Postepy Hig Med Dosw. (online), 2007; 61: 718-724
Review


Glikoforyny ludzkich erytrocytów jako receptory dla zarodźca sierpowego malarii (Plasmodium falciparum)
Glycophorins of human erythrocytes as receptors for the malaria parasite Plasmodium falciparum
Ewa Jaśkiewicz
Laboratorium Immunochemii Glikokoniugatów, Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu
Adres do korespondencji
dr hab. Ewa Jaśkiewicz, Laboratorium Immunochemii Glikokoniugatów, Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, ul. R. Weigla 12, 53-114 Wrocław; e-mail: jaskiew@iitd.pan.wroc.pl

Otrzymano:  2007.09.17
Zaakceptowano:  2007.11.21
Opublikowano:  2007.12.03

Streszczenie
Inwazja ludzkich erytrocytów przez zarodźca sierpowego (Plasmodium falciparum) jest przyczyną malarii, na którą zapada corocznie 300–500 milionów ludzi, głównie mieszkańców subsaharyjskich regionów Afryki oraz Indochin. Spośród czterech gatunków zarodźca, właśnie Plasmodium falciparum jest odpowiedzialne za najpoważniejszą postać choroby związaną ze zgonem ponad 2 milionów osób w ciągu roku, głównie dzieci w wieku do lat pięciu. Ze względu na skalę problemu, poznanie molekularnych podstaw procesu inwazji pasożytów ma priorytetowe znaczenie dla opracowania skutecznych metod leczenia oraz prewencji malarii. Proces inwazji erytrocytów ludzkich przez zarodźca malarii jest wynikiem kaskady interakcji pomiędzy pasożytem a krwinką czerwoną. Poznano wiele ligandów ekspresjonowanych przez komórki zarodźca, biorących udział w tym procesie, w tym białka należące do rodziny DBL. Stwierdzono, że receptorami dla przynajmniej dwóch ligandów Plasmodium falciparum z rodziny DBL: antygenu EBA-175 oraz EBA-140 (BAEBL), są sjaloglikoproteiny erytrocytów ludzkich – glikoforyny A, B i C. Wykazano, że antygen EBA-175 wiąże się do glikoforyny A, a w wiązaniu biorą udział reszty kwasu sjalowego O-glikozydowych łańcuchów cukrowych znajdujących się w klasterach, których konformacja zależy od struktury łańcucha polipeptydowego GPA. Funkcję glikoforyny A może przejąć druga pod względem ilościowym glikoforyna B. Podobnie, jak w przypadku glikoforyny A, wiązanie Plasmodium falciparum jest zależne od reszt kwasu sjalowego, lecz bierze w nim udział inny, niepoznany jeszcze, ligand merozoitów. Występująca na erytrocytach, w najmniejszej ilości, glikoforyna C, jest receptorem dla homologicznego do EBA-175 liganda BAEBL. Stwierdzono, że w wiązaniu antygenu BAEBL do glikoforyny C biorą udział reszty kwasu sjalowego O- i N- glikozydowych łańcuchów cukrowych, a także reszty aminokwasowe łańcucha polipeptydowego glikoforyny. Struktura miejsca receptorowego na glikoforynie C wymaga jednakże dalszego wyjaśnienia.
Słowa kluczowe: glikoforyny ludzkich erytrocytów • zarodziec sierpowy malarii (Plasmodium falciparum) • oddziaływanie ligand-receptor


Summary
Malaria causes an estimated 300–500 million clinical cases in sub-Saharan Africa and Indochina. The most severe form of malaria is caused by Plasmodium falciparum, a parasite responsible for the death of 2 million children annually. Understanding the molecular basis of the parasite’s invasion process is important for the development of new drugs and vaccines. Invasion of erythrocytes by the malaria parasite is a multistep process involving several specific interactions between the parasite’s ligands and receptors on red blood cells. It was shown that glycophorins A, B, and C, sialoglycoproteins of human erythrocytes, act as receptors for Plasmodium falciparum ligands of the DBL family: EBA-175 and EBA-140 antigens. The binding specificity of EBA-175 is determined by the presence of sialic acid residues of the O-linked oligosaccharide chain clusters of glycphorin A and the amino-acid sequence, which contribute to their proper conformation. Glycophorin B, the next in terms of amount, can take on the role of glycophorin A as the receptor, but the glycophorin B- and sialic acid-dependent invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum involves a different parasite ligand. The third, and minor, glycophorin C appears to be the receptor for the antigen BAEBL, a paralogue of EBA-175. The binding of BAEBL to glycophorin C is dependent on the sialic acid residues of the O- and N-linked oligosaccharide chains and a peptide as well. It seems that the correct receptor site on glycophorin C needs to be elucidated in detail.
Key words: human erythrocyte glycophorins • Plasmodium falciparum malaria parasite • ligand-receptor interactions




WPROWADZENIE
Zakażenie ludzkich erytrocytów zarodźcem sierpowym (Plasmodium falciparum) jest przyczyną malarii, na którą zapada corocznie 300–500 milionów ludzi, głównie mieszkańców subsaharyjskich regionów Afryki oraz Indochin, i która powoduje zgon w ciągu roku ponad 2 milionów osób, przede wszystkim dzieci w wieku do lat pięciu. Spośród czterech gatunków zarodźca, właśnie Plasmodium falciparum jest odpowiedzialne za najpoważniejszą postać choroby charakteryzującą się kwasicą metaboliczną, zaburzeniami oddechowymi, oraz objawami mózgowymi, w tym śpiączką i drgawkami, co nierzadko prowadzi do śmierci [23,28]. Ze względu na skalę problemu, poznanie molekularnych podstaw procesu inwazji pasożytów ma priorytetowe znaczenie dla opracowania efektywnych metod leczenia oraz prewencji malarii, w tym przygotowania skutecznych szczepionek, które mają na celu wywołanie odpowiedzi immunologicznej ustroju, zapewniającej blokadę inwazji oraz likwidację pasożytów we krwi. Na razie jednak, mimo wysiłków, wysoce skuteczna szczepionka przeciw malarii jest niestety wciąż kwestią przyszłości.
