Postepy Hig Med Dosw. (online), 2007; 61: 555-564
Review


EDHF – śródbłonkowy czynnik hiperpolaryzujący. Znaczenie w fizjologii i chorobach naczyń krwionośnych
Endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF): Potential involvement in the physiology and pathology of blood vessels
Hanna Kozłowska, Marta Baranowska, Anna Gromotowicz, Barbara Malinowska
Zakład Fizjologii Doświadczalnej AM, Białystok
Adres do korespondencji
dr Hanna Kozłowska, Zakład Fizjologii Doświadczalnej AM, ul. Mickiewicza 2a, 15-089 Białystok; e-mail: hkozl@amb.edu.pl

Otrzymano:  2007.06.19
Zaakceptowano:  2007.09.17
Opublikowano:  2007.10.12

Streszczenie
Śródbłonek naczyniowy pełni istotną rolę w utrzymaniu homeostazy naczyniowej poprzez syntezę i uwalnianie czynników regulujących napięcie ściany naczyń krwionośnych, takich jak: prostacykliny (PGI2), tlenek azotu (NO) i niezidentyfikowany jeszcze do końca czynnik hiperpolaryzujący pochodzenia śródbłonkowego – EDHF (endothelium-derived hyperpolarizing factor). Natura EDHF budzi wiele kontrowersji, jednak ten dodatkowy, zależny od śródbłonka szlak hiperpolaryzacji, został potwierdzony w wielu naczyniach krwionośnych różnych gatunków zwierząt, a także człowieka. Mimo znacznych różnic gatunkowych i tkankowych, dominujący udział EDHF w relaksacji poszczególnych łożysk naczyniowych dotyczy głównie naczyń oporowych i mikrokrążenia. Najbardziej prawdopodobnymi kandydatami do miana EDHF są kwasy epoksyeikozatrienowe, jony K+ pochodzące z komórek śródbłonka i nadtlenek wodoru. Hiperpolaryzacja zależna od śródbłonka prawdopodobnie wiąże się także z pobudzeniem zależnych od stężenia jonów wapnia małych i średnich śródbłonkowych kanałów potasowych (SKCa i IKCa). Wskazuje się również, że odpowiedź hiperpolaryzacyjna rozprzestrzenia się dzięki istnieniu elektrycznej komunikacji w postaci połączeń szczelinowych „gap junction” między komórkami śródbłonka a miocytami. Odpowiedź relaksacyjna zachodząca z udziałem EDHF jest zależna od płci i wyraźnie zmniejsza się wraz z wiekiem, a także w różnych stanach patologicznych związanych z dysfunkcją śródbłonka, m.in. hipoksji, nadciśnieniu, miażdżycy, cukrzycy. Wydaje się, iż odpowiednie postępowanie terapeutyczne może przywrócić właściwe działanie EDHF. Pobudzenie śródbłonkowych kanałów potasowych czy oddziaływanie na połączenia szczelinowe typu „gap” mogą w przyszłości stanowić interesujący cel terapeutyczny.
Słowa kluczowe: śródbłonek • hiperpolaryzacja • czynnik hiperpolaryzujący pochodzenia śródbłonkowego – EDHF • tlenek azotu • prostacyklina • kwasy epoksyeikozatrienowe • kanały potasowe • nadtlenek wodoru • połączenia szczelinowe – „gap junction”


Summary
Vascular endothelium plays an important role in maintaining vascular homeostasis by synthesizing and releasing some vasodilating factors, such as prostacyclin (PGI2), nitric oxide (NO), and a yet unidentified endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF). Although the nature of EDHF is still controversial, this additional endothelial pathway, endothelium-dependent hyperpolarization, has been demonstrated in many blood vessels of different species, including humans. Despite tissue- and species-specific site differences, endothelium-dependent hyperpolarization plays an important role in the regulation of resistance of vessels and microcirculation. The most probable candidates for EDHF include epoxyeicosatrienoic acids, endothelium-derived potassium ions (K+), and hydrogen peroxide (H2O2). Endothelium-dependent hyperpolarization also probably involves the activation of two populations of endothelial potassium channels, i.e. the small- and intermediate-conductance calcium-activated potassium channels (SKCa and IKCa). Electrical communication between endothelial and smooth muscle cells through gap junctions has also been suggested to be involved in endothelium-dependent hyperpolarization. EDHF-mediated responses are clearly sex-dependent and altered in aging and various pathological conditions, such as hypoxia, hypertension, atherosclerosis, and diabetes, which are mainly related to endothelial dysfunction. Suitable therapeutic treatment can restore these impaired vascular responses. Activating endothelial potassium channels or improving myo-endothelial communication could become interesting therapeutic targets.
Key words: endothelium • hyperpolarization • endothelium-derived hyperpolarizing factor – EDHF • nitric oxide • prostacyclin • epoxyeicozatrienoic acids • potassium channels • hydrogene peroxide • “gap junction”




Wykaz skrótów:
AA – kwas arachidonowy; AC – cyklaza adenylanowa; Ach – acetylocholina; ATP – trifosforan adenozyny; BKCa – kanały potasowe zależne od stężenia jonów wapnia o dużym przewodnictwie; Ca2+ – jony wapnia; cAMP – cykliczny monofosforan adenozyny; cGMP – cykliczny monofosforan guanozyny; ChTx – charybdotoksyna; CNP – peptyd natriuretyczny C; COX – cyklooksygenaza; Cu/Zn-SOD – dysmutaza nadtlenkowa; DHET – kwas dihydroksyeikozatrienowy; EDHF – śródbłonkowy czynnik hiperpolaryzujący; EETs – kwasy epoksyeikozatrienowe; EHDD – kwas epoksydeksadekadienowy; eNOS – śródbłonkowa syntaza tlenku azotu; GAP – połączenia mioendotelialne; HETE – kwas hydroksyeikozatrienowy; H2O2 – nadtlenek wodoru; IbTx – iberiotoksyna; IKCa – kanały potasowe zależne od stężenia jonów wapnia o średnim przewodnictwie; IP3 – trójfosforan inozytolu; K+ – jony potasu; KATP – kanały potasowe zależne od ATP; KIR kanały potasowe wewnątrzprostownicze; KV – kanały potasowe zależne od napięcia; L-NAME – ester metylowy Nw-nitro-L-argininy; NADPH – zredukowany fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego; NO – tlenek azotu; ODYA – kwas oktadecynowy, inhibitor cytochromu P-450; PGI2 – prostacyklina; PLA2 – fosfolipaza A2; sGC – cyklaza guanylowa; SKCa – kanały potasowe zależne od stężenia jonów wapnia o małym przewodnictwie.
WSTĘP
Odkrycie przez Furchgotta i Zawadzkiego [39] w 1980 r. zjawiska hiperpolaryzacji zależnej od śródbłonka zapoczątkowało obiecujące badania nad jego rolą w regulacji napięcia ściany naczyń krwionośnych. Wykazano, iż zmiana ta, czyli powstanie bardziej ujemnego potencjału wewnątrzkomórkowego na skutek wypływu dodatnich jonów z wnętrza komórki i relaksacja naczynia, jest następstwem uwolnienia z komórek śródbłonka jednej lub kilku substancji wazoaktywnych (hiperpolaryzujących), m.in.: tlenku azotu (NO) i prostacykliny (PGI2) [39,83]. W ostatnich latach stało się oczywiste, że nie są to jedyne substancje odpowiedzialne za rozkurcz naczyń. Tlenek azotu i prostacyklina hiperpolaryzują miocyty i hamują aktywność miogenną ściany naczyniowej zarówno pośrednio przez drugie przekaźniki (odpowiednio cGMP i cAMP), jak i bezpośrednio przez aktywację kanału potasowego KATP, zależnego od stężenia ATP w komórce (ryc. 1).
Ryc. 1. Kompensacyjne działanie śródbłonkowych czynników hiperpolaryzacyjnych. Hiperpolaryzacja mięśni gładkich może zachodzić za pośrednictwem trzech różnych szlaków: tlenku azotu (NO), śródbłonkowego czynnika hiperpolaryzującego (EDHF) i prostacykliny (PGI2). Hiperpolaryzacja zależna od NO odbywa się przez pobudzenie kanałów potasowych bezpośrednio lub pośrednio przez drugi przekaźnik cGMP, a zależna od PGI2 wymaga pośrednictwa przekaźnika cAMP. EDHF aktywuje kanały potasowe. W warunkach osłabionej syntezy NO (np. dysfunkcje śródbłonka, hipercholesterolemia) EDHF może kompensować działanie NO

Zauważono, że hiperpolaryzacja miocytów naczyń krwionośnych szczura i świnki morskiej stymulowana chemicznie (np. przez acetylocholinę, bradykininę), bądź mechanicznie (tzw. napięcie ścinające „shear stress”) utrzymywała się zarówno po zablokowaniu wytwarzania przez śródbłonek NO i PGI2, jak i KATP w mięśniach [22,58,89]. Potwierdziło to istnienie dodatkowego, parakrynnego regulatora tonu naczyniowego NO- i PGI2-niezależnego – śródbłonkowego czynnika hiperpolaryzującego komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych – EDHF (endothelium-derived hyperpolarizing factor) [24,81,84].
