Postepy Hig Med Dosw. (online), 2008; 62: 322-327
Review
Full Text PDF  

Różnicowanie izolatów Staphylococcus aureus w oparciu o cechy fenotypowe
Differentiation of Staphylococcus aureus isolates based on phenotypical characters
Jacek Międzobrodzki1  , Natalia Małachowa1  , Tomasz Markiewski1  , Anna Białecka2  , Andrzej Kasprowicz2  
1Zakład Mikrobiologii, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński w Krakowie
2Centrum Badań Mikrobiologicznych i Autoszczepionek im. dra Jana Bobra w Krakowie
Adres do korespondencji
dr hab. Jacek Międzobrodzki, Zakład Mikrobiologii, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński, ul. Gronostajowa 7, 30-387 Kraków; e-mail: jacekmie@mol.uj.edu.pl

Źródło finansowania
Praca zrealizowana w ramach grantu nr PBZ-KBN-101/T09/2003/14.

Otrzymano:  2008.05.18
Zaakceptowano:  2008.06.20
Opublikowano:  2008.06.30

Streszczenie
Nieodzownym postępowaniem w monitorowaniu przenoszenia bakterii gatunku Staphylococcus aureus między nosicielami i w epidemiologii jest typowanie wyodrębnionych izolatów. Ocena poziomu pokrewieństwa między izolatami zależy od czynników epidemiologicznych i jest możliwa dzięki klonalnemu charakterowi gatunku S. aureus. Skuteczne typowanie unaocznia schemat przenoszenia się zakażenia na ograniczonym obszarze, umożliwiający identyfikację rezerwuaru drobnoustrojów i wspomagający skuteczność eradykacji. W pracy przedstawiono wiele metod typowania stosowanych w analizach zależności epidemiologicznych oraz w identyfikacji szczepów z gatunku S. aureus. Opisano następujące metody typowania: biotypowanie, serotypowanie, typowanie bakteriofagowe, antybiogram, elektroforezę białek, profil białek komórkowych, immunoblotting, metodę MLEE (multilocus enzyme electrophoresis), zymotypowanie oraz standardową metodę identyfikacji gatunkowej S. aureus stosowaną w laboratorium diagnostycznym. Przegląd obejmuje metody fenotypowania izolatów S. aureus stosowane w przeszłości i współcześnie w badaniach epidemiologicznych oraz w analizach współzależności między nimi. Przedstawione w pracy metody wykorzystują cechy morfologiczne, właściwości fizjologiczne i struktury chemiczne bakterii jako kryteria do typowania. Dokładność tych standardowych metod nie zawsze jest satysfakcjonująca, np. opisywanych ostatnio szczepów S. aureus o nietypowych cechach biochemicznych. Wobec powyższego wydaje się, że niezależnie od stosowanych metod fenotypowych rysuje się potrzeba wprowadzenia uzupełniających metod typowania genetycznego wykorzystujących metody biologii molekularnej.
Słowa kluczowe: Staphylococcus aureus • metody fenotypowe • diagnostyka bakteriologiczna


Summary
Typing of Staphylococcus aureus isolates is a necessary procedure for monitoring the transmission of S. aureus among carriers and in epidemiology. Evaluation of the range of relationship among isolates rely on epidemiological markers and is possible because of the clonal character of S. aureus species. Effective typing shows the scheme of transmission of infection in a selected area, enables identifying the reservoir of the microorganism, and may enhance effective eradication. A set of typing methods for use in analyses of epidemiological correlations and the identification of S. aureus isolates is presented. The following methods of typing are described: biotyping, serotyping, antibiogram, protein electrophoresis, cell protein profiles (proteom), imolemunoblotting, multilocus enzyme electrophoresis (MLEE), zymotyping, and standard species identification of S. aureus in the diagnostic laboratory. Phenotyping methods for S. aureus isolates used in the past and today in epidemiological investigations and in analyses of correlations among S. aureus isolates are presented in this review. The presented methods use morphological characteristics, physiological properties, and chemical structures of the bacteria as criteria for typing. The precision of these standard methods is not always satisfactory as S. aureus strains with atypical biochemical characters have evolved recently. Therefore it is essential to introduce additional typing procedures using molecular biology methods without neglecting phenotypic methods.
