19,22]. Sklonowano natomiast i zbadano sekwencję transkryptu, który zawiera eksony 1–6 oraz dodatkowy region na 3’-końcu o długości 801 nukleotydów. Sekwencja tego regionu jest homologiczna do środkowej części intronu 6 (od 4262 do 5063 nukleotydu), którą na potrzeby tej pracy można nazwać eksonem 6a [22]. Ten fragment genu zawiera konsensowy sygnał poliadenylacji (AATAA, od pozycji 5039), w wyniku czego następuje przyłączenie ogona poly (A) do 3’-końca jądrowego mRNA, natomiast sekwencja splicingowa na 5’-końcu nie jest kanoniczna (AG/CT). Wydaje się, że do terminacji transkryptu α1,3GalT dochodzi w wyniku działania wewnątrzintronowego sygnału poliadenylacji, który jest obecny w intronie siódmym. Następnie środkowy fragment tego intronu (od 4361 do 5163 nukleotydu) jest dołączany do eksonu szóstego [22]. Ekson 6a zawiera kodon stop (TGA) w pozycji 4265, czyli na 5’-końcu. Schemat wszystkich eksonów genu GGTA1 wraz z możliwymi formami splicingu, delecjami i kodonami stop przedstawiono na ryc. 2.
W bazie danych GenBank UniGene EST (Expressed Sequence Tag) znajdują się sekwencje 49 transkryptów homologicznych do genu GGTA1 człowieka. Większość z tych sekwencji zawiera eksony 1–6a, a tylko dwie zawierają eksony 1–8. Sugeruje to, że w czasie alternatywnego składania powstają oba typy mRNA, w skład których wchodzą eksony 1–8 i 1–6a, z tym że transkrypt 1–8 zostaje zdegradowany, prawdopodobnie w wyniku procesu degradacji mRNA niosącego przedwczesny kodon stop (NMD – nonsense-mediated mRNA decay). Jest to proces kontroli jakości mRNA, który powoduje zniszczenie cząsteczek mRNA zawierających przedwczesne kodony stop (PTC – premature termination codon). Dzięki temu mechanizmowi z transkryptów zawierających PTC nie powstają skrócone białka, które mogłyby być szkodliwe dla komórki [8]. Za przedwczesny kodon stop uważa się taki kodon stop, który znajduje się 50 pz lub dalej od miejsca splicingu na 3’ końcu ostatniego eksonu [25].
Uważa się, że w procesie NMD za rozpoznanie przedwczesnych kodonów stop odpowiadają białka kompleksów połączeń między eksonami (EJC – exon junction complex) oraz białka rodziny UPF, które aktywują mechanizm degradacji mRNA. Białka EJC w czasie składania transkryptu umiejscawiają się nieco powyżej każdego miejsca łączenia eksonów i opuszczają jądro razem z mRNA. Rybosom, przesuwając się po mRNA w czasie translacji, usuwa takie kompleksy. Jeżeli kodon stop pojawi się w eksonie, który nie jest ostatni, kompleks EJC nie zostanie usunięty z mRNA po pierwszej rundzie translacji, w wyniku czego nastąpi przyłączenie czynników UPF [24]. Jeżeli jednak kodon stop występuje w ostatnim eksonie, ale pojawi się zbyt wcześnie, to długi nieulegający translacji fragment 3’ może spowodować wiązanie czynników UPF, a w konsekwencji destabilizację i degradację mRNA. W tym przypadku NMD jest przede wszystkim skutkiem przedwczesnego uwolnienia rybosomów z mRNA, a czynnikiem, który może do tego nie dopuścić jest szybka recyrkulacja podjednostek rybosomów oraz czynników uwalniających. To z kolei jest możliwe tylko wtedy, kiedy kodon stop jest położony niedaleko od ogona poli-A [3].