EDHF jest prawdopodobnie syntetyzowaną w śródbłonku substancją, wrażliwą na blokery kanałów potasowych i/lub wzrost zewnątrzkomórkowego stężenia jonów K+ i uwalnianą w wyniku stymulacji fizycznej czy też farmakologicznej. Może być także zmianą potencjału błonowego generowaną w komórkach śródbłonka. Dyfundując do miocytów prowadzi do hiperpolaryzacji ich błony komórkowej, a w konsekwencji do rozkurczu bez wzrostu, charakterystycznego dla klasycznych substancji rozszerzających naczynia, wewnątrzkomórkowego stężenia cyklicznych nukleotydów – cGMP bądź cAMP. W warunkach eksperymentalnych poprzez zależną od EDHF relaksację naczynia rozumiemy działanie w obecności blokady NO i PGI2 [26,31].
Historia EDHF sięga 1988 r., kiedy to Félétou i Vanhoutte [27] opisali po raz pierwszy, czynnik powodujący rozkurcz izolowanej tętnicy wieńcowej psa, uprzednio skurczonej pod wpływem fenylefryny. Mimo zastosowania L-NAME (ester metylowy Nw-nitro-L-argininy) i indometacyny (blokujących odpowiednio powstawanie tlenku azotu i prostacykliny), acetylocholina wciąż powodowała relaksację tych naczyń [27,83]. Obserwacje te skłoniły do wysunięcia hipotezy o istnieniu dodatkowego, niezależnego od NO i PGI2, czynnika wytwarzanego przez komórki śródbłonka, który powoduje hiperpolaryzację i rozkurcz naczyń krwionośnych [7,28,61]. Mimo iż mechanizm działania EDHF dotąd nie został do końca poznany, niewątpliwe jest istnienie dodatkowej drogi oddziaływania między komórkami śródbłonka a komórkami mięśni gładkich naczyń.
Obecność EDHF została potwierdzona w wielu łożyskach naczyniowych u różnych gatunków zwierząt i u ludzi. Mimo znacznych różnic gatunkowych i tkankowych, udział śródbłonkowego czynnika hiperpolaryzującego dotyczy głównie rozkurczu naczyń oporowych i mikrokrążenia [26]. Istnieje prosta zależność funkcjonowania EDHF od średnicy naczyń. Jego znaczenie wzrasta, gdy średnica naczynia maleje (wyjątek stanowi krążenie wieńcowe i naczynia nerkowe, gdzie pełni główną rolę niezależnie od wielkości tętnicy) [82]. O ile w doświadczeniach z użyciem zwierzęcych naczyń o funkcji transportowej: aorta [48], tętnica piersiowa [87], blokada tlenku azotu i prostacykliny całkowicie znosiła wazorelaksację, to zależne od śródbłonka zdolności rozkurczowe naczyń o średnicy co najmniej 300 µM były związane z działaniem zarówno NO, jak i EDHF [34]. W tętnicach o średnicy mniejszej niż 300 µM znaczenie tlenku azotu jako wazodylatatora maleje na rzecz EDHF [26,65]. Badania funkcjonalne, wskazujące na zależność wielkości średnicy naczynia a obecnością substancji rozkurczowych i punktów uchwytu ich działania zostały również potwierdzone badaniami elektrofizjologicznymi, w których udowodniono, że zależne od śródbłonka zmiany potencjału błonowego korelują ze średnicą naczynia i są znacząco większe w naczyniach o mniejszym przekroju [44,78].
HIPERPOLARYZACJA Z UDZIAŁEM EDHF A ROZKURCZ MIĘŚNI GŁADKICH ŚCIANY NACZYNIA TĘTNICZEGO
Hiperpolaryzacja komórek śródbłonka pod wpływem chemicznych ligandów (m.in. acetylocholiny, bradykininy), a także napięcia ścinającego przepływającej krwi, nasilają gradient elektryczny wejścia do komórki jonów Ca2+. W warunkach doświadczalnych sytuację taką można symulować za pomocą jonoforów Ca2+, np.: A 23187 – [47]. Inną możliwością jest uwolnienie Ca2+ z magazynów wewnątrzkomórkowych (farmakologiczna blokada Ca2+- ATP-azy sarkoplazmatycznej tapsigaryną czy kwasem cyklopiazonowym – [38]). Wszystkie powyższe metody prowadzą do globalnego wzrostu wewnątrzkomórkowego stężenia jonów Ca2+, co koreluje z nasileniem syntezy i uwalniania parakrynnych czynników naczyniorozszerzających, w tym EDHF [7]. Wskazuje się, iż jony Ca2+ uwolnione z siateczki sarkoplazmatycznej inicjują wytwarzanie EDHF, podczas gdy ich przezbłonowy napływ przez nieswoiste kanały jest istotny dla odpowiedzi zależnej od EDHF [37,62,79]. Niewątpliwym potwierdzeniem istotności jonów Ca2+ w regulacji zależnych od EDHF procesów naczyniowych (w obecności blokerów syntazy tlenku azotu i prostacykliny) jest obserwacja osłabionej odpowiedzi na bradykininę w środowisku bezwapniowym bądź w obecności blokerów dokomórkowych kanałów wapniowych, m.in. jonów Ni2+ [79]. Nie stwierdzono ostatecznie, czy rozprzestrzenianie się hiperpolaryzacji z komórek śródbłonka na miocyty ma charakter chemiczny, tj. odbywa się za pośrednictwem różnych przekaźników, czy też może polega na przenoszeniu ładunków elektrycznych przez niskooporowe złącza szczelinowe, tzw. „gap junction” [42,43].
POTENCJALNE MECHANIZMY DZIAŁANIA EDHF
Istnieje kilka teorii tłumaczących, czym jest i jak działa EDHF. Uznanie jednej z nich za nadrzędną nie jest możliwe, co wynika z tego, że u różnych gatunków, a nawet w różnych naczyniach, inny czynnik może odpowiadać za hiperpolaryzację [84]. Na przestrzeni kilku ostatnich lat, EDHF był określany najczęściej jako jony potasu, kwasy epoksyeikozatrienowe, nadtlenek wodoru, połączenia „gap junction” oraz rzadziej jako peptyd natiuretyczny C, anandamid [1,7,32,42] (ryc. 2).
Ryc. 2. Potencjalne mechanizmy działania śródbłonkowego czynnika hiperpolaryzującego (EDHF). Pobudzenie receptorów śródbłonkowych (neurohumoralne, farmakologiczne, napięcie ścinające „shear stress”) prowadzi do wzrostu stężenia jonów wapnia (Ca2+) w komórkach śródbłonka, w wyniku czego dochodzi do uwalniania czynnika hiperpolaryzującego – EDHF. Potencjalne mechanizmy działania tego czynnika mogą się opierać na bezpośrednim pobudzeniu śródbłonkowych kanałów potasowych (SKCa, IKCa), aktywacji w śródbłonku i miocytach kanałów potasowych (SKCa, IKCa, BKCa, KIR) za pośrednictwem wtórnych przekaźników, takich jak kwasy epoksyeikozatrienowe (EETs) powstające z kwasu arachidonowego (AA), nadtlenek wodoru (H2O2), jony K+. Hiperpolaryzacja z komórek śródbłonka przenosi się na sąsiednie komórki śródbłonka bądź na położone poniżej miocyty, prawdopodobnie za pośrednictwem połączeń mio-endotelialnych – „gap junction” (GAP), prowadząc do hiperpolaryzacji i rozkurczu mięśni gładkich. 1–6 miejsce działania i blokery kanałów potasowych zależnych od Ca2+

JONY K+ JAKO EDHF
W doświadczeniach na izolowanych naczyniach zwierząt i człowieka wielu autorów [13,14,22,24] potwierdziło związek między mechanizmem działania czynnika hiperpolaryzującego EDHF i pobudzeniem (zarówno bezpośrednim jak i pośrednim) kanałów potasowych w śródbłonku i miocytach. Wzrost zewnątrzkomórkowego stężenia jonów K+ powyżej 25 mM znosił zjawisko hiperpolaryzacji [12], natomiast zastosowanie związków powodujących hiperpolaryzację błony komórkowej (m.in. acetylocholiny, bradykininy) prowadziło do wypływu znakowanych radioaktywnie jonów 42K [7].