Key words: Staphylococcus aureus • phenotypic methods • bacteriological diagnostics




WPROWADZENIE
Bakterie z gatunku Staphylococcus aureus (gronkowiec złocisty) są wszechobecne w biosferze. Kolonizują one różne środowiska, ale rezerwuarem ich są ludzie i zwierzęta, gdyż gronkowce rozmnażają się tylko w wyższych organizmach. U zdrowych ludzi stanowią one główny składnik mikroflory prawidłowej skóry i błon śluzowych, ale mogą także być przyczyną zakażeń endogennych lub egzogennych u osobników z predyspozycją do zakażenia. Jest to podstawą zaliczenia tych bakterii do tzw. mikroflory oportunistycznej lub względnie komensalnej. Gatunek S. aureus stanowi obecnie także jeden z głównych czynników etiologicznych zakażeń szpitalnych. Na początku lat sześćdziesiątych dwudziestego wieku po raz pierwszy w Europie odnotowano epidemie powodowane przez metycylinooporne szczepy tego gatunku (methicillin resistant Staphylococcus aureus – MRSA), aby wkrótce rozprzestrzenić się na cały świat i urosnąć do rangi globalnego problemu epidemiologicznego. Oporność szczepów MRSA na wiele różnych leków, ale przede wszystkim ich oporność na działanie antybiotyków beta-laktamowych (penicylinowych) uczyniły zakażenia powodowane przez te szczepy niebywale trudne i kosztowne w leczeniu [12,17,37]. Z tego względu tak dużą wagę przywiązuje się obecnie do lokalizacji źródeł zakażeń i kontroli rozprzestrzeniania się szczepów MRSA.
Czynnik etiologiczny powodujący epidemię infekcji wywodzi się od pojedynczej komórki, której potomstwo jest genetycznie identyczne lub blisko spokrewnione z organizmem źródłowym (tzw. charakter klonalny czynnika etiologicznego). Mikroorganizmy, które są klonalnie pokrewne mają takie same czynniki wirulencji, cechy biochemiczne oraz właściwości genomowe. Jednakże w obrębie gatunku S. aureus obserwuje się dużą różnorodność wśród występujących organizmów, które izolowane z różnych źródeł w różnym czasie oraz z różnych obszarów geograficznych można zakwalifikować do wielu różnych typów lub szczepów.
Typowanie bakteryjnych izolatów lub podgatunków (subspeciation) jest niezbędnym narzędziem w kontroli rozprzestrzeniania się nosicielstwa szczepów S. aureus oraz w badaniu epidemii. Ze względu na klonalny charakter rozprzestrzeniania się zakażeń bakteriami gatunku S. aureus niezmiernie istotne jest określenie stopnia pokrewieństwa analizowanych izolatów klinicznych na podstawie markerów epidemiologicznych. Właściwie dobrana metoda typowania pozwala na uzyskanie obrazu transmisji zakażeń na badanym obszarze oraz umożliwia znalezienie źródła pochodzenia danego ustroju i tym samym prowadzi do jego skutecznej eradykacji. W trakcie długo trwającej rywalizacji człowieka z gronkowcem złocistym opracowano wiele metod typowania, określających korelacje epidemiologiczne szczepów S. aureus oraz identyfikacji szczepów należących do tego gatunku. Historycznie pierwsze zostały opracowane metody fenotypowe oparte na prezentowanych przez bakterie cechach będących wynikiem ekspresji genów oraz poniekąd oddziaływania środowiska zewnętrznego. W pracy przedstawiono metody fenotypowania szczepów S. aureus, które były – a niektóre z nich są nadal – stosowane w dochodzeniach epidemiologicznych oraz badaniach korelacji wśród szczepów gronkowca złocistego.
BIOTYPOWANIE
W badaniach epidemiologicznych lub ekologicznych, w celu precyzyjnego określenia źródła szczepu i drogi jego rozprzestrzeniania się, może zaistnieć potrzeba podania dokładniejszej charakterystyki analizowanych szczepów i podzielenia ich na jeszcze mniejsze jednostki systematyczne. System biotypowania pozwala na różnicowanie szczepów S. aureus ludzkich i zwierzęcych w poszczególne biotypy i warianty ekologiczne (ecovars). Biotypowanie opiera się na czterech podstawowych reakcjach: reakcji wytwarzania stafylokinazy, β-hemolizyny, koagulacji osocza bydlęcego oraz typie wzrostu pojedynczych kolonii na agarze z fioletem krystalicznym [11]. Inny system zaproponowany przez Brytyjczyków sugerował podział gronkowców złocistych na sześć biotypów oznaczonych literami od A do F. Podstawą tego podziału są różnice w wytwarzaniu metabolitów, takich jak stafylokinaza (fibrynolizyna), pigment, hemolizyny alfa i beta, czynnik zlepiania (clumbing factor), zdolność wykrzepiania osocza ludzkiego lub wołowego, wzrost na agarze z fioletem krystalicznym, możliwość typowania zestawem fagów, a także pochodzenie izolatu [20].