W przypadku ludzkiego genu GGTA1, transkrypt składający się z eksonów 1–8 zawiera przedwczesny kodon stop w eksonie 7 (który jest przedostatni), co w świetle powyższych uwag może uruchomić mechanizm NMD i spowodować degradację takiego transkryptu. W tej sytuacji większość wykrywalnych transkryptów genu GGTA1 byłaby jego alternatywnie złożoną formą, składającą się z eksonów 1–6 oraz dodatkowego eksonu 6a. Zależność między alternatywnym składaniem i NMD omówili Moore i Proudfoot [31]. Warunkiem, który musi być spełniony, aby alternatywne składanie mogło zaistnieć, są słabe (niekanoniczne) sygnały splicingowe i długość intronu: im intron dłuższy, tym większe prawdopodobieństwo, że zostanie z niego „wykrojony” dodatkowy ekson [40]. W przypadku genu GGTA1, sygnał splicingowy na 5’-końcu eksonu 6a jest niekanoniczny; ponadto intron 6 ma długość 7822 pz, jest więc dłuższy niż przeciętny ludzki intron, którego długość wynosi około 3400 pz [7]. Można zaryzykować hipotezę, że degradacja mRNA genu GGTA1 zawierającego eksony 1-8 wpływa na spowolnienie transkrypcji, co z kolei umożliwia rozpoznanie słabych sygnałów splicingowych, a tym samym włączanie eksonu 6a. Sygnałem, który prawdopodobnie spowalnia transkrypcję, mogą być fragmenty mRNA [42]. Takie sprzężenie zwrotne między translacją, transkrypcją i składaniem mRNA było już wcześniej sugerowane [14,16]. Przykładem wpływu przedwczesnego kodonu stop na zmianę formy alternatywnego slicingu może być iduronidaza, enzym biorący udział w degradacji siarczanu heparanu. Mutacje w genie kodującym ten enzym powodują mukopolisacharydozę typu I (chorobę Hurlera). Wykazano, że usunięcie przedwczesnego kodonu stop powoduje pojawienie się w transkrypcie dodatkowego eksonu, który zawiera ten kodon [26].
Powstaje pytanie, dlaczego transkrypt zawierający eksony 1–6a nie ulega degradacji, mimo że w eksonie 6a znajduje się kodon stop, który można nazwać przedwczesnym według przedstawionych wyżej kryteriów. Prawdopodobnie główną rolę odgrywa tu sygnał poliadenylacji, który powoduje, że transkrypt kończy się na eksonie 6a, a tym samym wszystkie kompleksy EJC zostają usunięte przez rybosom. Dość duża odległość między tym sygnałem i kodonem stop (około 800 pz) najwyraźniej nie powoduje w tym przypadku uruchomienia mechanizmu NMD. Należy zauważyć, że w bazie danych sekwencji EST krowy wśród 70 transkryptów nie ma ani jednego transkrytpu zawierającego ekson 6a, co sugeruje, że w tym przypadku do alternatywnego splicingu nie dochodzi.
W genomie człowieka znajduje się pseudogen homologiczny do genu GGTA1, który również koduje enzym należący do rodziny 6 glikozylotransferaz. Jest to gen kodujący syntetazę Forssman, która katalizuje przyłączenie N-acetylogalaktozoaminy do N-acetylogalaktozoaminy z utworzeniem wiązania α1–3 [43]. Taka struktura cukrowa obecna na glikolipidach, nazywana antygenem Forssman, występuje na powierzchni komórek wielu gatunków kręgowców (np. kura, szczur, pies). Struktura antygenu Forssman to GalNAcα1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glcβ1-Ceramid. U człowieka oraz małp wąskonosych antygen ten nie występuje, a przyczyną są wielokrotne mutacje punktowe obecne w genie kodującym syntetazę Forssman. U człowieka gen ten składa się z 7 eksonów; przy czym (w przeciwieństwie do genu GGTA1) w transkrypcie obecne są wszystkie eksony [4]. Kodon stop znajduje się w eksonie 7, w miejscu homologicznym do kodonu stop w genie psa, nie ma natomiast dodatkowych kodonów stop ani delecji powodujących zmianę ramy odczytu [43]. W bazie danych GeneBank UniGene EST znajdują się sekwencje 98 transkryptów homologicznych do genu kodującego syntetazę Forssman, z czego większość zawiera eksony 1–7. Sugeruje to, że w komórkach obecny jest pełny traskrypt genu, który może pełnić jakąś rolę biologiczną [4]. Można więc wysunąć hipotezę, że w tym przypadku alternatywny splicing oraz mechanizm NMD nie występują, a przyczyną jest brak przedwczesnego kodonu stop.