W 1998 r. po raz pierwszy opublikowano, że jony K+ mogą być EDHF [22]. W szczurzej tętnicy wątrobowej dochodziło do wzrostu zewnątrzkomórkowych prądów potasowych po podaniu acetylocholiny czy bradykininy, co powodowało hiperpolaryzację zarówno śródbłonka, jak i komórek mięśni gładkich. Reakcja rozkurczowa naczyń krwionośnych tętnicy szyjnej świnki morskiej bądź szczurzej tętnicy wątrobowej wywołana przez EDHF była całkowicie, bądź prawie całkowicie hamowana przez podane jednocześnie apaminę i charybdotoksynę (blokujących odpowiednio kanały potasowe o małej (SKCa), średniej (IKCa) i dużej (BKCa) przewodności).Nie była natomiast zmniejszana przez iberiotoksynę (selektywnego blokera kanałów potasowych o dużej przewodności dla jonów wapnia BKCa) [16,22]. Wskazywałoby to na udział w komponencie śródbłonkowej „odpowiedzi z EDHF” kanałów potasowych zależnych od wapnia o małej (SKCa) i średniej (IKCa) przewodności. Prawdopodobnie toksyny blokujące kanały potasowe zależne od wapnia KCa (apamina i charybdotoksyna) działają na śródbłonek naczyniowy, gdyż ich podanie bezpośrednio do komórek śródbłonka zapobiegło zależnej od EDHF relaksacji mięśni gładkich naczyń krwionośnych [21], a ich hamujące właściwości polegały na obniżeniu siły napędowej wejścia jonów wapniowych do komórki [80] (ryc. 2).
Dodatkowo, 1-etyl-2-benzimidazolinon (1-EBIO), aktywator IKCa i prawdopodobnie SKCa, ale nie BKCa powodował hiperpolaryzację śródbłonka, a odpowiedź ta była wrażliwa na charybdotoksynę, a niewrażliwa na iberiotoksynę [15,23]. Następstwem otwarcia tych kanałów jest wypływ jonów potasu i zwiększenie ich stężenia w przestrzeni pomiędzy komórkami śródbłonka a miocytami. Umiarkowany wzrost [K+] w tej przestrzeni (tj. <15 mM) może wywołać hiperpolaryzację i rozkurcz mięśni gładkich przez pobudzenie kanałów potasowych „wewnątrzprostowniczych” – KIR oraz aktywację Na+/K+-ATP-azy obecnej w błonie miocytów [13] (ryc. 2). W badaniach na tętnicy wątrobowej i krezkowej szczura Edwards i wsp. [22] zauważyli, że hiperpolaryzacja mięśni gładkich może być częściowo zahamowana przez ouabainę (inhibitor Na+/ K+-ATP-azy) i niskie stężenia jonów Ba2+ (30 µM) (bloker KIR) lub zniesiona całkowicie przez podanie tych dwóch związków razem. Utrzymana hiperpolaryzacja śródbłonka, mimo zniesionej hiperpolaryzacji miocytów wskazuje, że blokery te działają tylko na poziomie mięśni gładkich [22]. Niewątpliwie zmiany w stężeniu zewnątrzkomórkowych jonów K+ odgrywają istotną rolę w regulacji napięcia naczyniowego naczyń o małej średnicy, a więc tej części łożyska naczyniowego, gdzie dominującą rolę rozkurczową odgrywa EDHF. Zastanawia jednakże to, czy źródłem jonów K+ są rzeczywiście komórki śródbłonka, które zajmują relatywnie do komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych małą powierzchnię i czy niewielki wzrost stężenia jonów K+ jest wystarczający do pobudzenia kanałów potasowych i zmian napięcia w mięśniówce naczyniowej? Istnieje również hipoteza potwierdzona licznymi modelami badawczymi, z użyciem mikroelektrod, voltage clamp i miografów o wysokim stopniu specjalizacji EDHF w zależności od łożysk naczyniowych użytych do doświadczeń [15]. Zmiany zewnątrzkomórkowego stężenia jonów K+ powodowały zależną od EDHF odpowiedź w tętnicy wątrobowej szczura, ale nie w tętnicach podśluzówkowych i wieńcowych świnki morskiej czy ludzkich naczyń podskórnych [15].
Z pewnością jony K+ są w niektórych łożyskach naczyniowych (m.in. w naczyniach krezkowych szczura, myszy i świnki morskiej) jednym z głównych lecz nie jedynym, kofaktorem reakcji zależnych od EDHF [18,19,20,22].
KWASY EPOKSYEIKOZATRIENOWE (EETS) JAKO EDHF
Kwas arachidonowy pochodzący z błon komórkowych jest przekształcany przez różne enzymy do wielu metabolitów, które wpływają na napięcie mięśni gładkich naczyń krwionośnych (tromboksan, prostaglandyny, prostacykliny). Kwasy epoksyeikozatrienowe (5,6-EETs, 8,9-EETs, 11,12-EETs, 14,15-EETs) powstają w wyniku przemiany kwasu arachidonowego pod wpływem epoksygenaz cytochromu P-450 stymulowanych wzrostem stężenia wewnątrzkomórkowego jonów Ca2+ [9,10,33] (ryc. 3).
Ryc. 3. Metabolizm kwasu arachidonowego. Kwas arachidonowy, uwalniany z błon komórkowych, pod wpływem epoksygenaz cytochromu P-450 zostaje zmetabolizowany do aktywnych produktów – kwasów epoksyeikozatrienowych (EET), które pretendują do miana czynnika hiperpolaryzującego – EDHF

Kwasy epoksyeikozatrienowe, zarówno endo-, jak i egzogenne rozkurczały mięśnie gładkie naczyń poprzez wpływ na śródbłonkowe kanały potasowe – IKCa i SKCa oraz mięśniowe BKCa [7,9,10,32] (ryc. 2).
Rolę kwasów EETs, jako EDHF potwierdzono głównie na izolowanych naczyniach wieńcowych świni, psa, bawołu, a także ludzkich tętnicach wieńcowych [7]. W naczyniach tych hiperpolaryzacja była hamowana przez inhibitory cytochromu P-450 (klotrimazol, proadifen, 17-ODYA – kwas oktadecynowy), a zwiększana przez czynniki aktywujące cytochrom P-450 (3-metylcholantren lub beta-naftoflawon) [67]. Podobne obserwacje poczyniono w naczyniach ludzkich: tętnicy wieńcowej, piersiowej wewnętrznej oraz podskórnej [3,33].
Jednak brak wpływu inhibitora cytochromu P-450 -17-ODYA i egzogennie podanych EETs wykluczały potencjalny udział EETs w relaksacji izolowanej tętnicy szyjnej świnki morskiej [10]. Rola pochodnych kwasu arachidonowego była dodatkowo kwestionowana, ponieważ działały one przez kanały potasowe zależne od jonów wapnia (BKCa), blokowane przez iberiotoksynę, a nie przez kanały potasowe wrażliwe na apaminę i charybdotoksynę (SKCa i IKCa), czyli mechanizm charakterystyczny dla EDHF [58]. Co więcej, Fisslthaler i wsp. [29] wykazali brak wrażliwości tętnicy wieńcowej świni na jony Ba2+ i ouabainę (blokery kanałów KIR i Na+-K+-ATP-azy) w wyniku stymulacji agonistą odpowiedzi zależnej od EDHF, a rozkurcz wywołany podaniem 11,12-EET w tętnicy wieńcowej wołu był identyczny w przypadku naczyń z zachowanym i usuniętym śródbłonkiem, co przeczy teorii kwasów epoksyeikozatrienowych, jako głównych autokrynnych modulatorów funkcji komórek śródbłonka [69].
Jak wynika z wielu badań kwasy EETs nie są w stanie odpowiadać za całość hiperpolaryzacji. W niektórych naczyniach mogą być jedynie czynnikiem modulującym odpowiedź hiperpolaryzującą, poprzez zwiększanie napływu jonów wapnia do komórek, zwiększenie wrażliwości kanałów potasowych zależnych od stężenia wapnia (wrażliwych na iberiotoksynę), a także przez stymulację połączeń „gap junction” [7,10,84].