SEROTYPOWANIE
Immunologiczna analiza antygenów powierzchniowych komórki, czyli metoda serotypowania szczepów S. aureus jest najpowszechniej wykorzystywana do określania typu serologicznego otoczki oraz typu koagulazy [39]. Mimo że zidentyfikowano 11 typów otoczkowych dla gatunku S. aureus, aż 85–90% klinicznych izolatów MRSA należy do 5 lub 8 serotypu otoczkowego [45]. Tak więc metoda ta ma niską siłę różnicującą i stosowana jest tylko w Japonii [25]. Pomimo to typowanie serologiczne może być metodą uzupełniającą do innych metod typowania szczepów S. aureus. U bakterii tych znanych jest obecnie ponad trzydzieści aglutynogenów (występujących na powierzchni komórki różnych determinant antygenowych wielocukrowych i białkowych). W oparciu o te aglutynogeny stosuje się dwie metody typowania serologicznego: metodę Oedinga i Haukenesa oraz metodę Pilleta [20]. W obu tych metodach bada się aglutynację szczepów z surowicami typowymi lub wzorcowymi. W pierwszej metodzie zastosowanie znajduje czternaście surowic wzorcowych. Wychodząc z założenia, że każdy szczep ma na swej powierzchni kilka aglutynogenów, może być aglutynowany przez kilka surowic. W ten sposób uzyskuje się wzór serologiczny dla pojedynczego szczepu. Druga metoda – Pilleta, opiera się też na około czternastu surowicach typowych, z których każda aglutynuje szczep tylko jednego typu. Niewątpliwą zaletą typowania serologicznego tymi metodami jest stabilność aglutynogenów i możliwość typowania szczepów dających się typować fagami. Wadą tej metody jest brak standardów typowania kontrolowanych przez jeden ośrodek referencyjny.
TYPOWANIE BAKTERIOFAGOWE
Koncepcja typowania gronkowców za pomocą bakteriofagów została opracowana w latach czterdziestych XX wieku. Fagi wyróżnia określona swoistość (lytic spectrum), a bakterie mają określony wzór fagowy (phage pattern), gdyż lizowane są przez określone fagi. Jest to podstawą do wyróżnienia fagowych grup, a także odpowiadających im grup bakterii typowanych tymi fagami. Do typowania ludzkich szczepów gatunku S. aureus stosuje się międzynarodowy zestaw fagów tworzących cztery podstawowe grupy, od I do IV, oraz dodatkową grupę mieszaną [20].
System typowania fagami został wystandaryzowany przez International Subcommittee on Phage Typing of Staphylococci [31]. Od tego czasu stosuje się międzynarodowy zestaw 23 bakteriofagów. Częstokroć dodatkowo używa się dwóch miejscowo wyselekcjonowanych fagów, które stają się bardzo pomocne w typowaniu szczepów niereagujących na międzynarodowy zestaw fagowy. Liza komórek bakteryjnych powodowana przez bakteriofagi prowadzi do powstawania tzw. łysinek. Rozróżnia się dwa typy reakcji typowania bakteriofagami, reakcję silną i słabą. Reakcja silna zachodzi wtedy, gdy liczba powstałych łysinek na szalce przekracza pięćdziesiąt. Podczas typowania uzyskuje się niekiedy wynik reakcji słabej, jednak do określania pokrewieństwa badanych szczepów wykorzystuje się jedynie wynik uzyskany w reakcji silnej. Tylko taki jest wynikiem branym pod uwagę i statystycznie istotnym. Jeśli u gronkowców nie obserwuje się lizy komórek w trakcie zastosowania standardowego rozcieńczenia (RTD – routine test dilution) wówczas stosuje się stukrotnie wyższe stężenie fagów (100 × RTD).
Przez wiele lat metoda typowania bakteriofagami była powszechnie stosowaną metodą typowania szczepów gatunku S. aureus, a także kontrolowania rozprzestrzeniania się szczepów MRSA. Dzięki tej metodzie zidentyfikowano wiele epidemii. Metoda ta ma zdecydowanie większą siłę dyskryminującą niż inne metody fenotypowe, takie jak zymotypowanie czy określanie typu otoczkowego [10,21,33,36].
Wartość tej metody w odniesieniu do szczepów MRSA obniża wysoki odsetek szczepów niemieszczących się w podstawowym zestawie fagów. Niektóre źródła donoszą, że prawie 20-30% szczepów MRSA nie poddaje się typowaniu bakteriofagami [1,39], ale wyniki uzyskane przez Khalifa i wsp. wskazują, że populacja szczepów MRSA niedających się typować fagami może stanowić nawet 75% wszystkich wyizolowanych szczepów [22]. W związku z tak wysokim odsetkiem szczepów nietypowanych wartość uzyskiwanych informacji o pokrewieństwie szczepów jest znacząco zaniżona ze względu na niemożność określenia stopnia pokrewieństwa szczepów nietypowanych. Wartość tej metody jest także znacznie ograniczona z powodu braku powtarzalności uzyskiwanych wyników. Te same szczepy mogą dawać różne wyniki kiedy są typowane na przestrzeni czasu. Problem ten narasta wówczas, gdy przeprowadza się długoterminowe badania nad kolekcją szczepów. Ograniczona powtarzalność testu, bardzo duży nakład pracy powiązany z utrzymaniem fagów i jakości kontroli oraz występowanie szczepów niedających się typować fagami, obniżyły znaczenie tej metody w ciągu ostatniego dziesięciolecia. Pewne nadzieje można wiązać z ewentualnym przyszłym nowym zestawem fagów [33].