Źródłem zakażenia ludzi malarią są zarażone samice komara widliszka (Anopheles spp.) które w czasie ssania krwi wprowadzają ze swoich gruczołów ślinowych zarodźce w postaci sporozoitów [6,11]. Podczas 1–3 tygodni rozwoju w komórkach wątroby, sporozoity przekształcają się w postać schizonta, który dojrzewając dzieli się dając początek merozoitom. W wyniku rozpadu dojrzałych schizontów następuje uwolnienie do krwiobiegu ogromnej liczby merozoitów, które następnie wnikają do erytrocytów, będących miejscem ich dalszego rozwoju. Objawy kliniczne malarii (gorączka, dreszcze) są bezpośrednio związane z jednoczesnym rozpadem zakażonych erytrocytów i kolejnym uwalnianiem merozoitów, występującym w odstępach jedno- lub dwudniowych. Po przejściu kilku opisanych wyżej podziałów część merozoitów daje początek formom płciowym – gametocytom, które muszą ponownie przedostać się do przewodu pokarmowego komara widliszka, aby ukończyć swój cykl życiowy.
Złożony i wciąż mało poznany proces inwazji erytrocytów ludzkich przez zarodźca malarii jest wynikiem kaskady swoistych interakcji pomiędzy pasożytem a krwinką czerwoną. Można wyróżnić cztery główne etapy tego procesu: swoiste przyłączenie merozoitu do erytrocytu określonego gatunku, reorientacja jednokomórkowego zarodźca, polegająca na ustawieniu się końcem odpowiedzialnym za wnikanie, utworzenie ścisłego i nieodwracalnego wiązania pomiędzy merozoitem a erytrocytem, i ostatecznie wniknięcie zarodźca do krwinki z wytworzeniem wakuoli, która jest miejscem jego dalszego rozwoju [6,11].
Zidentyfikowano wiele ligandów ekspresjonowanych przez komórki zarodźca, które biorą udział w poszczególnych etapach. Należy tutaj wymienić między innymi: białka powierzchniowe merozoitów (membrane surface proteins: MSP – 1, 2, 4, 5, 8 i 10) związane z błoną komórkową poprzez kotwicę glikozylo-fosfatydyloinozytolową (GPI), które odpowiadają za wstępne rozpoznanie i odwracalne wiązanie merozoitów do swoistych gatunkowo erytrocytów, AMA-1 (apical membrane antigen), biorący udział w reorientacji części apikalnej komórki zarodźca w kierunku erytrocytu, oraz białka zaangażowane w tworzenie ścisłego kontaktu między dwoma komórkami [6,11]. Ostatnie z wymienionych ligandów można zaliczyć do dwóch rodzin: RBL (reticulocyte-binding-like) oraz EBL (erythrocyte- binding-like) lub inaczej DBL (Duffy-binding-like), ze względu na podobieństwo do poznanego najwcześniej liganda zarodźca ruchliwego (Plasmodium vivax), wiążącego się do antygenu Duffy na erytrocytach ludzkich [2,6,11].
W genomie Plasmodium falciparum, który nie wiąże się do antygenu Duffy, zidentyfikowano sześć sekwencji homologicznych genu ebl, kodujących białka będące paralogami liganda wiążącego antygen Duffy (DBL), o nazwach: EBA-175, EBA-140 (BAEBL), EBA-181 (JESEBL), EBA-165 (PEBL), MAEBL oraz EBL-1 [1]. Geny ebl ewoluowały prawdopodobnie od jednego przodka i zachowały podobną strukturę eksonów i intronów, a wszystkie białka rodziny DBL mają homologiczną strukturę domenową. Trzy pierwsze z wymienionych ligandów zostały scharakteryzowane pod względem funkcjonalnym w oparciu o ich zdolność do wiązania się do erytrocytów ludzkich.
GLIKOFORYNA A JAKO RECEPTOR DLA LIGANDA EBA-175 PLASMODIUM FALCIPARUM
Najwcześniej i najlepiej poznanym ligandem z rodziny DBL Plasmodium falciparum jest białko EBA-175 [2,5,33]. Gen kodujący EBA-175 składa się z czterech eksonów, z których pierwszy koduje N-końcowy fragment zewnątrzbłonowy, drugi domenę transbłonową, a trzeci i czwarty kodują fragment cytoplazmatyczny łańcucha polipeptydowego EBA-175, składającego się z 1435 reszt aminokwasowych (r.a.) [31]. W obrębie N-końcowego fragmentu białka można wyróżnić dwa regiony (RII oraz RVI) zawierające dużą liczbę konserwatywnych reszt cysteiny. Charakterystyczną cechą liganda EBA-175 Plasmodium falciparum, w odróżnieniu od Plasmodium vivax, jest obecność dwóch homologicznych domen F1 (r.a. 8-282) i F2 (r.a. 297-603) składających się na Region II. Stosując rekombinacyjne formy EBA-175, zawierające poszczególne regiony (I-VI) łańcucha polipeptydowego liganda, ekspresjonowane na komórkach COS7, Sim i wsp. [32] ustalili, że za wiązanie do erytrocytów jest odpowiedzialny Region II składający się z 616 r.a. Ponadto stwierdzono, że spośród dwóch homologicznych domen F1 i F2, jedynie domena F2 ma zdolność wiązania erytrocytów analogiczną do Regionu II, oraz pełnego liganda EBA-175. W cytowanej pracy autorzy nie tylko zidentyfikowali miejsce wiążące na ligandzie EBA-175 Plasmodium falciparum, ale również scharakteryzowali miejsce receptorowe na glikoforynie A ludzkich erytrocytów, która jak wykazali, jest wyłącznym receptorem dla liganda EBA-175.