NADTLENEK WODORU JAKO EDHF
Nadtlenek wodoru (H2O2) jest wytwarzany z anionorodników ponadtlenkowych pod wpływem dysmutazy nadtlenkowej w wielu komórkach organizmu, w tym w śródbłonku naczyniowym. Ich źródłem są: syntaza tlenku azotu (eNOS), cyklooksygenazy, lipooksygenazy, epoksygenazy cytochromu P-450 i oksydazy NADPH. Nasilona synteza H2O2 z udziałem eNOS zachodzi przy braku jej substratu (L-argininy), bądź kofaktora BH4 (tetrahydrobiopteryna) [64], prowadząc do upośledzonego wytwarzania tlenku azotu. Powstały H2O2 pobudza kanały potasowe zależne od wapnia (KCa) i ATP (KATP) w komórkach śródbłonka i w komórkach mięśni gładkich naczyń co prowadzi do ich hiperpolaryzacji [51,58,75] (ryc. 4).
Ryc. 4. Nadtlenek wodoru jako potencjalny EDHF. W wyniku pobudzenia receptorów śródbłonkowych (neurohumoralnego, farmakologicznego, napięciem ścinającym „shear stress”) dochodzi do wzrostu stężenia jonów Ca2+ w komórkach śródbłonka i aktywacji wielu enzymów – syntazy tlenku azotu (eNOS), cyklooksygenazy (COX), peroksydazy cytochromu P-450 (CYP). Aktywacja tych enzymów prowadzi do powstania reaktywnych form tlenu (O2), które zredukowane przez dysmutazę ponadtlenkową (Cu/Zn – SOD) są źródłem m.in. nadtlenku wodoru (H2O2). Uważa się, że H2O2 wywołuje odpowiedź hiperpolaryzacyjną za pośrednictwem różnych mechanizmów, m.in. połączeń szczelinowych „gap junction”, a także aktywuje bezpośrednio i pośrednio śródbłonkowe i miocytowe kanały potasowe (KCa i KATP) wpływając na uwalnianie kwasu arachidonowego (AA) poprzez pobudzenie fosfolipazy A2 (PLA2). Pod wpływem katalazy H2O2 rozkładany jest do H2O i O2

Nadtlenek wodoru uznano po raz pierwszy za EDHF w izolowanych tętnicach krezkowych myszy pozbawionych śródbłonkowej syntazy tlenku azotu [57]. W badaniach tych zauważono, że rozkurcz naczyń krwionośnych pod wpływem acetylocholiny był zmniejszany przez katalazę (enzym rozkładający nadtlenek wodoru), co wskazuje na powiązanie ze śródbłonkową syntezą nadtlenku wodoru. Katalaza zmniejszała również hiperpolaryzację wywołaną podaniem bradykininy w tętnicy krezkowej szczura i naczyniach mózgowych świni [75].
Teorię o nadtlenku wodoru jako czynniku EDHF potwierdzono również w doświadczeniach na tętnicach krezkowych i wieńcowych człowieka. W naczyniach tych katalaza znacząco osłabiała, a podanie egzogennego nadtlenku wodoru przywracało hiperpolaryzację i rozkurcz zależny od EDHF po podaniu agonistów (m.in. acetylocholiny (Ach), bradykininy) [56,75].
Uznanie EDHF za nadtlenek wodoru otworzyło nowe obszary badań nad czynnikami hiperpolaryzującymi w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Dalsze prace pozwolą wyjaśnić proces powstawania H2O2 w śródbłonku, mechanizm jego naczyniorozszerzającego działania, a także rolę, jaką odgrywa w fizjologii i patofizjologii układu krążenia [72,75].
POŁĄCZENIA SZCZELINOWE „GAP JUNCTION” JAKO EDHF
„Gap junction” pod względem strukturalnym są małymi, niskooporowymi porami w błonach przylegających do siebie komórek, co umożliwia bezpośrednie, dwukierunkowe przekazywanie sygnałów między komórkami, jak też molekuł o budowie hydrofilnej (np.: cAMP, cGMP, IP3, czy też nieorganicznych jonów, w tym Ca2+). Niskooporowe złącza przypominają kanały, dlatego też zostały nazwane „hemichannels” – pseudokanałami, zbudowanymi z podjednostek proteinowych – koneksyn, przy czym za najistotniejszą pod względem strukturalnym i funkcjonalnym i to zarówno w śródbłonku, jak i w komórkach mięśni gładkich, uważa się koneksynę 43 [80]. Pojedyncze „gap junction” mogą łączyć się w agregaty, tworząc rozbudowaną i gęstą sieć połączeń, widocznych pod mikroskopem elektronowym. Taka sieć znacznie ułatwia komunikację między komórkami, a tym samym przekaźnictwo różnych czynników [42,43] (ryc. 2).
„Gap junction” mogą występować pomiędzy komórkami homotypowymi: komórka śródbłonka – komórka śródbłonka, miocyt – miocyt, ale także pomiędzy komórkami heterotypowymi, np. komórka śródbłonka – miocyt, umożliwiając przekazywanie hiperpolaryzacji z jednej komórki na drugą. Istnienie tych swoistych zespoleń po części tłumaczy zjawisko powstania i rozprzestrzeniania się hiperpolaryzacji z endotelium na sąsiednie komórki sródbłonka, a także na położone niżej komórki mięśni gładkich, w odpowiedzi na działanie agonistów, np. Ach, bradykininy i substancji P [42] (ryc. 2). Wiele doświadczeń wskazuje na pośrednictwo połączeń mioendotelialnych w zjawisku EDHF („EDHF phenomenon”) [42], wykluczając tym samym istnienie EDHF jako potencjalnie funkcjonalnej molekuły. Badania dowodzą, że liczba tych heterotypowych zespoleń (mio-endotelialnych) wzrasta, gdy średnica naczyń maleje, co oznacza, że „gap junction” odgrywają rolę głównie w mikrokrążeniu [7]. Powyższa zależność koreluje zatem z głównym miejscem występowania i działania EDHF. Emmerson i Segal [25] potwierdzili istnienie połączeń szczelinowych i główną rolę śródbłonka w inicjowaniu i transdukcji zmian hiperpolaryzacyjnych w tętniczkach odżywczych mięśni szkieletowych chomika po podaniu Ach. Reakcja była całkowicie zniesiona w przypadku zniszczenia śródbłonka, a zachowana przy uszkodzeniu warstwy mięśniowej. Dodatkowo istnienie funkcjonalnej komunikacji elektrycznej między śródbłonkiem i miocytami wykazano m.in. w badaniach z użyciem podśluzówkowych arterioli jelita cienkiego świnki morskiej. Ach w sposób wrażliwy na charybdotoksynę i apaminę indukowała wypływ jonów K+ z komórki śródbłonkowej i mięśniowej, natomiast podanie Ach w obecności nieselektywnych blokerów połączeń „gap junction” (halotan, heptanol, kwas 18- a-glicyryzynowy) wywołało ucieczkę jonów K+ z komórek śródbłonka przy braku jakichkolwiek zmian w przepływie jonów w komórkach mięśni gładkich [15,88].
„Gap junction” umożliwia rozprzestrzenianie się hiperpolaryzacji ze śródbłonka na mięśnie gładkie naczyń powodując zamykanie w błonie miocytów zależnych od potencjału kanałów wapniowych typu L (VGCC-L) i tym samym zmniejszenie stężenia jonów wapnia w miocycie i relaksację mięśni gładkich. Badania strukturalne potwierdzają udział „gap junction” w integracji komunikacji śródbłonkowo- mięśniowej, pomimo bliskich kontaktów komórek endotelium i miocytów, charakter przekazywanej hiperpolaryzacji pozostaje nadal niewyjaśniony.
Badania Edwardsa i wsp. [23] porównujące odpowiedź zależną od EDHF w tętnicy szyjnej wewnętrznej świnki morskiej i szczurzej tętnicy krezkowej, wykazały, że o ile w naczyniach szczura połączenia „gap junction” odgrywają główną rolę komunikacyjną, a jony K+ spełniają funkcję EDHF, to w naczyniach świnki morskiej połączenia szczelinowe są dominującym mechanizmem hiperpolaryzacji zależnej od śródbłonka. Istnieją, zatem dwie główne hipotezy dotyczące EDHF i „gap junction”. Jedna mówi o przekaźnictwie elektrycznych ładunków przez „gap junction”, druga natomiast o transporcie czynników chemicznych z komórek śródbłonka do miocytów [4,7,42].