ANTYBIOGRAM – OCENA PROFILU LEKOWRAŻLIWOŚCI
Typowanie na podstawie profilu lekowrażliwości/lekooporności stanowi oprócz fagotypowania podstawową metodę różnicowania szczepów S. aureus wśród kilku metod fenotypowych [3]. Metoda ta zyskała szerokie uznanie w placówkach diagnostycznych dzięki swojej względnej łatwości wykonania, a co ważniejsze jako jedna z nielicznych metod jest metodą wystandaryzowaną. Polskie laboratoria, podobnie jak wiele innych w świecie, posługują się standardami NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards – Approved Standards, Fifth Edition NCCLS document M7-A5, 2000), co umożliwia porównywanie wyników między różnymi ośrodkami diagnostycznymi.
Na podstawie obecności lub braku cech oporności, szczepy mogą być różnicowane lub grupowane do tego samego klonu [4]. Wzór oporności bakterii na antybiotyki w pewnej mierze zależy od środowiska w jakim znajdują się dane szczepy. W związku z tym identyczne antybiogramy mogą charakteryzować szczepy niespokrewnione jako wynik podobnej selektywnej presji parametrów otoczenia. Może zachodzić również sytuacja odwrotna, w której izolaty tego samego klonu mogą przejawiać różne wzory lekowrażliwości w związku z nabyciem lub utratą plazmidów niosących geny oporności [4,15,42]. W większości przypadków, antybiogram nie może być użyty jako podstawowa metoda typowania szczepów MRSA. Jednak czasami wzór wrażliwości endemicznego lub epidemicznego klonu może być tak różniący się w obrębie badanej populacji, że antybiogram będzie wystarczającą metodą do wyselekcjonowania takiego szczepu.
W badaniach rutynowych znajduje zastosowanie dyfuzyjno- krążkowa metoda oznaczania wrażliwości szczepów na antybiotyki, zwana od nazwisk jej autorów metodą Kirby- Bauera [2]. W laboratoriach diagnostycznych, oprócz metody dyfuzyjno-krążkowej, stosowane są także metody rozcieńczeniowe, np. E-test.
ELEKTROFOREZA BIAŁEK: ANALIZA PROFILU BIAŁEK KOMÓRKOWYCH
Rozwój technik elektroforetycznych pozwala porównywać szczepy w oparciu o różnice białek komórkowych powierzchniowych i wydzielniczych lub wszystkich białek po uprzednim zlizowaniu komórek. Analiza wszystkich białek komórkowych otrzymanych po degradacji komórek poddanych działaniu lizostafyny może być wykonana techniką elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (polyacryl gel electrophoresis – PAGE). Wynikiem takiego rozdziału elektroforetycznego jest powtarzalny charakterystyczny wzór złożony z około pięćdziesięciu prążków [9,14,43]. Uzyskiwane tą metodą różnice pomiędzy niespokrewnionymi szczepami MRSA są nieznaczne, co z kolei powoduje, iż siła różnicująca takiej metody jest niewielka. Mała niekiedy powtarzalność takich rozdziałów elektroforetycznych a tym samym niemożność porównania próbek szczepów z różnych żeli otrzymanych po analizie elektroforetycznej oraz niewielkie powiązanie wyników z innymi metodami, np. typowaniem za pomocą bakteriofagów, stawia tę metodę w rzędzie technik o niewielkiej przydatności do typowania szczepów S. aureus, a zupełnie małej do typowania MRSA na szerszą skalę [46].
ELEKTROFOREZA BIAŁEK: IMMUNOBLOTTING
Jednym ze sposobów udoskonalenia analizy białek, w celu podniesienia jej wiarygodności, jest wykonanie reakcji Western-blot z użyciem znakowanych przeciwciał antygronkowcowych z rozdzielonymi w trakcie elektroforezy antygenami tego szczepu. Źródłem takich przeciwciał może być zarówno surowica królicza po wcześniejszej ekspozycji zwierzęcia na S. aureus jak i mieszana surowica ludzka, przy założeniu, że wystarczająca liczba dawców miała kontakt z patogenem. Immunoblotting jest, w mniejszym stopniu niż poprzednio omówiona analiza białek komórkowych, podatny na zmiany warunków fizykochemicznych podczas elektroforezy. Metodą tą uzyskuje się mniej prążków niż metodą elektroforezy białek, przez co interpretacja wyników staje się łatwiejsza i jednoznaczna. Wszystkie szczepy S. aureus są typowalne tą metodą, chociaż podczas epidemii metoda może nie dawać wystarczającego zróżnicowania, aby prawidłowo wykluczyć niespokrewnione izolaty [8,14,28].