Przesłanki sugerujące, że sjaloglikoproteiny (glikoforyny) erytrocytów (ryc. 1) mogą być receptorami dla Plasmodium falciparum były znane już wcześniej [5,26]. Świadczył o tym brak wiązania EBA-175 do erytrocytów traktowanych neuraminidazą, usuwającą a(2,3) kwas sjalowy z oligosacharydowych łańcuchów cukrowych glikoforyn, oraz do wariantowych erytrocytów MkMk niemających dwóch glikoforyn A i B (GPA i GPB), które są dwiema głównymi sjaloglikoproteinami ludzkich erytrocytów. Łańcuchy polipeptydowe GPA i GPB, zawierają odpowiednio 131 oraz 97 reszt aminokwasowych (ryc. 1) i są kodowane przez dwa odrębne geny [29], składające się odpowiednio z sześciu oraz czterech eksonów [30]. Trzy spośród czterech eksonów kodujących GPB są identyczne do eksonów kodujących GPA, co sprawia, że obie glikoforyny mają dużą homologię sekwencji aminokwasowej oraz analogiczną strukturę domenową. N-końcowy fragment domeny zewnątrzbłonowej, obejmujący r.a. 1-26 jest identyczny w obu glikoforynach. Polimorfizm reszt aminokwasowych GPA w pozycji 1 (Ser/Leu) i 5 (Gly/Glu) oraz GPB w pozycji 29 (Met/Thr) jest podstawą rozróżnienia antygenów grupowych krwi M i N oraz S i s [17]. Z resztami seryny i treoniny GPA i GPB jest związanych odpowiednio 16 i 11 łańcuchów cukrowych (ryc. 1) [4,36]. Wszystkie łańcuchy GPB są O-glikozydowymi sjalotetrasacharydami o strukturze NeuAca(2,3)Galb1,3 [NeuAca(2,6)]GalNAc [17]. GPA zawiera, oprócz 15 łańcuchów O-glikozydowych, również jeden łańcuch N-glikozydowy typu złożonego, związany z resztą Asn26 [17].
Ryc. 1. Struktura glikoforyn A, B i C wraz z miejscami glikozylacji, zaznaczono miejsca trawienia trypsyną (TR) i chymotrypsyną (CH) [17]

Jednoznaczna identyfikacja GPA jako receptora dla liganda EBA-175 Plasmodium falciparum została przeprowadzona przez wspomnianych wcześniej autorów [32] na podstawie wiązania rekombinacyjnego Regionu II EBA-175, ekspresjonowanego na komórkach COS7, do wariantowych erytrocytów (S-s-U-u-) niezawierających GPB, oraz braku wiązania tego regionu do wariantowych erytrocytów En(a-), niemających GPA. Do dalszej szczegółowej charakterystyki miejsca receptorowego na GPA wykorzystano trypsynowe (MT1 1-31, 1-39) i chymotrypsynowe (MCH1 1-64, MCH2 1-34, MCH3 35-64) fragmenty zewnątrzbłonowego regionu GPA. Stwierdzono, że wiązanie rekombinacyjnego EBA-175 do erytrocytów było hamowane jedynie przez peptyd chymotrypsynowy MCH1 obejmujący r.a. 1-64 i zawierający 15 O-glikozydowych sjalotetrasacharydów. Mieszanina peptydów trypsynowych MT1, zawierających 11 z 15 łańcuchów cukrowych, oraz chymotrypsynowych MCH2 i MCH3, zawierających wszystkie łańcuchy cukrowe nie wykazywała aktywności hamującej, co świadczyło o tym, że nie tylko reszty kwasu sjalowego łańcuchów cukrowych GPA biorą udział w wiązaniu EBA-175, lecz istotna jest również nienaruszona struktura łańcucha polipeptydowego. Na znaczenie r.a. 1-64 GPA w wiązaniu liganda EBA-175 wskazywało również to, że GPB zawierająca 11 identycznych z GPA łańcuchów oligosacharydowych oraz 26 identycznych, początkowych reszt aminokwasowych nie hamowała wiązania EBA-175 do erytrocytów. Stosując N-glikanazę wykluczono ponadto udział N-glikozydowego łańcucha cukrowego GPA w wiązaniu EBA-175. Podsumowując, Sim i wsp. w 1994 r. jako pierwsi zdefiniowali GPA, jako receptor dla liganda EBA-175 Plasmodium falciparum, ustalając, że w wiązaniu biorą udział reszty a(2,3) kwasu sjalowego O-glikozydowych łańcuchów cukrowych, znajdujących się w klasterach, których konformacja zależy od struktury łańcucha polipeptydowego GPA. Dalsze badania wspomnianej grupy, z zastosowaniem testu ELISA oraz cytofluorymetrii przepływowej (FACS), wykazały jednak, że antygen EBA-175 może wiązać również odsjalowaną GPA z udzialem innego fragmentu łańcucha polipeptydowego należącego do Regionów III i IV, obejmującego 21 r.a. (1076-1096) [13]. Szczególnie peptyd obejmujący 12 r.a. (1085-96) wykazywał najsilniejsze wiązanie do GPA oraz najwyższą zdolność blokowania inwazji erytrocytów. Zdolność antygenu EBA-175 do wiązania odsjalowanej GPA została potwierdzona również w późniejszych badaniach grupy pod kierunkiem Cowmana [10].