W pewnych stanach fizjologicznych (np. ciąża) oraz patologicznych (nadciśnienie) zwiększa się ekspresja koneksyn, a więc i liczba połączeń mio-endotelialnych. Prawdopodobnie jest to mechanizm kompensujący zmniejszone działanie NO [26] (ryc. 1).
INNE TEORIE
W 1994 r. powstała hipoteza, iż to endogenny kannabinoid anandamid pełni funkcję śródbłonkowego czynnika hiperpolaryzującego [70,71]. Antagonista receptora kannabinoidowego CB1 SR 141716 (rimonabant) osłabiał stymulowany podaniem karbacholu i jonoforu wapniowego („egzogenny EDHF”) rozkurcz izolowanej tętnicy krezkowej czy wieńcowej szczura w obecności inhibitorów syntazy tlenku azotu i cytochromu P-450 klotrimazolu. Antagonista ten hamował także rozkurczowe działanie anandamidu czy też wysokich stężeń potasu. Wyniki badań dwóch grup naukowych Chataigneaua [10] i Zygmunta [91] wykazały niezależnie różnice w rodzaju kanałów zaangażowanych w hiperpolaryzację mięśni gładkich naczyń krezkowych szczura wywołaną podaniem anandamidu i EDHF. Co więcej, pojawiły się prace donoszące, iż to nie anandamid per se, a jego metabolity są odpowiedzialne za rozkurcz naczyń krwionośnych [68].
Rola śródbłonkowego peptydu natriuretycznego C (CNP) jako potencjalnego EDHF ograniczona jest do szczurzego łożyska krezkowego i wieńcowego, w których pod wpływem stymulacji acetylocholiną, uwolniony ze śródbłonka CNP prowadził do hiperpolaryzacji i rozkurczu naczynia za pośrednictwem niezależnego od cGMP pobudzenia kanałów KIR i Na+/K+ ATP-azy [11,46]. Mechanizm działania hiperpolaryzacyjnego nowego pretendenta do miana EDHF angażował jednak pobudzenie kanału BKCa, a nie SKCa i IKCa, a dodatkowo jego działanie było całkowicie hamowane przez podanie kwasu 18a-glicyryzynowego, który powodował jedynie nieznaczne osłabienie rozkurczu zależnego od EDHF [45]. CNP może pełnić zatem dodatkową rolę zabezpieczającą naczynia przed nadmiernym skurczem w przypadku zmniejszonego działania klasycznych czynników śródbłonkowych, tj. PGI2 i NO. Może też modulować działanie „gap junction”, jednak z pewnością nie jest on uniwersalnym śródbłonkowym czynnikiem hiperpolaryzującym [1,73].
Inną cząsteczką powodującą hiperpolaryzację i rozkurcz komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych, przez wpływ na duże kanały potasowe (BKCa), jest tlenek węgla (CO) [5]. Powstaje on w śródbłonku i miocytach w wyniku rozkładu hemu pod wpływem oksygenaz hemowych (głównie HO- 2). Jednakże w tętnicach wieńcowych wołu, gdzie EDHF odgrywa znaczącą rolę stwierdzono jedynie nieznaczną, w porównaniu z innymi naczyniami ekspresję HO-2 [90]. Ponadto, okazało się, że CO pobudza cyklazę guanylową. Powyższe fakty podważają rolę CO jako EDHF [80].
AKTYWNOŚĆ EDHF W FIZJOLOGII
Zależność aktywności czynnika EDHF od wieku badano m.in. w doświadczeniach przeprowadzonych na izolowanej tętnicy krezkowej szczurów 3-, 6-, 12- i 24- miesięcznych. Stwierdzono, że kurczone noradrenaliną naczynia szczurów starszych ulegały w mniejszym stopniu rozkurczowi pod wpływem Ach w obecności indometacyny i L-NAME (wykluczających potencjalny udział PGI2 i NO w rozkurczu) w porównaniu z młodszymi zwierzętami [40,41]. Podobne wyniki uzyskano porównując odpowiedź w badaniach tętnicy nerkowej szczurów 3- i 18-miesięcznych na podanie Ach i bradykininy [8,52,53]. Sugerowaną przyczyną słabszego działania hiperpolaryzacyjnego zależnego od EDHF jest zmniejszająca się z wiekiem aktywność oraz liczba połączeń typu „gap junction” [49].
Stwierdzono, że wielkość odpowiedzi hiperpolaryzacyjnej i udział w niej – EDHF (% rozkurczu naczyń w warunkach blokady NO i PGI2) zależy również od płci. Żeńskie hormony płciowe, szczególnie estrogeny, zwiększają udział EDHF w relaksacji niektórych naczyń krwionośnych i potęgują jego działanie [54,85]. Zaobserwowano bowiem, że rozkurcz naczyń obwodowych, zachodzący za pośrednictwem EDHF, jest większy u kobiet niż u mężczyzn. Mechanizm wiążący estrogeny z EDHF polega prawdopodobnie na zwiększeniu liczby połączeń „gap junction”. Opisywany jest także korzystny wpływ estrogenów na ekspresję kanałów potasowych zależnych od stężenia jonów wapnia – KCa [14,26,59]. Zaobserwowano również zwiększone uwalnianie czynników hiperpolaryzujących ze śródbłonka, w tym EDHF, podczas ciąży [26,59,66].
EDHF W WYBRANYCH STANACH PATOLOGICZNYCH DOTYCZĄCYCH SCHORZEŃ SERCOWO-NACZYNIOWYCH
W ostatnich latach wykazano, iż nie tylko upośledzone wytwarzanie tlenku azotu czy prostacykliny, ale też innych śródbłonkowych czynników wazodylatacyjnych, w tym EDHF, odgrywa ważną rolę w patogenezie zmian naczyniowych [83]. EDHF współdziałając z NO stanowi pewien margines bezpieczeństwa w sytuacjach patologicznych, zastępując NO, jeśli jego synteza i działanie jest upośledzone na skutek nadmiernej generacji aktywnych form tlenu, np. w miażdżycy, chorobie niedokrwiennej serca, po zawale [7] (ryc. 1).
Zaobserwowano, że obniżona prężność tlenu (hipoksja) w naczyniach krwionośnych, szczególnie w krążeniu mózgowym i wieńcowym zmniejsza syntezę i uwalnianie NO, co prowadzi do osłabienia odpowiedzi relaksacyjnej. To upośledzone działanie może być kompensowane przez zwiększoną aktywność EDHF, który stanowi swoisty margines bezpieczeństwa w stanach patologicznych [26,43].
Taki mechanizm kompensujący zauważono u szczurów rasy Dahl, będących na diecie bogatosodowej, u których z powodu upośledzonej zależnej od NO komponenty rozkurczowej naczyń rozwinęło się nadciśnienie [28]. W innym genetycznym modelu nadciśnienia – podwójnej delecji genu śródbłonkowej syntazy tlenku azotu i genu cyklooksygenazy 1, zaobserwowano zależnie od płci zmiany tonu naczyniowego. Podczas gdy samice były normotensyjne, samce myszy wykazywały wysokie ciśnienie krwi [74]. Zachowanie prawidłowego przepływu krwi i oporu naczyniowego u samic nie było upośledzone w wyniku zależnej od EDHF (wg autorów aktywacja KIR i pompy sodowo-potasowej) kompensacji upośledzonej zdolności wazorelaksacyjnej (nieobecność śródbłonkowych związków relaksacyjnych – NO i PGI2) (ryc. 1). U samców natomiast wskutek poważnego uszkodzenia śródbłonka nie obserwowano kompensacyjnego działania EDHF. Podobne wyniki uzyskano u pacjentów z nadciśnieniem, u których odpowiedź zależna od EDHF po podaniu bradykininy działała jako mechanizm kompensujący wobec osłabienia aktywności NO [77]. Również w przebiegu miażdżycy naczyń (tętnica nerkowa królika [6]) zauważono wzrost aktywności EDHF i znacznie słabsze działanie NO.
Inne badania wskazują, iż to upośledzone wytwarzanie EDHF, a nie NO może prowadzić do słabszej zależnej od śródbłonka relaksacji naczyń krwionośnych w warunkach nadciśnienia. W tętnicy krezkowej szczurów SHR, tj. z genetycznie uwarunkowanym nadciśnieniem, obserwowano osłabienie odpowiedzi zależnej od EDHF (odpornej na zablokowanie syntazy tlenku azotu i prostacykliny) [35] z zachowaniem odpowiedzi z udziałem NO [41]. Jedną z teorii wyjaśniających upośledzone działanie EDHF u szczurów SHR może być wzrost grubości warstwy mięśniowej i/lub supresja kanałów wewnątrzprostowniczych KIR w nadciśnieniu [28,60].