ELEKTROFOREZA BIAŁEK: MLEE
Metoda MLEE (multilocus enzyme electrophoresis) pozwala na wykrycie zróżnicowania allelicznego wśród patogenów zarówno ludzkich, jak i zwierzęcych, w tym także wśród szczepów gronkowca złocistego. Typowanie metodą MLEE oparte jest na polimorfizmie badanych enzymów komórkowych. Stopień migracji poszczególnych białek zależy bezpośrednio od ich składu aminokwasowego, w związku z czym ponad 80% jednostkowych zmian w składzie aminokwasowym wykrywa się w oparciu o różnice własności elektroforetycznych badanych białek. Zmienność enzymatyczna jest odzwierciedleniem różnic genetycznych powstałych w loci tych enzymów. Szczepy bakteryjne mogą zostać zaklasyfikowane do poszczególnych typów elektroforetycznych (electrophoretic types – ET) na podstawie otrzymanych wzorów elektroforetycznych. Natomiast stopień pokrewieństwa izolatów jest określany na podstawie podobieństw i różnic występujących w profilu elektroforetycznym tych izolatów.
W przypadku diagnostyki szczepów MRSA wszystkie izolaty są typowalne, a powtarzalność metody jest zadawalająca. Siła różnicująca tej metody zależy jednak w pewnej mierze od tego, które enzymy zostały wybrane do analizy, gdyż niektóre z nich mogą się okazać monomorficzne nawet w obrębie znacznej kolekcji przebadanych szczepów.
Całkowita liczba analizowanych enzymów waha się w granicach od dwunastu do dwudziestu, ale względna siła różnicująca każdego z nich nie została dotąd oceniona [29,30,43]. Tak więc nie jest możliwe stwierdzenie, jaka jest optymalna kombinacja enzymów pozwalająca na prawidłowe zróżnicowanie szczepów.
ELEKTROFOREZA BIAŁEK: ZYMOTYPOWANIE
Zymotypowanie jest jedną z odmian metody elektroforezy typu MLEE. Opiera się na polimorfizmie enzymów gronkowcowych należących do grupy lipaz, esteraz. Branger i wsp. zidentyfikowali trzy typy esteraz A, B i C [5]. Polimorfizm enzymów jest określany na podstawie różnic w ruchliwości elektroforetycznej w żelu poliakrylamidowo- agarozowym spowodowanych różnym zakresem aktywności wobec pięciu syntetycznych substratów: α- i β-octanu naftylu, octanu indoksylu oraz α- i β-maślanu naftylu, a także oporności na dwuizopropylofluorofosforan [5]. Podobnie jak w metodzie MLEE szczepy są typowane na podstawie obserwowanych różnic w ruchliwości elektroforetycznej esteraz wyizolowanych z badanych szczepów S. aureus. Większość doniesień na temat przeprowadzonych badań z użyciem tej metody pochodzi od jednego zespołu badawczego, który stosował tę metodę do typowania kolekcji szczepów S. aureus zarówno wrażliwych jak i opornych na metycylinę. Wyodrębniono wówczas dwadzieścia sześć zymotypów, z których czternaście należało do szczepów MRSA. Jak dotąd wszystkie szczepy są typowalne, a otrzymywany wzór jest powtarzalny i niezmienny. Trudno jest jednak jednoznacznie stwierdzić czy podobieństwa wśród esteraz są odzwierciedleniem pokrewieństw genetycznych między tymi szczepami [5,6,39].
IDENTYFIKACJA GATUNKOWA S. AUREUS W LABORATORIUM DIAGNOSTYCZNYM
Materiały kliniczne diagnozowane pod kątem obecności S. aureus można posiewać na podłoże agarowe z 5% krwią baranią lub podłoża wybiórcze, np. podłoże Chapmana albo Baird Parkera. Charakterystyczne kolonie gronkowców izolowane z odpowiednich podłoży poddaje się dalszej szczegółowej analizie. W rutynowej diagnostyce laboratoryjnej, w identyfikacji gronkowców do gatunku, stosuje się metody biochemiczne, pozwalające na wykrycie:
• białka CF (clumping factor) – test szkiełkowy z plazmą króliczą;
• koagulazy wolnej – test probówkowy z rozcieńczoną plazmą króliczą;
• DNA-zy termostabilnej;
• wykrycie jednoczesne CF, białka A, a niekiedy antygenów otoczki polisacharydowej, z zastosowaniem lateksowych testów komercyjnych;
• cech biochemicznych z zastosowaniem komercyjnych testów diagnostycznych.