EWOLUCJA GENU GGTA1
Epitop Galα1-3Gal nie jest obecny u ryb, płazów, gadów i ptaków. Uważa się, że struktura ta pojawiła się około 125 milionów lat temu, zanim nastąpiła dywergencja torbaczy i ssaków łożyskowych (obie te grupy mają epitop Galα1-3Gal) [29]. Strukturalne podobieństwo między genem GGTA1 i genem ABO, który koduje antygeny grupowe krwi A i B wskazuje, że oba te geny powstały w wyniku duplikacji jednego genu [17,36]. Ewolucyjną historię genu kodującego α1,3-galaktozylotransferazę zaproponowali Koike i wsp. [20]. Zgodnie z ich hipotezą, gen GGTA1 zachował funkcjonalność u niższych naczelnych (Strepsirhrini) i małp szerokonosych (Platyrrhini). Około 58 milionów lat temu, po rozdzieleniu się przodków małp i wyrakowatych, z genu GGTA1 powstał w wyniku retropozycji pseudogen pozbawiony intronów (processed pseudogen, PPG albo GGTA1P). Prawdopodobnie gen ten nie mógł ulegać transkrypcji ze względu na nieobecność sekwencji regulatorowych. W przeciwieństwie do funkcjonalnego genu GGTA1, pozbawiony intronów gen PPG nie podlegał regułom selekcji naturalnej i zgromadził wiele mutacji punktowych. Około 28 milionów lat temu GGTA1 utracił zdolność do kodowania aktywnego białka, prawdopodobnie w wyniku pojawienia się kodonu stop w pozycji 260, stał się pseudogenem (unprocessed pseudogene – UPG) i zaczęły się w nim gromadzić mutacje punktowe (ryc. 3).
Ryc. 3. Schemat ewolucji genu GGTA1. Kolorem niebieskim zaznaczono gatunki, które mają niefunkcjonalny gen UPG (nie zawiera intronów), zieloną strzałką zaznaczono niefunkcjonalny gen PPG (zawiera introny). Według [20]

Przyczyna, dla której jedyny znany przypadek utraty aktywności genu kodującego α1,3-galaktozylotransferazę zdarzył się u naczelnych, jest przedmiotem wielu kontrowersji. Wykazano, że zablokowanie genu GGTA1 powoduje przedwczesną zaćmę u myszy [39], a świnie pozbawione tego genu są małe, wątłe i trudne w hodowli [32]. Dane te sugerują, że gen GGTA1 odgrywa ważną rolę w homeostazie gatunków Galα1-3Gal-pozytywnych. Pomimo to, utrata aktywności tego genu nastąpiła bez wyraźnej szkody dla organizmów małp wąskonosych, co może sugerować, że α1,3-galaktozylotransferaza została zastąpiona przez inny enzym lub enzymy. Istnieje możliwość, że utrata antygenu Galα1-3Gal była związana z malejącym znaczeniem węchu w aktywności życiowej tych zwierząt. Wykazano, że w nabłonku narządu nosowo-lemieszowego u szczurów (VNO – vomeronasal organ), organu, który bierze udział w wykrywaniu feromonów, występuje dużo epitopów Galα1-3Gal [37]. U małp wąskonosych i człowieka narząd ten uległ zanikowi, podobnie jak zdolność do wykrywania feromonów [13,27]. Zmniejszenie się zależności od węchu mogło być związane z pojawieniem się widzenia trójbarwnego, co odbywało się prawie jednocześnie z zanikiem narządu nosowo-lemieszowego [20]. Tak więc można przedstawić hipotezę, że utrata epitopu Galα1-3Gal mogła być skutkiem tego, że organizmy zaczęły być w większym stopniu zależne od wzroku, w związku z czym zmysł węchu (wraz z epitopami Galα1-3Gal) nie był już tak potrzebny.
Uważa się, że zniknięcie epitopu Galα1-3Gal było związane z silną presją ewolucyjną, której były poddane organizmy należące do naczelnych. Można zauważyć, że presja ta musiała zaistnieć tylko w Europie, Azji i Afryce (czyli w Starym Świecie), ponieważ naczelne Nowego Świata nie utraciły epitopu αGal. Przyczyną tej presji była prawdopodobnie obecność epitopu Galα1-3Gal na powierzchni patogenów [12,18]. Wykazano, że naturalne ludzkie przeciwciała anty-Galα1-3Gal wiążą się do lipopolisacharydów bakterii rodzajów Escherichia, Neisseria, Klebsiella i Salmonella, a także glikolipidów i glikoprotein pierwotniaków, takich jak Trypanosoma, Leishmania i Plasmodium [11]. W tym przypadku, obecność przeciwciał anty-Galα1- 3Gal mogła odgrywać ważną rolę w obronie przeciwko tym patogenom [20].