Najnowszym osiągnięciem grupy badawczej, również z udziałem Sim, było uzyskanie w 2005 r. struktury krystalicznej Regionu II liganda EBA-175 z dokładnością do 2,3 Ĺ, która pozwoliła na wyjaśnienie molekularnych podstaw interakcji miejsca wiążącego antygenu EBA-175 z O-glikozydowymi łańcuchami cukrowymi GPA [35]. Ustalono, że Region II może krystalizować w postaci monomeru lub homodimeru utworzonego przez dwie cząsteczki ułożone względem siebie przeciwrównolegle, które tworzą strukturę „uściśniętych dłoni”. Domeny F1 każdego z monomerów oddziałują z domenami F2 drugiego monomeru Regionu II. W cząsteczce homodimeru tworzą się dwa kanały, które przebijają białko na wylot. Powierzchnia każdego z kanałów jest w większości utworzona przez reszty aminokwasowe domeny F2, co potwierdza jej decydujący udział w miejscu wiążącym antygenu EBA-175. Otrzymano również strukturę krystaliczną homodimeru Regionu II w obecności receptora, którego rolę pełniły cząsteczki sjaloa(2,3)laktozy. Ustalono, że na cząsteczkę dimeru przypada sześć miejsc wiążących sacharydy, przy czym cztery z nich są umiejscowione wewnątrz dwóch kanałów. Dwa pozostałe znajdują się we wgłębieniu na powierzchni cząsteczki homodimeru. W wiązaniu każdego glikanu biorą udział oba monomery Regionu II, co oznacza, że dimeryzacja jest warunkiem koniecznym do związania receptora. Modelowanie komputerowe miejsc wiążących homodimeru Regionu II potwierdziło, że O-glikozydowe sjalotetrasacharydy GPA mogą być wiązane, podobnie jak sjaloa(2,3)laktoza. Na postawie analizy mutacyjnej ustalono, że wszystkie sześć potencjalnych miejsc wiążących uczestniczy w wiązaniu łańcuchów cukrowych GPA. Stwierdzenie, że Region II liganda EBA-175 krystalizuje z sześcioma cząsteczkami sjalolaktozy w postaci homodimeru, pozwoliło to na zaproponowanie przypuszczalnego modelu wiązania GPA przez antygen EBA-175 Plasmodium falciparum. Według tego scenariusza wiązanie Regionu II do GPA, na powierzchni erytrocytów, indukuje dimeryzację EBA-175 wokół dimeru GPA. Dimeryzacja antygenu EBA-175 jest zatem następstwem związania receptora, przy czym łańcuchy polipeptydowe dimeru GPA mogą być zamykane wewnątrz kanałów homodimeru Regionu II lub tylko „dostarczać” O-glikozydowych łańcuchów cukrowych owijając się wokół miejsc wiążących. Omówione powyżej wyniki badań, są jedynymi, które w sposób molekularny przedstawiają proces wzajemnej interakcji liganda i receptora leżący u podstaw inwazji erytrocytów przez zarodźca sierpowego z udziałem EBA-175 i GPA. Są one niezwykle istotne nie tylko w kontekście poznawczym, ale i praktycznym, zmierzającym do otrzymania skutecznych leków – inhibitorów działających na zasadzie blokowania procesu wiązania merozoitów do krwinek czerwonych.
GPA stanowi główną, lecz nie jedyną drogę inwazji erytrocytów z udziałem glikoforyn. Jej funkcję może przejąć druga, pod względem ilościowym, sjaloglikoproteina erytrocytów – GPB, mająca homologię sekwencji aminokwasowej oraz identyczną strukturę łańcuchów O-glikozydowych jak GPA [9,12,27]. Podobnie jak w przypadku GPA, wiązanie Plasmodium falciparum przez GPB jest zależne od reszt kwasu sjalowego, lecz nie bierze w nim udziału antygen EBA-175, lecz inny, niepoznany jeszcze, ligand merozoitów [9,32]. Przypuszcza się, że każdy z sześciu wspomnianych wcześniej ligandów rodziny DBL ma własną swoistość i wiąże się z różnymi receptorami na erytrocytach.
GLIKOFORYNA C JAKO RECEPTOR DLA LIGANDA EBA-140 PLASMODIUM FALCIPARUM
W błonie ludzkich erytrocytów występuje, w niewielkiej ilości trzecia glikoforyna, która nie ma homologii sekwencji aminokwasowej z GPA i GPB – glikoforyna C (GPC) [14]. Łańcuch polipeptydowy GPC jest kodowany przez gen składający się z 4 eksonów i zawiera 128 reszt aminokwasowych (ryc. 1). Z resztami seryny i treoniny zewnątrzbłonowego fragmentu łańcucha polipeptydowego związanych jest 12 O-glikanów, natomiast z resztą Asn8 jeden N-glikozydowy łańcuch cukrowy. Znane są rzadko występujące, naturalne warianty genetyczne GPC, zawierające delecję eksonów 2 lub 3, kodujących odpowiednio reszty aminokwasowe 17-35 lub 36-63. Erytrocyty zawierające wymienione warianty GPC mają fenotyp Yus (Deks.2) lub Gerbich (Deks.3). Znane są również krwinki o fenotypie Leach, niezawierające GPC, o zmienionym kształcie i obniżonej wytrzymałości, co wskazuje na udział GPC w utrzymywaniu kształtu i mechanicznej trwałości erytrocytów, w wyniku interakcji z białkami cytoszkieletu. W ciągu ostatnich kilku lat ukazało się wiele prac wskazujących na rolę GPC – jako receptora dla kolejnego liganda Plasmodium falciparum z rodziny DBL – białka EBA- 140 (BAEBL), homologicznego do EBA-175.