Szczepy bakteryjne zidentyfikowane w ten sposób w rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej mogą być poddane dalszym metodom analizy genetycznej stosowanym w dochodzeniach epidemiologicznych [18,41].
PODSUMOWANIE
Konwencjonalna identyfikacja gatunków gronkowców oparta jest na charakterystyce morfologicznej, właściwościach fizjologicznych oraz chemicznym składzie ściany komórkowej [1,7,19,23,35]. Dokładność konwencjonalnych testów jest niewielka i mieści się w przedziale 50–70% [16,19,32]. Ze względu na to, że fenotyp charakteryzujący dany szczep powstaje dzięki współoddziaływaniu genotypu bakterii oraz czynników środowiskowych, dochodzić może do sytuacji, kiedy szczepy niespokrewnione, pod wpływem działania selekcyjnej presji środowiska zewnętrznego, będą charakteryzowały się identycznymi profilami, co z kolei prowadzi do błędnego określenia korelacji epidemiologicznych zachodzących między tymi szczepami. Zatem opracowanie metod szybkiej i dokładnej identyfikacji gronkowców stało się niezmiernie ważne, gdyż umożliwia wczesne wykrywanie ich potencjalnej zdolności do powodowania określonego stanu chorobowego, ustalenie wrażliwości na antybiotyki oraz może być pomocne w wyjaśnieniu klinicznego znaczenia każdego gatunku.
Obecnie główną rolę w typowaniu bakterii, a w tym także gatunku S. aureus przejęły metody molekularne oparte na analizie genomu bakteryjnego [24,26,38], zwłaszcza w przypadkach zakażeń powodowanych przez atypowe szczepy niemające typowych cech biochemicznych [13,27,44]. Natomiast diagnostyczne metody fenotypowe odgrywają istotną rolę w określeniu rodzaju i gatunku analizowanych szczepów oraz pełnią funkcję metod pomocniczych w typowaniu epidemiologicznym [34,40]. Zestawienie różnych metod fenotypowych stosowanych dawniej i obecnie w różnicowaniu bakterii gatunku S. aureus przedstawia tabela 1.
Tabela 1. Metody różnicowania izolatów gatunku Staphylococcus aureus w oparciu o cechy fenotypowe

Największe wyzwanie stanowi przeprowadzenie analizy, która miarodajnie i wiarygodnie będzie grupować szczepy epidemiologicznie spokrewnione oraz pozwoli wyróżniać je od szczepów niespokrewnionych. Zwyczajowo systemy typowania stosuje się do analizy epidemii szpitalnych, ale są one także pomocne w leczeniu pacjentów pozwalając określić, czy dana infekcja jest infekcją pierwotną czy też nawracającą. Metody typowania przede wszystkim jednak umożliwiają poznanie i zrozumienie epidemiologii zakażeń.
PIŚMIENNICTWO
[1] Bannerman T.L., Hancock G.A., Tenover F.C., Miller J.M.: Pulsed field gel elctrophoresis as a replacement for bacteriophage typing Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol., 1995; 33: 551-555
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[2] Bauer A.W., Kirby W.M., Sherris J.C., Turck M.: Antibiotic susceptibility testing by a standardized disk method. Am. J. Clin. Pathol., 1966; 45: 493-496
[PubMed]  
[3] Blanc D.S., Lugeon C., Wenger A., Siegrist H.H., Francioli P.: Quantitative antibiogram typing using inhibition zone diameters compared with ribotyping for epidemiological typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol., 1994; 32: 2505-2509
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[4] Blanc D.S., Petignat C., Moreillon P., Wenger A., Bille J., Francioli P.: Quantitative antibiogram as a typing method for the prospective epidemiological survellance and control of MRSA: Comparison with molecular typing. Infect. Control. Hosp. Epidemiol., 1996; 17: 654-659
[PubMed]  
[5] Branger C., Goullet P.: Esterase electrophoretic polymorphism of methicillin-sensitive and methicillin-resistant strains of Staphylococcus aureus. J. Med. Microbiol., 1987; 24: 275-281
[PubMed]  
[6] Branger C., Goullet P.: Genetic heterogeneity in methicillin-resistant strains of Staphylococcus aureus revealed by esterase electrophoretic polymorphism. J. Hosp. Infect., 1989; 14: 125-134
[PubMed]  
[7] Brun Y., Bes M., Boeufgras J.M., Monget D., Fleurette J., Auckenthaler R., Devriese L.A., Kocur M., Marples R.R., Piemont Y.: International collaborative evaluation of the ATB 32ostaph gallery for identification of the Staphylococcus species. Zentralbl. Bakteriol., 1990; 273: 319-326
[PubMed]  
[8] Burnie J.P., Matthews R.C., Lee W., Murdoch D.: A comparisn of immunoblot and DNA restriction patterns in characteristing methicillin-resistant isolates of Staphylococcus aureus. J. Med. Microbiol., 1989; 29: 255-261