Utrata epitopu Galα1-3Gal przez naczelne Starego Świata mogła być również korzystna z innych względów, ponieważ epitop Galα1-3Gal oraz podobne do niego antygeny, obecne na powierzchni komórek, mogą stanowić determinanty rozpoznawane przez bakterie, wirusy lub pierwotniaki. Przykładem takich oddziaływań może być wiązanie endotoksyny z Clostridium difficile do epitopu Galα1-3Gal na powierzchni komórek nabłonka jelit u chomika [21]. Również w tym przypadku, utrata epitopu Galα1-3Gal mogła być korzystna z punktu widzenia obrony przed tym patogenem [29].
Interesującym przypadkiem „mikroewolucji”, w wyniku której nastąpiła utrata epitopu Galα1-3Gal, jest linia komórkowa CHO komórek jajnika chomika chińskiego (chinese hamster ovary). Organizmy tego gatunku, podobnie jak wszystkie gryzonie, mają na powierzchni komórek epitop Galα1-3Gal, ale hodowane w laboratoriach komórki CHO nie mają go [38]. Przyczyną tego jest prawdopodobnie to, że w latach sześćdziesiątych ub.w. do hodowli komórek używano ludzkiej surowicy, która zawierała przeciwciała anty-Galα1-3Gal. Spowodowało to wyselekcjonowanie komórek, które nie mają tego epitopu.
PODSUMOWANIE
Brak epitopu Galα1-3Gal u wyższych naczelnych jest interesującym przykładem ewolucyjnego zaniku cechy, której obecność nie okazała się niezbędna. Pojawienie się przedwczesnego kodonu stop w genie kodujących α1,3- galaktozylotransferazę spowodowało dalsze zmiany w sekwencji i transkrypcji genu, których skutkiem jest brak białka kodowanego przez ten gen. Przedstawiona w niniejszej pracy teoria, zgodnie z którą przyczyną obecności u człowieka skróconego transkryptu genu GGTA1 było pojawienie się przedwczesnego kodonu stop w eksonie 7, które uruchomiło mechanizm NMD oraz alternatywny splicing, nie została na razie potwierdzona doświadczalnie i stanowi naszą autorską hipotezę.
PODZIĘKOWANIA
Autorzy dziękują Pani Profesor Elwirze Lisowskiej za przeczytanie manuskryptu i cenne uwagi. Dziękujemy też Pani Doktor Małgorzacie Cebrat za owocne dyskusje.
PIŚMIENNICTWO
[1] Almeida I.C., Milani S.R., Gorin P.A., Travassos L.R.: Complement-mediated lysis of Trypanosoma cruzi trypomastigotes by human anti-α-galactosyl antibodies. J. Immunol., 1991; 146: 2394-2400
[PubMed]  
[2] Blanken W.M., Van den Eijnden D.H.: Biosynthesis of terminal Gal α1-3Gal β1-4GlcNAc-R oligosaccharide sequences on glycoconjugates. Purification and acceptor specificity of a UDP-Gal:N-acetyllactosaminide α1-3-galactosyltransferase from calf thymus. J. Biol. Chem., 1985; 260: 12927-12934
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[3] Brogna S., Wen J.: Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) mechanisms. Nat. Struct. Mol. Biol., 2009; 16: 107-113
[PubMed]  
[4] Casals F., Ferrer-Admetlla A., Sikora M., Ramírez-Soriano A., Marques-Bonet T., Despiau S., Roubinet F., Calafell F., Bertranpetit J., Blancher A.: Human pseudogenes of the ABO family show a complex evolutionary dynamics and loss of function. Glycobiology, 2009; 19: 583-591
[PubMed]  
[5] Christiansen D., Milland J., Mouhtouris E., Vaughan H., Pellicci D.G., McConville M.J., Godfrey D.I., Sandrin M.S.: Human lack iGb3 due to nthe absence of functional iGb3-synthase: implications fro NKT cell development and transplantation. PLoS Biol., 2007; 6: e172
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[6] Cooper D.K., Koren E., Oriol R.: Genetically engineered pigs. Lancet, 1993; 342: 682-683
[PubMed]  
[7] Deutsch M., Long M.: Intron-exon structures of eukaryotic model organisms. Nucleic Acid. Res., 1999; 27: 3219-3228
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[8] Dzikiewicz A., Szweykowska-Kulińska Z.: Degradacja mRNA niosących przedwczesny kodon stop (NMD) - na straży jakości DNA. Post. Bioch., 2006; 52: 390-398
[PubMed]  
[9] Galili U.: Interaction of the natural anti-Gal antibody with α-galactosyl epitopes: a major obstacle for xenotransplantation in humans. Immunol. Today, 1993; 14: 480-482
[PubMed]  
[10] Galili U., Rachmilewitz E.A., Peleg A., Flechner I.: A unique natural human IgG antibody with anti-α-galactosyl specificity. J. Exp. Med., 1984; 160: 1519-1531