Antygen BAEBL zidentyfikowano i sklonowano z genomowego DNA Plasmodium falciparum, w oparciu o homologię sekwencji nukleotydowej z EBA-175 [21,24,34]. Z cytowanych doniesień wynika, że jako źródło DNA oraz liganda wydzielanego do nadsącza hodowlanego przez merozoity posłużyły dwa różne klony pasożytów: 3D7 i Dd2/Nm. Wiązanie BAEBL do erytrocytów było zależne od kwasu sjalowego, co mogło sugerować udział sjaloglikoprotein. Ponieważ stwierdzono jednak brak wpływu lub jedynie częściowy spadek wiązania BAEBL do erytrocytów traktowanych proteazami, w tym trypsyną, na której działanie podatne są GPA i GPC, dwie grupy badawcze wykluczyły tę możliwość [24,34]. Trzecia grupa wykazała, że receptor jest wrażliwy na trypsynę i zdefiniowała go, jako GPC, w oparciu o wiązanie BAEBL do erytrocytów pozbawionych GPA i GPB oraz spadek wiązania do erytrocytów o fenotypie Gerbich (Degz.3) i Yus (Degz.2) [21]. Było to pierwsze doniesienie wskazujące na GPC, jako przypuszczalny receptor dla antygenu BAEBL Plasmodium falciparum. Zaobserwowane rozbieżności, dotyczące swoistości liganda BAEBL, znalazły późniejsze wyjaśnienie w polimorfizmie reszt aminokwasowych Regionu II, odpowiedzialnego za wiązanie erytrocytów, który stwierdzono w różnych klonach Plasmodium falciparum, pochodzących z odmiennych części świata [22]. Znaleziono pięć polimorficznych typów łańcucha polipeptydowego BAEBL (różniących się czterema resztami aminokwasowymi w pozycjach 185, 239, 261, 285): VSTK (klon Dd2/Nm), VSKK (klon PNG13), ISKK (klon E12), INRE (klon PNG3), INKK (klon 3D7), które wiązały się do odmiennych receptorów na erytrocytach. Według autorów, spośród wymienionych wariantów, jedynie wariant zawierający reszty aminokwasowe VSTK, pochodzący z klonu Dd2/Nm, wykazywał swoistość wobec GPC, co ustalono na podstawie braku wiązania tego liganda do erytrocytów trawionych neuraminidazą i trypsyną oraz erytrocytów o fenotypie Gerbich (Degz.3).
Dalsza szczegółowa charakterystyka GPC jako receptora, dotycząca miejsca wiązania antygenu BAEBL, została przeprowadzona przez trzy niezależne ośrodki badawcze i zaowocowała sprzecznymi wynikami [18,19,20].
W pracy opublikowanej w Nature Medicine przez grupę badaczy pod kierunkiem Cowmana, otrzymano warianty klonów 3D7 oraz W2mef Plasmodium falciparum, pozbawione genu dla liganda BAEBL [19]. Metodą Western-blottingu z użyciem mieszaniny glikoforyn A, B i C autorzy wykazali wiązanie BAEBL do GPC, w przypadku antygenu pochodzącego z obu natywnych klonów i brak wiązania białek pochodzących z nadsącza hodowlanego klonów Plasmodium falciparum pozbawionych genu dla BAEBL. Brak wiązania uzyskano również, używając wariantowej GPC typu Gerbich, mającej delecję r.a. 36-63, co wskazywało na miejsce wiązania BAEBL w tym regionie. Może to mieć ogromne znaczenie epidemiologiczne na obszarach endemicznych malarii, takich jak Papua Nowa Gwinea (Melanezja), gdzie około 46,5% populacji posiada erytrocyty o fenotypie Gerbich [19,37]. Wykazano, że istotnie erytrocyty typu Gerbich wykazują obniżoną podatność (około 60%) na inwazję przez oba klony Plasmodium falciparum (3D7 i W2mef) w porównaniu z krwinkami prawidłowymi, co świadczy, że BAEBL nie jest wyłącznym ligandem umożliwiającym inwazję pasożytom, lecz jednym z kilku antygenów zaangażowanych w ten proces. Wyniki przedstawione w omówionej pracy stanowiły potwierdzenie roli GPC jako receptora, były jednak sprzeczne ze stwierdzonym przez inną grupę brakiem wiązania do GPC liganda BAEBL pochodzącego z klonu 3D7 (r. a. INKK) [22].
Próba zdefiniowania miejsca wiążącego na GPC została podjęta również przez Lobo i wsp. [18] z użyciem liganda BAEBL, pochodzącego z klonu 3D7 oraz wariantowych krwinek o fenotypie Yus i Gerbich oraz Leach niemających GPC. Stwierdzono, że antygen BAEBL nie wiąże się do erytrocytów typu Leach, potwierdzając udział GPC w wiązaniu, wykazuje obniżone wiązanie do erytrocytów Yus, natomiast wiąże się, nawet silniej do erytrocytów typu Gerbich. Otrzymane wyniki wskazywały zatem na udział w wiązaniu BAEBL r.a. 17-35 nieobecnych w GPC typu Yus, a nie r.a. 36-63 (GPC typu Gerbich), jak w omawianej wcześniej pracy [18]. Udział fragmentu łańcucha polipeptydowego zawierającego r.a. 13-22 został dodatkowo potwierdzony poprzez hamowanie wiązania BAEBL monoklonalnymi przeciwciałami rozpoznającymi epitopy w tym regionie (r.a. 13-20 oraz 16-22).