[PubMed]  
[9] Costas M., Cookson B.D., Talsania H., Owen R.: Numerical analysis of electrophoretic protei patterns of methicillin-resistant strains of Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol., 1989; 27: 2574-2581
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[10] Cox R.A., Conquest C., Mallaghan C., Marples R.R.: A major outbreak of methicillin-resistant Staphylococcus aureus caused by a new phage-type (EMRSA-16). J. Hosp. Infect., 1995; 29: 87-106
[PubMed]  
[11] Devriese L.A.: A simplified system for biotyping Staphylococcus aureus strains isolated from animal species. J. Appl. Bacteriol., 1984; 56: 215-220
[PubMed]  
[12] Dzierżanowska D.: Antybiotykoterapia praktyczna. α-medica press, Bielsko-Biała, 2000
[13] Garbacz K., Galiński J.: Atypowe szczepy gronkowca złocistego (Staphylococcus aureus) nie posiadające koagulazy lub czynnika zlepnego (CF). Post. Mikrobiol., 2006; 45: 39-43
[Full Text PDF]  
[14] Gaston M.A., Duff P.S., Naidoo J., Ellis K., Roberts J.I., Richardson J.F., Marples R.R., Cooke E.M.: Evaluation of electrophoretic methods for typing methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Med. Microbiol., 1988; 26: 189-197
[PubMed]  
[15] Gillespie M.T., Lyon B.R., Skurray R.A.: Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by antibiotic resistance phenotypes. J Med Microbiol., 1990; 31: 57-64
[PubMed]  
[16] Grant C.E., Sewell D.L., Pfaller M., Bumgardner R.V., Williams J.A.: Evaluation of two commercial systems for identification of coagulase-negative staphylococci to species level. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 1994; 18: 1-5
[PubMed]  
[17] Hacek D.M., Suriano T., Noskin G.A., Kruszynski J., Reisberg B., Peterson L.R.: Medical and economic benefit of a comprehensive infection control program that includes routine determination of microbial clonality. Am. J Clin. Pathol., 1990; 111: 647-654
[PubMed]  
[18] Hryniewicz W.: Epidemiology of MRSA. Infection, 1999; 27: S13-S16
[PubMed]  
[19] Ieven M., Verhoeven J., Pattyn S.R., Goossens H.: Rapid and economical method for species identification of clinically significant coagulase-negative staphylococci. J. Clin. Microbiol., 1995; 33: 1060-1063
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[20] Jeljaszewicz J., Cybulska J., Dziarski R., Hryniewicz W., Ludwicka A., Świtalski L.M.: Ziarenkowce gram-dodatnie: biologia, rozpoznanie i różnicowanie. Państwowy Zakład Higieny, Warszawa 1978
[21] Kerr S., Kerr G.E., Mackintosh C.A., Marples R.R.: A survey of methicillin-resistant Staphylococcus aureus affecting patients in England and Wales. J. Hosp. Infect., 1990; 16: 35-48
[PubMed]  
[22] Khalifa K.I., Heiba A.A., Hancock G.: Nontypeable bacteriophage patterns of mathicillin-resistant Staphylococcus aureus involved in a hospitals outbreak. J. Clin. Microbiol., 1989; 27: 2249-2251
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[23] Kloos W.E., Schleifer K.H., Gotz F.: The genus Staphylococci. W: The Prokaryotes, red. A. Balows, H. G. Truper, M. Dworkin, W. Harder, K. H. Schleifer. Springer-Verlag, New York 1991, 1369-1420
[24] Krawczyk B., Samet A., Leibner J., Śledzinska A., Kur J.: Evaluation of a PCR melting profile technique for bacterial strain differentiation. J. Clin. Microbiol., 2006; 44: 2327-2332
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[25] Łopaciuk U., Dzierżanowska D.: Gronkowce metycylinooporne: mechanizmy oporności, czynniki zjadliwości oraz metody genotypowania. Post. Mikrobiol., 2002: 41: 401-418
[Full Text PDF]  
[26] Małachowa N., Sabat A., Gniadkowski M., Krzysztoń-Russjan J., Empel J., Międzobrodzki J., Kosowska-Shick K., Appelbaum P.C., Hryniewicz W.: Comparison of multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis with pulsed-field gel electrophoresis, spa typing and multilocus sequence typing for clonal characterization of Staphylococcus aureus isolates. J. Clin. Microbiol., 2005; 43: 3095-3100
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[27] Młynarczyk A., Młynarczyk G., Szymanowska A., Stańczak J., Łuczak M., Jeljaszewicz J.: Zastosowanie PCR do oceny występowania genów coa i nuc u metycylinoopornych, koagulazoujemnych szczepów Staphylococcus aureus (MRSA-CN). Med. Dośw. Mikrobiol., 2000; 52: 217-222
[PubMed]  
[28] Mulligan M.E., Kwok R.Y., Citron D.M., John J.F., Smith P.B.: Immunoblots, antimicrobial resistance and bacteriophage typing of oxacillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol., 1988: 26: 2395-2401