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[11] Galili U., Shohet S.B., Kobrin E., Stults C.L., Macher B.A.: Man, apes, and Old World monkeys differ from other mammals in the expression of alpha-galactosyl epitopes on nucleated cells. J. Biol. Chem., 1988; 263: 17755-17762
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[12] Galili U., Swanson K.: Gene sequences suggest inactivation of α-1,3-galactosyltransferase in Catarrhines after the divergence of apes from monkeys. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991; 88: 7401-7404
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[13] Gilad Y., Przeworski M., Lancet D.: Loss of olfactory receptor genes coincides with the acquisition of full trichromatic vision in primates. PLoS Biol., 2004; 2: E5
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[14] Gudikote J.P., Imam J.S., Garcia R.F., Wilkinson M.F.: RNA splicing promotes translation and RNA surveillance. Nat. Struct. Mol. Biol., 2005; 12: 801-809
[PubMed]  
[15] Hennet T.: The galactosyltransferase family. Cell Mol Life Sci., 2002; 59: 1081-1095
[PubMed]  
[16] Iborra F.J., Jackson D.A, Cook P.R.: Coupled transcription and translation within nuclei of mammalian cells. Science, 2001; 293: 1139-1142
[PubMed]  
[17] Joziasse D.H., Oriol R.: Xenotransplantation: the importance of the Galalpha1,3Gal epitope in hyperacute vascular rejection. Biochim. Biophys. Acta, 1999; 1455: 403-418
[PubMed]  
[18] Joziasse D.H., Shaper J.H., Jabs E.W., Shaper N.L.: Characterization of an α1-3-galactosyltransferase homologue on human chromosome 12 that is organized as a processed pseudogene. J. Biol. Chem., 1991; 266: 6991-6998
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[19] Koike C., Fung J.J., Geller D.A., Kannagi R., Libert T., Luppi P., Nakashima I., Profozich J., Rudert W., Sharma S.B., Starzl T.E., Trucco M.: Molecular basis of evolutionary loss of the α1,3-galactosyltransferase gene in higher primates. J. Biol. Chem., 2002; 277: 10114-10120
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[20] Koike C., Uddin M., Wildman D.E., Gray E.A., Trucco M., Starzl T.E., Goodman M.: Functionally important glycosyltransferase gain and loss during catarrhine primate emergence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007; 104: 559-564
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[21] Krivan H.C., Clark G.F., Smith D.F., Wilkins T.D.: Cell surface binding site for Clostridium difficile enterotoxin: evidence for a glycoconjugate containing the sequence Gal alpha 1-3Gal beta 1-4GlcNAc. Infect. Immun., 1986; 53: 573-581
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[22] Lanteri M., Giordanengo V., Vidal F., Gaudray P., Lefebvre J.C.: A complete α1,3-galactosyltransferase gene is present in the human genome and partially transcribed. Glycobiology, 2002; 12: 785-792
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[23] Larsen R.D., Rivera-Marrero C.A., Ernst L.K., Cummings R.D., Lowe J.B.: Frameshift and nonsense mutations in a human genomic sequence homologous to a murine UDP-Gal: β-D-Gal(1,4)-D-GlcNAc α(1,3)- galactosyltransferase cDNA. J. Biol. Chem., 1990; 265: 7055-7061
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[24] Le Hir H., Séraphin B.: EJCs at the heart of translational control. Cell, 2008; 133: 213-216
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[25] Lewis B., Green R., Brenner S.E.: Evidence for the widespread coupling of alternative splicing and nonsense-mediated mRNA decay in humans. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2003; 100: 189-192
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[26] Li B., Wachtel C., Miriami E., Yahalom G., Friedlander G., Sharon G., Sperling R., Sperling J.: Stop codons affect 5' splice site selection by surveillance of splicing. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2002; 99: 5277-5282
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[27] Liman E.R., Innan H.: Relaxed selective pressure on an essential component of pheromone transduction in primate evolution. Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 2003; 100: 3328-3332