Obecnie zwraca się coraz większą uwagę na upośledzoną rolę EDHF w przebiegu cukrzycy, gdzie dochodzi do zaburzeń funkcji śródbłonka, zwłaszcza w naczyniach mikrokrążenia i do powstania powikłań naczyniowych, takich jak mikroangiopatie, nefropatie, czy nawet neuropatie [17,26,83]. W cukrzycy typu 1 i 2, zarówno u ludzi [2], jak też u zwierząt doświadczalnych [36,55] zależna od EDHF relaksacja naczyń, głównie mikrokrążenia, jest upośledzona [26]. Taki mechanizm wykazano w wielu różnych łożyskach naczyniowych: naczyniach oporowych prącia człowieka [2] oraz szczurzych tętnicach: krezkowej, szyjnej i tętniczkach nerkowych [30]. Ponadto hiperglikemia zaburza czynność kanałów potasowych, zarówno tych umiejscowionych w śródbłonku, jak i obecnych w miocytach [14,17,86].
W modelu doświadczalnie wywołanej cukrzycy u szczurów, którym podawano streptozotocynę, wykazano, osłabione działanie EDHF, wynikające z zaburzeń komunikacji mio-endotelialnej przy braku zmian w uwalnianiu NO [63]. Podobnie w cukrzycy typu 2 odpowiedź z udziałem EDHF jest zahamowana, co jest konsekwencją zaburzenia funkcjonowania, dystrybucji i wrażliwości kanałów potasowych (Kv, KIR, KATP), [50,55], natomiast nie zauważono zmian w relaksacji naczyń przez NO [26], a nawet zaobserwowano jej nasilenie [55,63,76]. Odmienne wyniki badań uzyskano natomiast u myszy z genetycznie wrodzoną cukrzycą typu 2 (myszy db–/–/db–/–) [64], u których stwierdzono upośledzoną aktywność wazodylatacyjną zależną od tlenku azotu i kompensacyjne zależne od EDHF nasilenie rozkurczu naczyń krezkowych myszy.
PODSUMOWANIE
EDHF wzbudza coraz większe zainteresowanie. Jednak doświadczenia prowadzone na różnych naczyniach krwionośnych, pochodzących od różnych gatunków nie dostarczyły jednoznacznej odpowiedzi na pytanie, czym jest EDHF? Nadal bowiem żadnego z domniemanych czynników hiperpolaryzujących: jonów K+, kwasów epoksyeikozatrienowych, nadtlenku wodoru czy połączeń „gap junction” nie można określić jako „uniwersalnego” EDHF. Wykazano, że czynniki te uczestniczą w odpowiedzi związanej z EDHF, modulują przenoszącą się ze śródbłonka na miocyty hiperpolaryzację, ale nie wiadomo, który z tych czynników działa jako EDHF per se [84].
Odpowiedź hiperpolaryzująca zależna od EDHF ulega pewnym zmianom w stanach patologicznych. Wielu badaczy widzi w tym czynniku punkt uchwytu nowoczesnych leków stosowanych w schorzeniach układu krążenia i cukrzycy. Zwiększenie ekspresji kanałów potasowych oraz ich pobudzenie, a także zwiększenie ekspresji połączeń szczelinowych „gap junction” wydają się najpoważniejszymi celami terapeutycznymi [26].
PIŚMIENNICTWO
[1] Ahluwalia A., Hobbs A.J.: Endothelium-derived C-type natriuretic peptide: more than just a hyperpolarizing factor. Trends Pharmacol. Sci., 2005; 26: 162-167
[PubMed]  
[2] Angulo J., Cuevas P., Fernández A., Gabancho S., Allona A., Martin-Morales A., Moncada I., Videla S., Sáenz de Tejada I.: Diabetes impairs endothelium-dependent relaxation of human penile vascular tissues mediated by NO or EDHF. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003; 312: 1202-1208
[PubMed]  
[3] Archer S.L., Gragasin F.S., Wu X., Wang S., McMurtry S., Kim D.H., Platonov M., Koshal A., Hashimoto K., Campbell W.B., Falck J.R., Michelakis E.D.: Endothelium-derived hyperpolarizing factor in human internal mammary artery is 11,12-epoxyeicosatrienoic acid and causes relaxation by activating smooth muscle BKCa channels. Circulation, 2003; 107: 769-776
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[4] Bény J.L., Chabaud F.: Kinins and endothelium-dependent hyperpolarization in porcine coronary arteries. W: Endothelium-Derived Hyperpolarizing Factor. Red.: Vanhoutte P.M. Harwood Academic Publishers, Amsterdam 1996: 41-49
[5] Bolognesi M., Sacerdoti D., Piva A., Di Pascoli M., Zampieri F., Quarta S., Motterlini R., Angeli P., Merkel C., Gatta A.: Carbon monoxide-mediated activation of large-conductance calcium-activated potassium channels contributes to mesenteric vasodilatation in cirrhotic rats. J. Pharmacol. Exp. Ther., 2007; 321: 187-194
[PubMed]  
[6] Brandes R.P., Behra A., Lebherz C., Böger R.H., Bode-Böger S.M., Phivthong-Ngam L., Mügge A.: NG-nitro-L-arginine- and indomethacin-resistant endothelium-dependent relaxation in the rabbit renal artery: effect of hypercholesterolemia. Atherosclerosis, 1997; 135: 49-55
[PubMed]  
[7] Busse R., Edwards G., Félétou M., Fleming I., Vanhoutte P.M., Weston A.H.: EDHF: bringing the concepts together. Trends Pharmacol. Sci., 2002; 23: 374-380
[PubMed]  
[8] Büssemaker E., Popp R., Binder J., Busse R., Fleming I.: Characterization of the endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF) response in the human interlobar artery. Kidney Int., 2003; 63: 1749-1755
[PubMed]  
[9] Campbell W.B., Gebremedhin D., Pratt P.F., Harder D.R.: Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circ. Res., 1996; 78: 415-423
[PubMed]  [Full Text HTML]  
[10] Chataigneau T., Félétou M., Duhault J., Vanhoutte P.M.: Epoxyeicosatrienoic acids, potassium channel blockers and endothelium-dependent hyperpolarization in the guinea-pig carotid artery. Br. J. Pharmacol., 1998; 123: 574-580
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[11] Chauhan S.D., Nilsson H., Ahluwalia A., Hobbs A.J.: Release of C-type natriuretic peptide accounts for the biological activity of endothelium-derived hyperpolarizing factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003; 100: 1426-1431
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[12] Chen G., Suzuki H.: Some electrical properties of the endothelium-dependent hyperpolarization recorded from rat arterial smooth muscle cells. J. Physiol., 1989; 410: 91-106
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[13] Chrissobolis S., Ziogas J., Chu Y., Faraci F.M., Sobey C.G.: Role of inwardly rectifying K+ channels in K+-induced cerebral vasodilatation in vivo. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 2000; 279: H2704-H2712
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[14] Coleman H.A., Tare M., Parkington H.C.: Endothelial potassium channels, endothelium-dependent hyperpolarization and the regulation of vascular tone in health and disease. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 2004; 31: 641-649
[PubMed]  
[15] Coleman H.A., Tare M., Parkington H.C.: K+ currents underlying the action of endothelium-derived hyperpolarizing factor in guinea-pig, rat and human blood vessels. J. Physiol., 2001; 531: 359-373
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[16] Corriu C., Félétou M., Canet E., Vanhoutte P.M.: Endothelium-derived factors and hyperpolarization of the carotid artery of the guinea-pig. Br. J. Pharmacol., 1996; 119: 959-964
[PubMed]  
[17] De Vriese A.S., Verbeuren T.J., Van de Voorde J., Lameire N.H., Vanhoutte P.M.: Endothelial dysfunction in diabetes. Br. J. Pharmacol., 2000; 130: 963-974
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[18] Ding H., Kubes P., Triggle C.: Potassium- and acetylcholine-induced vasorelaxation in mice lacking endothelial nitric oxide synthase. Br. J. Pharmacol., 2000; 129: 1194-1200
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[19] Ding H., Triggle C.R.: Novel endothelium-derived relaxing factors. Identification of factors and cellular targets. J. Pharmacol. Toxicol. Methods, 2000; 44: 441-452
[PubMed]  
[20] Dong H., Jiang Y., Cole W.C., Triggle C.R.: Comparison of the pharmacological properties of EDHF-mediated vasorelaxation in guinea-pig cerebral and mesenteric resistance vessels. Br. J. Pharmacol., 2000; 1983-1991
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[21] Doughty J.M., Plane F., Langton P.D.: Charybdotoxin and apamin block EDHF in rat mesenteric artery if selectively applied to the endothelium. Am. J. Physiol., 1999; 276: H1107-H1112
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[22] Edwards G., Dora K.A., Gardener M.J., Garland C.J., Weston A.H.: K+ is an endothelium-derived hyperpolarizing factor in rat arteries. Nature, 1998; 396: 269-272