Ostatnie z trzech doniesień zostało opublikowane przez grupę pod kierunkiem Millera, w lutym 2006 r., definiując N-glikozydowy łańcuch cukrowy GPC, jako główny składnik miejsca wiążącego dla antygenu BAEBL [20]. Autorzy podtrzymali wcześniejsze wyniki wykazujące rozpoznawanie GPC na erytrocytach jedynie przez wariant BAEBL zawierający r.a. VSTK (klon Dd2/Nm), a nie przez inne warianty użyte w badaniach, w tym wariant pochodzący z kontrowersyjnego klonu 3D7. Autorzy ci podają, że wiązanie antygenu BAEBL było specyficznie hamowane przez oczyszczoną GPC, w stężeniu podobnym, jak GPA użyta do hamowania wiązania antygenu EBA-175. Wątpliwości budzi jednak czystość preparatu GPC użytej do hamowania wiązania. Oczyszczenie GPC z posiadanego przez autorów preparatu zawierającego mieszaninę glikoforyn A, B i C jest rzeczą trudną, ze względu na wzajemną agregację glikoprotein błonowych, a w pracy nie podano kryteriów czystości GPC. Nie poddając pod wątpliwość udziału GPC w wiązaniu liganda BAEBL, sądzimy jednak, że autorzy mogli posiadać preparat zawierający również GPA, która znajduje się w największej ilości w błonach erytrocytów, co podważa wiarygodność uzyskanych wyników. Enzymatyczne usunięcie łańcucha Nglikozydowego z preparatu GPC całkowicie zniosło efekt hamowania wiązania BAEBL do erytrocytów przez GPC, wskazując na udział tego glikanu w interakcji z ligandem. Uwolnione N-glikany nie wykazywały hamowania wiązania, co może – jak przyznają autorzy – świadczyć o tym, że łańcuch N-glikozydowy jest częścią glikopeptydowego receptora. Autorzy ci uważają, że brak wiązania antygenu BAEBL do wariantowych erytrocytów typu Gerbich, może być wynikiem odmiennej struktury łańcucha N-glikozydowego tego wariantu, a nie delecji części łańcucha polipeptydowego GPC. Poparto to wynikami analizy cukrowej, które wskazywały na większy udział N-glikanów typu mannozowego w GPC typu Gerbich, w porównaniu z łańcuchami typu złożonego w normalnej GPC. Uprzednio przypuszczano, że N-glikany wariantów GPC zawierają zwiększoną liczbę jednostek polilaktozoaminowych o różnej długości, co uwidacznia się w elektroforezie migracją tych glikoforyn w postaci rozmytych prążków [14,15]. Kluczowa rola N-glikanu GPC w wiązaniu liganda BAEBL Plasmodium falciparum do erytrocytów ludzkich wymaga zatem dalszego potwierdzenia, w czym pomocne byłoby ustalenie niezbadanej struktury N-glikanu normalnej GPC i jej wariantów.
PODSUMOWANIE
Badając wiązanie różnych klonów Plasmodium falciparum, w tym klonów laboratoryjnych, jak i dzikich pochodzących od osób z regionów dotkniętych malarią, do erytrocytów traktowanych enzymami (neuraminidazą i proteazami) stwierdzono, że glikoforyny A, B i C nie są wyłącznymi receptorami dla zarodźca sierpowego malarii. Świadczyło o tym również to, że naturalne mutacje prowadzące do pojawienia się w regionach endemicznych malarii erytrocytów, zawierających wariantowe glikoforyny, ograniczają inwazję tylko częściowo. Przykładem są powszechnie występujące wśród Afrykanów erytrocyty o fenotypie Ss- U-u- niezawierające GPB i erytrocyty Dantu mające hybrydową GPA oraz występujące u mieszkańców Melanezji erytrocyty o fenotypie Gerbich z delecją fragmentu (r.a. 36-63) GPC [11,37].
Oprócz omówionych dróg inwazji erytrocytów przez Plasmodium falciparum, z udziałem glikoforyn, zidentyfikowano przynajmniej trzy alternatywne drogi z udziałem poznanych i jeszcze niezidentyfikowanych par ligand–receptor [8,11]. Zaproponowano pięć następujących możliwości:
1. EBA-175 – GPA; EBA-140 – GPC (droga zależna od kwasu sjalowego i wrażliwa na trypsynę i chymotrypsynę).
2. LIGAND? – GPB (droga zależna od kwasu sjalowego, niewrażliwa na trypsynę, wrażliwa na chymotrypsynę).
3. Rh1 – RECEPTOR Y (droga zależna od kwasu sjalowego, niewrażliwa na trypsynę i chymotrypsynę).
4. LIGAND? – RECEPTOR X (droga niezależna od kwasu sjalowego, wrażliwa na trypsynę).
5. Rh2b – RECEPTOR Z (droga niezależna od kwasu sjalowego, niewrażliwa na trypsynę).
Zauważono przy tym istotne różnice pomiędzy drogami inwazji klonów laboratoryjnych, jak również dzikich, w zależności od regionu, z którego pochodziły. Większość szczepów laboratoryjnych Plasmodium falciparum miało zdolność inwazji erytrocytów traktowanych trypsyną, wśród pozostałych preferowana była droga z udziałem receptora X wrażliwego na trypsynę i niezależnego od kwasu sjalowego [11]. Ustalenie dróg inwazji klonów pochodzących z czterech regionów endemicznych malarii: Indii [25], Brazylii [8], Gambii [3] oraz Kenii [8] pozwoliło na zidentyfikowanie dominującego profilu na danym terenie. I tak, klony pochodzące z Indii preferowały hipotetyczny receptor Z niewrażliwy na neuraminidazę i trypsynę, natomiast pochodzące z Gambii i Brazylii receptor wrażliwy na neuraminidazę oraz trypsynę, co wskazywało na udział glikoforyn. Większość klonów pochodzących z Kenii było zależnych od receptora X, niezależnego od kwasu sjalowego i wrażliwego na trypsynę.