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[29] Musser J.M., Kapur V.: Clonal analysis of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains from inercontinental sources: association of the mec gene with divergent phylogenetic lineages implies dissemination by horizontal transfer and recombination. J. Clin. Microbiol., 1992; 30: 2058-2063
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[30] Opal S.M., Mayer K.H., Stenberg M.J., Blazek J.E., Mikolich D.J., Dickensheets D.L., Lyhte L.W., Trudel R.R., Musser J.M.: Frequent acquisition of multiple strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by healthcare workers in an endemic hospitals environment. Infect. Control. Hosp. Epidemiol., 1990; 11: 479-485
[PubMed]  
[31] Parker M.T.: Phage-typing of Staphylococcus aureus. W: Methods in Microbiology, red. J.R. Norris, D.W. Ribbons. Academic Press, London 1972, 1-28
[32] Perl T.M., Rhomberg P.R., Bale M.J., Fuchs P.C., Jones R.N., Koontz F.P., Pfaller M.A.: Comparison of identification systems for Staphylococcus epidermidis and other coagulase-negative Staphylococcus species. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 1994; 18: 151-155
[PubMed]  
[33] Piechowicz L., Galiński J., Dajnowska-Stanczewa A., Garbacz K.: Fagotypy Staphylococcus aureus izolowane w Polsce w latach 1999-2004. Med. Dośw. Mikrobiol., 2005; 57: 105-113
[PubMed]  
[34] Przondo-Mordarska A.: Podstawowe procedury laboratoryjne w bakteriologii klinicznej. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2005
[35] Renneberg J., Rieneck K., Gutschik E.: Evaluation of Staph ID 32osystem and Staph-Zym system for identification of coagulase-negative staphylococci. J. Clin. Microbiol., 1995; 33: 1150-1153
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[36] Richardson J.F., Reith S.: Characerization of a strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (EMRSA-15) by conventional and molecular methods. J. Hosp. Infect., 1993; 25: 45-52
[PubMed]  
[37] Rubin R. J., Harrington C. A., Poon A., Dietrich K., Greene J. A., Moiduddin A.: The economic impact of Staphylococcus aureus infection in New York City Hospitals. Emerg. Infect. Dis., 1999; 5: 9-17
[PubMed]  
[38] Sabat A., Melles D.C., Mertirosian G., Grundmann H., van Belkum A., Hryniewicz W.: Distribution of the serine-aspartate repeat protein-encoding sdr genes among nasal-carriage and invasive Staphylococcus aureus strains. J.Clin. Microbiol., 2006; 44: 1135-1138
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[39] Schlichting C., Branger C., Fournier J.M., Witte W., Boutonnier A., Wolz C., Goullet P., Doring G.: Typing of Staphylococcus aureus by pulsed field gel electrophoresis, zymotyping, capsular typing and phage typing: resolution of clonal relationships. J. Clin. Microbiol., 1993; 31: 227-232
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[40] Schwarzkopf A., Schmidt-Rotte H., Schmidt H., Kunz E., Karch H., Heesemann J.: Molecular analysis of nosocomial infection by oxacillin-resistant Staphylococcus aureus lacking protein A and clumping factor. Lancet, 1992; 340: 621
[PubMed]  
[41] Szewczyk E.M.: Diagnostyka bakteriologiczna. PWN, Warszawa 2005
[42] Tenover F.C., Arbeit R., Archer G., Biddle J., Byrne S., Goering R., Hancock G., Hebert G.A., Hill B., Hollis R.: Comparison of traditional and molecular methods of typing isolates of Staphylococcus aureus. J. Clin. Mirobiol., 1994; 32: 407-415
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[43] Thomson-Carter F.M., Pennington T.H.: Characterisation of methicillin-resistant isolates of Staphylococcus aureus by analysis of whole-cell and exported proteins. J. Med. Microbiol., 1989; 28: 25-32
[PubMed]  
[44] Vandenesch F., Bes M., Lebeau C., Greenland T., Brun Y. Etienne J.: Coagulase-negative Staphylococcus aureus. Lancet, 1993; 342: 995-996
[PubMed]  
[45] Watts A., Ke D., Wang Q., Pillay A., Nicholson-Weller A., Lee J.C.: Staphylococcus aureus strains that express serotype 5 or serotype 8 capsular polysaccharides differ in virulence. Infect. Immun., 2005; 73: 3502-3511
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[46] Weller T.M.: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus typing methods: which should be the international standard? J. Hosp. Infect., 2000; 44: 160-172
[PubMed]