[PubMed]  
[23] Edwards G., Félétou M., Gardener M.J., Thollon C., Vanhoutte P.M., Weston A.H.: Role of gap junctions in the responses to EDHF in rat and guinea-pig small arteries. Br. J. Pharmacol., 1999; 128: 1788-1794
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[24] Edwards G., Weston A.H.: Potassium and potassium clouds in endothelium-dependent hyperpolarizations. Pharmacol. Res., 2004; 49: 535-541
[PubMed]  
[25] Emerson G.G., Segal S.S.: Electrical coupling between endothelial cells and smooth muscle cells in hamster feed arteries: role in vasomotor control. Circ. Res., 2000; 87: 474-479
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[26] Félétou M., Vanhoutte P.M.: EDHF: new therapeutic targets? Pharmacol. Res., 2004; 49: 565-580
[PubMed]  
[27] Félétou M., Vanhoutte P.M.: Endothelium-dependent hyperpolarization of canine coronary smooth muscle. Br. J. Pharmacol., 1988; 93: 515-524
[PubMed]  
[28] Félétou M., Vanhoutte P.M.: Endothelium-derived hyperpolarizing factor: where are we now? Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2006, 26: 1215-1225
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[29] Fisslthaler B., Popp R., Kiss L., Potente M., Harder D.R., Fleming I., Busse R.: Cytochrome P450 2C is an EDHF synthase in coronary arteries. Nature, 1999; 401: 493-497
[PubMed]  
[30] Fitzgerald S.M., Kemp-Harper B.K., Tare M., Parkington H.C.: Role of endothelium-derived hyperpolarizing factor in endothelial dysfunction during diabetes. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 2005; 32: 482-487
[PubMed]  
[31] Fleming I.: Cytochrome P450 2C is an EDHF synthase in coronary arteries. Trends Cardiovasc. Med., 2000; 10: 166-170
[PubMed]  
[32] Fleming I.: Cytochrome P450 epoxygenases as EDHF synthase(s). Pharmacol. Res., 2004; 49: 525-533
[PubMed]  
[33] Fleming I., Michaelis U.R., Bredenkötter D., Fisslthaler B., Dehghani F, Brandes R.P., Busse R.: Endothelium-derived hyperpolarizing factor synthase (cytochrome P450 2C9) is a functionally significant source of reactive oxygen species in coronary arteries. Circ. Res., 2001; 88: 44-51
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[34] Freitas M.R., Schott C., Corriu C., Sassard J., Stoclet J.C., Andriantsitohaina R.: Heterogeneity of endothelium-dependent vasorelaxation in conductance and resistance arteries from Lyon normotensive and hypertensive rats. J. Hypertens., 2003; 21: 1505-1512
[PubMed]  
[35] Fujii K., Tominaga M., Ohmori S., Kobayashi K., Koga T., Takata Y., Fujishima M.: Decreased endothelium-dependent hyperpolarization to acetylcholine in smooth muscle of the mesenteric artery of spontaneously hypertensive rats. Circ. Res., 1992; 70: 660-669
[PubMed]  
[36] Fukao M., Hattori Y., Kanno M., Sakuma I., Kitabatake A.: Alterations in endothelium-dependent hyperpolarization and relaxation in mesenteric arteries from streptozotocin-induced diabetic rats. Br. J. Pharmacol., 1997; 121: 1383-1391
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[37] Fukao M., Hattori Y., Kanno M., Sakuma I., Kitabatake A.: Sources of Ca2+ in relation to generation of acetylcholine-induced endothelium-dependent hyperpolarization in rat mesenteric artery. Br. J. Pharmacol., 1997; 120: 1328-1334
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[38] Fukao M., Hattori Y., Kanno M., Sakuma I., Kitabatake A.: Thapsigargin- and cyclopiazonic acid-induced endothelium-dependent hyperpolarization in rat mesenteric artery. Br. J. Pharmacol., 1995; 115: 987-992
[PubMed]  
[39] Furchgott R.F., Zawadzki J.V.: The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature, 1980; 288: 373-376
[PubMed]  
[40] Goto K., Fujii K., Kansui Y., Iida M.: Changes in endothelium-derived hyperpolarizing factor in hypertension and ageing: response to chronic treatment with renin-angiotensin system inhibitors. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 2004; 31: 650-655
[PubMed]  
[41] Goto K., Rummery N.M., Grayson T.H., Hill C.E.: Attenuation of conducted vasodilatation in rat mesenteric arteries during hypertension: role of inwardly rectifying potassium channels. J. Physiol., 2004; 561: 215-231
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[42] Griffith T.M.: Endothelium-dependent smooth muscle hyperpolarization: do gap junctions provide a unifying hypothesis? Br. J. Pharmacol., 2004; 141: 881-903
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[43] Griffith T.M., Chaytor A.T., Edwards D.H.: The obligatory link: role of gap junctional communication in endothelium-dependent smooth muscle hyperpolarization. Pharmacol. Res., 2004; 49: 551-564
[PubMed]  
[44] Hilgers R.H., Todd J.Jr., Webb R.C.: Regional heterogeneity in acetylcholine-induced relaxation in rat vascular bed: role of calcium-activated K+ channels. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 2006; 291: H216-H222
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[45] Hill C.E., Hickey H., Sandow S.L.: Role of gap junctions in acetylcholine-induced vasodilation of proximal and distal arteries of the rat mesentery. J. Auton. Nerv. Syst., 2000; 81: 122-127
[PubMed]  
[46] Hobbs A., Foster P., Prescott C., Scotland R., Ahluwalia A.: Natriuretic peptide receptor-C regulates coronary blood flow and prevents myocardial ischemia/reperfusion injury: novel cardioprotective role for endothelium-derived C-type natriuretic peptide. Circulation, 2004; 110; 1231-1235
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[47] Illiano S., Nagao T., Vanhoutte P.M.: Calmidazolium, a calmodulin inhibitor, inhibits endothelium-dependent relaxations resistant to nitro-L-arginine in the canine coronary artery. Br. J. Pharmacol., 1992; 107: 387-392
[PubMed]  
[48] Kamei M., Yoneda Y., Suzuki H.: Endothelial factors involved in the bradykinin-induced relaxation of the guinea-pig aorta. J. Smooth Muscle Res., 2000; 36: 127-135
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[49] Kansui Y., Fujii K., Nakamura K., Goto K., Oniki H., Abe I., Shibata Y., Iida M.: Angiotensin II receptor blockade corrects altered expression of gap junctions in vascular endothelial cells from hypertensive rats. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 2004; 287: H216-H224
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[50] Katakam P.V., Ujhelyi M.R., Miller A.W.: EDHF-mediated relaxation is impaired in fructose-fed rats. J. Cardiovasc. Pharmacol., 1999; 34: 461-467
[PubMed]  
[51] Katusic Z.S.: Superoxide anion and endothelial regulation of arterial tone. Free Radic. Biol. Med., 1996; 20: 443-448
[PubMed]  
[52] Long D.A., Mu W., Price K.L., Johnson R.J.: Blood vessels and the aging kidney. Nephron Exp. Nephrol., 2005; 101: e95-e99
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[53] Long D.A., Newaz M.A., Prabhakar S.S., Price K.L., Truong L.D., Feng L., Mu W., Oyekan A.O., Johnson R.J.: Loss of nitric oxide and endothelial-derived hyperpolarizing factor-mediated responses in aging. Kidney Int., 2005; 68: 2154-2163
[PubMed]  
[54] Luksha L., Kublickiene K.: Implications for endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF) in women's cardiovascular health. Curr. Women's Health Rev., 2005; 1: 67-78
[Abstract]  [Full Text PDF]  
[55] Makino A., Ohuchi K., Kamata K.: Mechanisms underlying the attenuation of endothelium-dependent vasodilatation in the mesenteric arterial bed of the streptozotocin-induced diabetic rat. Br. J. Pharmacol., 2000; 130: 549-556
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[56] Matoba T., Shimokawa H., Kubota H., Morikawa K., Fujiki T., Kunihiro I., Mukai Y., Hirakawa Y., Takeshita A.: Hydrogen peroxide is an endothelium-derived hyperpolarizing factor in human mesenteric arteries. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002; 290: 909-913
[PubMed]  
[57] Matoba T., Shimokawa H., Nakashima M., Hirakawa Y., Mukai Y., Hirano K., Kanaide H., Takeshita A.: Hydrogen peroxide is an endothelium-derived hyperpolarizing factor in mice. J. Clin. Invest., 2000; 106: 1521-1530