Istnienie tak wielu alternatywnych dróg zakażenia jest dowodem na ogromną plastyczność i złożoność procesu inwazji erytrocytów ludzkich przez zarodźca sierpowego malarii, oraz niestety powodem trudności związanych z opracowaniem skutecznych metod prewencji oraz terapii malarii. Wykorzystanie wielu ligandów i receptorów umożliwiających zmianę drogi inwazji daje pasożytom wciąż przewagę. Uważa się nawet, że nie istnieją erytrocyty, które byłyby całkowicie oporne na zakażenie przez Plasmodium falciparum. Największe nadzieje niosą szczepionki zawierające jednocześnie kilka antygenów, co uzasadnia badania zmierzające nie tylko do ich identyfikacji, ale również próby określenia ich immunogenności.
Stosując rekombinacyjne formy antygenu EBA-175 otrzymane w komórkach owadzich, w tym antygen natywny oraz fragmenty łańcucha polipeptydowego obejmujące Region II i domenę F2 oraz syntetyczne peptydy pochodzące z Regionu III-IV (r.a. 1062-1103, 1069-1087, 1085- 1096, 1076-1096), stwierdzono, że mają one zdolność do indukcji przeciwciał u zwierząt doświadczalnych, a przeciwciała te efektywnie blokują inwazję erytrocytów przez Plasmodium falciparum [7,13,16,31,33]. Co jest istotne, rekombinacyne formy Regionu II i domeny F2 EBA-175 oraz peptyd obejmujący r.a. 1062-1103 liganda EBA-175, są rozpoznawane przez naturalne przeciwciała obecne u osób chorych na malarię [7,31]. Świadczy to o istotnym znaczeniu drogi inwazji erytrocytów ludzkich przez zarodźca sierpowego, przebiegającej z udziałem antygenu EBA- 175 i GPA, co stawia EBA-175, w rzędzie potencjalnych składników szczepionki przeciw malarii [16].
PIŚMIENNICTWO
[1] Adams J.H., Blair P.L., Kaneko O., Peterson D.S.: An expanding ebl family of Plasmodium falciparum. Trends Parasitol., 2001; 17: 297-299
[PubMed]  
[2] Adams J.H., Sim B.K., Dolan S.A,. Fang X., Kaslow D.C., Miller L.H.: A family of erythrocyte binding proteins of malaria parasites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992; 89: 7085-7089
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[3] Baum J., Pinder M., Conway D.J.: Erythrocyte invasion phenotypes of Plasmodium falciparum in The Gambia. Infect. Immun., 2003; 71: 1856-1863
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[4] Blanchard D., Dahr W,, Hummel M., Latron F., Beyreuther K., Cartron J.P.: Glycophorins B and C from human erythrocyte membranes. Purification and sequence analysis. J. Biol. Chem., 1987; 262: 5808-5811
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[5] Camus D., Hadley T.J.: A Plasmodium falciparum antigen that binds to host erythrocytes and merozoiotes. Science, 1985; 230: 553-556
[PubMed]  
[6] Cowman A.F., Crabb B.S.: Invasion of red blood cells by malaria parasites. Cell, 2006; 124: 755-766
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[7] Daugherty J.R., Murphy C.I., Doros-Richert L.A., Barbosa A., Kashala L.O., Ballou W.R., Snellings N.J., Ockenhouse C.F., Lanar D.E.: Baculovirus-mediated expression of Plasmodium falciparum erythrocyte binding antigen 175 polypeptides and their recognition by human antibodies. Infect. Immun., 1997; 65: 3631-3637
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[8] Deans A.M., Nery S., Conway D.J., Kai O., Marsh K., Rowe J.A.: Invasion pathways and malaria severity in Kenyan Plasmodium falciparum clinical isolates. Infect. Immun., 2007; 75: 3014-3020
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[9] Dolan S.A., Proctor J.L., Alling D.W., Okubo Y., Wellems T.E., Miller L.H.: Glycophorin B as an EBA-175 independent Plasmodium falciparum receptor of human erythrocytes. Mol. Biochem. Parasitol., 1994; 64: 55-63
[PubMed]  
[10] Duraisingh M.T., Maier A.G., Triglia T., Cowman A.F.: Erythrocyte-binding antigen 175 mediates invasion in Plasmodium falciparum utilizing sialic acid-dependent and -independent pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003; 100: 4796-4801
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[11] Gaur D., Mayer D.C.G., Miller L.H.: Parasite ligand-host receptor interactions during invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum. Int. J. Parasitol., 2004; 34: 1413-1429
[PubMed]  
[12] Gaur D., Storry J.R., Reid M.E., Barnwell J.W., Miller L.H.: Plasmodium falciparum is able to invade erythrocytes through a trypsin-resistant pathway independent of glycophorin B. Infect. Immun., 2003; 71: 6742-6746
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[13] Jakobsen P.H., Heegaard P.M., Koch C., Wasniowska K., Lemnge M.M., Jensen J.B., Sim B.K.: Identification of an erythrocyte binding peptide from the erythrocyte binding antigen, EBA-175, which blocks parasite multiplication and induces peptide-blocking antibodies. Infect. Immun., 1998; 66: 4203-4207
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[14] Jaśkiewicz E.: Molekularne i genetyczne podstawy układu grupowego Gerbich ludzkich erytrocytów. Post. Biochem., 1991; 37: 75-81
[PubMed]  
[15] Jaskiewicz E., Czerwinski M,. Colin Y., Lisowska E.: Recombinant forms of Gerbich blood group antigens: expression and purification. Transfus. Clin. Biol., 2002; 9: 121-129
[PubMed]  