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[28] Lisowska E., Duk M.: Diversity of natural anti-α-galactosyl antibodies in human serum. W: The molecular immunology of complex carbohydrates. red.: A.M. Wu, w druku
[29] Macher B.A., Galili U.: The Galα1,3Galβ1,4GlcNAc-R (α-Gal) epitope: a carbohydrate of unique evolution and clinical relevance. Biochim. Biophys. Acta, 2008; 1780: 75-88
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[30] Milland J., Christiansen D., Lazarus B.D., Taylor S.G., Xing P.X., Sandrin M.S.: The molecular basis for galalpha(1,3)gal expression in animals with a deletion of the alpha1,3galactosyltransferase gene. J. Immunol., 2006; 176: 2448-2454
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[31] Moore M.J., Proudfoot N.J.: Pre-mRNA processing reaches back to transcription and ahead to translation. Cell, 2009; 13: 688-700
[PubMed]  
[32] Phelps C.J., Koike C., Vaught T.D., Boone J., Wells K.D., Chen S.H., Ball S., Specht S.M., Polejaeva I.A., Monahan J.A., Jobst P.M., Sharma S.B., Lamborn A.E., Garst A.S., Moore M., Demetris A.J., Rudert W.A., Bottino R., Bertera S., Trucco M., Starzl T.E., Dai Y., Ayares D.L.: Production of alpha 1,3-galactosyltransferase-deficient pigs. Science, 2003; 299: 411-414
[PubMed]  
[33] Ravindran D., Satapathy A.K., Das M.K.: Naturally occuring anti-α-galactosyl antibodies in human Plasmodium falciparum infections - a possible role for autoantibodies in malaria. Immunol. Lett., 1988; 19: 137-141
[PubMed]  
[34] Sachs D.H.: The pig as a xenograft donor. Pathol Biol., 1994; 42: 217-219
[PubMed]  
[35] Sharma A., Naziruddin B., Cui C., Martin M.J., Xu H., Wan H., Lei Y., Harrison C., Yin J., Okabe J., Mathews C., Stark A., Adams C.S., Houtz J., Wiseman B.S., Byrne G.W., Logan J.S.: Pig cells that lack the gene for alpha1-3 galactosyltransferase express low levels of the gal antigen. Transplantation, 2003; 75: 430-436
[PubMed]  
[36] Smolarek D., Krop-Wątorek A., Waśniowska K., Czerwiński M.: Molekularne podstawy układu grupowego ABO. Post. Hig. Med. Dośw., 2008, 62: 4-17
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[37] Takami S., Getchell M.L., Getchell T.V.: Resolution of sensory and mucoid glycoconjugates with terminal alpha-galactose residues in the mucomicrovillar complex of the vomeronasal sensory epithelium by dual confocal laser scanning microscopy. Cell Tissue Res., 1995; 280: 211-216
[PubMed]  
[38] Takeuchi M, Inoue N, Strickland TW, Kubota M, Wada M, Shimizu R, Hoshi S, Kozutsumi H, Takasaki S, Kobata A.: Relationship between sugar chain structure and biological activity of recombinant human erythropoietin produced in Chinese hamster ovary cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1989; 86: 7819-7822
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[39] Tearle R.G., Tange M.J., Zannettino L., Katerelos M., Shinkel T.A., Van Denderen B.J., Lonie A.J., Lyons I., Nottle M.B., Cox T., Becker C., Peura A.M., Wigley P.L., Crawford R.J., Robins A.J., Pearse M.J., d'Apice A.J.: The alpha-1,3-galactosyltransferase knockout mouse. Implications for xenotransplantation. Transplantation, 1996; 61: 13-19
[PubMed]  
[40] Tian B., Pan Z., Lee J. Y.: Widespread mRNA polyadenylation events in introns indicate dynamic interplay between polyadenylation and splicing. Genome Res., 2007; 17: 156-165
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[41] Turcot-Dubois A.L., le Moullac-Vaidye B., Despiau S., Roubinet F., Bovin N., le Pendu J., Blancher A.: Long-term evolution of the CAZY glycosyltransferase 6 (ABO) gene family from fishes to mammals - a birth-and-death evolution model. Glycobiology, 2007; 17: 516-528
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[42] Wen J., Brogna S.: Nonsense-mediated mRNA decay. Biochem. Soc. Trans., 2008; 36: 514-516
[PubMed]  
[43] Xu H., Storch T., Yu M., Elliott S.P., Haslam D.B.: Characterization of the human Forssman synthetase gene. An evolving association between glycolipid synthesis and host-microbial interactions. J. Biol. Chem., 1999; 274: 29390-29398
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.