[16] Liang H., Narum D.L, Fuhrmann S.R., Luu T., Sim B.K.: A recombinant baculovirus-expressed Plasmodium falciparum receptor-binding domain of erythrocyte binding protein EBA-175 biologically mimics native protein. Infect. Immun., 2000; 68: 3564-3568
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[17] Lisowska E.: Antigenic properties of human erythrocyte glycophorins. W: The molecular immunology of complex carbohydrates, red.: A. M. Wu, Plenum Press, New York and London 1998, 265-316
[18] Lobo C.A., Rodriguez M., Reid M., Lustigman S.: Glycophorin C is the receptor for the Plasmodium falciparum erythrocyte binding ligand PfEBP-2 (baebl). Blood, 2003; 101: 4628-4631
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[19] Maier A.G., Duraisingh M.T., Reeder J.C., Patel S.S., Kazura J.W., Zimmerman P.A., Cowman A.F.: Plasmodium falciparum erythrocyte invasion through glycophorin C and selection for Gerbich negativity in human populations. Nat. Med., 2003; 9: 87-92
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[20] Mayer D.C., Jiang L., Achur R.N., Kakizaki I, Gowda D.C,. Miller L.H.: The glycophorin C N-linked glycan is a critical component of the ligand for the Plasmodium falciparum erythrocyte receptor BAEBL. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006; 103: 2358-2362
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[21] Mayer D.C., Kaneko O,. Hudson-Taylor D.E., Reid M.E., Miller L.H.: Characterization of a Plasmodium falciparum erythrocyte-binding protein paralogous to EBA-175. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001; 98: 5222-5227
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[22] Mayer D.C., Mu J.B., Feng X., Su X.Z., Miller L.H.: Polymorphism in a Plasmodium falciparum erythrocyte-binding ligand changes its receptor specificity. J. Exp. Med., 2002; 196: 1523-1528
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[23] Miller L.H., Baruch D.I., Marsh K., Doumbo O.K.: The pathogenic basis of malaria. Nature, 2002; 415: 673-679
[PubMed]  
[24] Narum D.L, Fuhrmann S.R., Luu T., Sim B.K.: A novel Plasmodium falciparum erythrocyte binding protein-2 (EBP2/BAEBL) involved in erythrocyte receptor binding. Mol. Biochem. Parasitol., 2002; 119: 159-168
[PubMed]  
[25] Okoyeh J.N., Pillai C.R., Chitnis C.E.: Plasmodium falciparum field isolates commonly use erythrocyte invasion pathways that are independent of sialic acid residues of glycophorin A. Infect. Immun., 1999; 67: 5784-5791
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[26] Orlandi P.A., Klotz.FW., Haynes J.D.: A malaria invasion receptor, the 175-kilodalton erythrocyte binding antigen of Plasmodium falciparum recognizes the terminal Neu5Ac(alpha 2-3)Gal- sequences of glycophorin A. J. Cell Biol., 1992; 116: 901-909
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[27] Pasvol G.: How many pathways for invasion of the red blood cell by the malaria parasite? Trends Parasitol., 2003; 19: 430-432
[PubMed]  
[28] Rasti N., Wahlgren M., Chen Q.: Molecular aspects of malaria pathogenesis. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 2004; 41: 9-26
[PubMed]  
[29] Siebert P.D., Fukuda M.: Human glycophorin A and B are encoded by separate, single copy genes coordinately regulated by a tumor-promoting phorbol ester. J. Biol. Chem., 1986; 261: 12433-12436
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[30] Siebert P.D., Fukuda M.: Molecular cloning of human glycophorin B cDNA: Nucleotide sequence and genomic relationship to glycophorin A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987; 84: 6735-6739
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[31] Sim B.K.: EBA-175: An erytrocyte-buinding ligand of Plasmodium falciparum. Parasitol. Today, 1995; 11: 213-217
[PubMed]  
[32] Sim B.K., Chitnis C.E., Wasniowska K., Hadley T.J., Miller L.H.: Receptor and ligand domains for invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum. Science, 1994; 264: 1941-1944
[PubMed]  
[33] Sim B.K., Orlandi P.A., Haynes J.D., Klotz F.W., Carter J.M., Camus D., Zegans M.E., Chulay J.D.: Primary structure of the 175K Plasmodium falciparum erythrocyte binding antigen and identification of a peptide which elicits antibodies that inhibit malaria merozoite invasion. Cell Biol., 1990; 111: 1877-1884
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[34] Thompson J.K,. Triglia T., Reed M.B., Cowman A.F.: A novel ligand from Plasmodium falciparum that binds to a sialic acid-containing receptor on the surface of human erythrocytes. Mol. Microbiol., 2001; 41: 47-58
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[35] Tolia N.H., Enemark E.J., Sim B.K., Joshua-Tor L.: Structural basis for the EBA-175 erythrocyte invasion pathway of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Cell, 2005; 122: 183-193
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[36] Tomita M., Marchesi V.T.: Amino-acid sequence and oligosaccharide attachment sites of human erythrocyte glycophorin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1975; 72: 2964-2968
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[37] Zimmerman P.A,. Patel S.S., Maier A.G., Bockarie M.J., Kazura J.W.: Erythrocyte polymorphisms and malaria parasite invasion in Papua New Guinea, Trends Parasitol., 2003; 19: 250-252
[PubMed]