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[58] McGuire J.J., Ding H., Triggle C.R.: Endothelium-derived relaxing factors: a focus on endothelium-derived hyperpolarizing factor(s). Can. J. Physiol. Pharmacol., 2001; 79: 443-470
[PubMed]  
[59] Mendelsohn M.E.: Genomic and nongenomic effects of estrogen in the vasculature. Am. J. Cardiol., 2002; 90: 3F-6F
[PubMed]  
[60] Mori Y., Ohyanagi M., Koida S., Ueda A., Ishiko K., Iwasaki T.: Effects of endothelium-derived hyperpolarizing factor and nitric oxide on endothelial function in femoral resistance arteries of spontaneously hypertensive rats. Hypertens. Res., 2006; 29: 187-195
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[61] Nagao T., Illiano S., Vanhoutte P.M: Heterogeneous distribution of endothelium-dependent relaxations resistant to NG-nitro-L-arginine in rats. Am. J. Physiol., 1992; 263: H1090-H1094
[PubMed]  
[62] Nilius B., Droogmans G.: Ion channels and their functional role in vascular endothelium. Physiol. Rev., 2001; 81: 1415-1459
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[63] Pannirselvam M., Anderson T.J., Triggle C.R.: Endothelial cell dysfunction in type I and II diabetes: The cellular basis for dysfunction. Drug Dev. Res., 2003; 58: 28-41
[64] Pannirselvam M., Verma S., Anderson T.J., Triggle C.R.: Cellular basis of endothelial dysfunction in small mesenteric arteries from spontaneously diabetic (db/db-/-) mice: role of decreased tetrahydrobiopterin bioavailability. Br. J. Pharmacol., 2002; 136: 255-263
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[65] Parkington H.C., Chow J.A., Evans R.G., Coleman H.A., Tare M.: Role for endothelium-derived hyperpolarizing factor in vascular tone in rat mesenteric and hindlimb circulations in vivo. J. Physiol., 2002; 542: 929-937
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[66] Pascoal I.F., Umans J.G.: Effect of pregnancy on mechanisms of relaxation in human omental microvessels. Hypertension, 1996; 28: 183-187
[PubMed]  [Full Text HTML]  
[67] Pinto A., Abraham N.G., Mullane K.M.: Arachidonic acid-induced endothelial-dependent relaxations of canine coronary arteries:contribution of a cytochrome P-450 dependent pathway. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1987; 240: 856-863
[PubMed]  
[68] Pratt P.F., Hillard C.J., Edgemond W.S., Campbell W.B.: N-arachidonylethanolamide relaxation of bovine coronary artery is not mediated by CB1 cannabinoid receptor. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 1998; 274: H375-H381
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[69] Pratt P.F., Li P., Hillard C.J., Kurian J., Campbell W.B.: Endothelium-independent, ouabain-sensitive relaxation of bovine coronary arteries by EETs. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 2001; 280: H1113-H1121
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[70] Randall M.D., Alexander S.P., Bennett T., Boyd E.A., Fry J.R., Gardiner S.M., Kemp P.A., McCulloch A.I., Kendall D.A.: An endogenous cannabinoid as an endothelium-derived vasorelaxant. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1996; 229:114-120
[PubMed]  
[71] Randall M.D., Kendall D.A.: Involvement of a cannabinoid in endothelium-derived hyperpolarizing factor-mediated coronary vasorelaxation. Eur. J. Pharmacol., 1997; 335: 205-209
[PubMed]  
[72] Roks A.J.: Improvement of endothelium-derived hyperpolarizing factor function by renin-angiotensin system inhibition: paving the way towards prevention of age-related endothelial dysfunction. J. Hypertens., 2002; 20: 363-365
[PubMed]  
[73] Sandow S.L., Tare M.: C-type natriuretic peptide: a new endothelium-derived hyperpolarizing factor? Trends Pharmacol. Sci., 2007; 28: 61-67
[PubMed]  
[74] Scotland R.S., Madhani M., Chauhan S., Moncada S., Andresen J., Nilsson H., Hobbs A.J., Ahluwalia A.: Investigation of vascular responses in endothelial nitric oxide synthase/cyclooxygenase-1 double knockout mice: key role for endothelium-derived hyperpolarizing factor in the regulation of blood pressure in vivo. Circulation, 2005; 111: 796-803
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[75] Shimokawa H., Matoba T.: Hydrogen peroxide as an endothelium-derived hyperpolarizing factor. Pharmacol. Res., 2004; 49: 543-549
[PubMed]  
[76] Sobey C.G.: Potassium channel function in vascular disease. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2001; 21: 28-38
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[77] Taddei S., Versari D., Cipriano A., Ghiadoni L., Galetta F., Franzoni F., Magagna A., Virdis A., Salvetti A.: Identification of a cytochrome P450 2C9-derived endothelium-derived hyperpolarizing factor in essential hypertensive patients. J. Am. Coll. Cardiol., 2006; 48: 508-515
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[78] Tomioka H., Hattori Y., Fukao M., Sato A., Liu M., Sakuma I., Kitabatake A., Kanno M.: Relaxation in different-sized rat blood vessels mediated by endothelium-derived hyperpolarizing factor: importance of processes mediating precontractions. J. Vasc. Res., 1999; 36: 311-320
[PubMed]  
[79] Tomioka H., Hattori Y., Fukao M., Watanabe H., Akaishi Y., Sato A., Kim T.Q., Sakuma I., Kitabatake A., Kanno M.: Role of endothelial Ni2+-sensitive Ca2+ entry pathway in regulation of EDHF in porcine coronary artery. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 2001; 280: H730-H737
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[80] Triggle C.R., Ding H., Anderson T.J., Pannirselvam M.: The endothelium in health and disease: a discussion of the contribution of non-nitric oxide endothelium-derived vasoactive mediators to vascular homeostasis in normal vessels and in type II diabetes. Mol. Cell. Biochem., 2004; 263: 21-27
[PubMed]  
[81] Triggle C.R., Dong H., Waldron G.J., Cole W.C: Endothelium-derived hyperpolarizing factor(s): species and tissue heterogeneity. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 1999; 26: 176-179
[PubMed]  
[82] Urakami-Harasawa L., Shimokawa H., Nakashima M., Egashira K., Takeshita A.: Importance of endothelium-derived hyperpolarizing factor in human arteries. J. Clin. Invest., 1997; 100: 2793-2799
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[83] Vanhoutte P.M.: Endothelium-dependent hyperpolarizations: the history. Pharmacol. Res., 2004; 49: 503-508
[PubMed]  
[84] Vanhoutte P.M., Félétou M.: Conclusion: existence of multiple EDHF(s)? W: Endothelium-Derived Hyperpolarizing Factor. Red. Vanhoutte P.M.: Harwood Academic Publishers, Amsterdam 1996: 303-307
[85] Villar I.C., Francis S., Webb A., Hobbs A.J., Ahluwalia A.: Novel aspects of endothelium-dependent regulation of vascular tone. Kidney Int., 2006; 70: 840-853
[PubMed]  
[86] Wigg S.J., Tare M., Tonta M.A., O'Brien R.C., Meredith I.T., Parkington H.C.: Comparison of effects of diabetes mellitus on an EDHF-dependent and an EDHF-independent artery. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 2001; 281: H232-H240
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[87] Woodman O.L.: Pharmacological approaches to preserving and restoring coronary endothelial function. Expert Opin. Pharmacother., 2001; 2: 1765-1775
[PubMed]  
[88] Yamamoto Y., Imaeda K., Suzuki H.: Endothelium-dependent hyperpolarization and intercellular electrical coupling in guinea-pig mesenteric arterioles. J. Physiol., 1999; 514: 505-513
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[89] Yamanaka A., Ishikawa T., Goto K.: Characterization of endothelium-dependent relaxation independent of NO and prostaglandins in guinea-pig coronary artery. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1998; 285: 480-489
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[90] Zakhary R., Gaine S.P., Dinerman J.L., Ruat M., Flavahan N.A., Snyder S.H.: Heme oxygenase 2: endothelial and neuronal localization and role in endothelium-dependent relaxation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996; 93: 795-798
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[91] Zygmunt P.M., Sorgard M., Petersson J., Johansson R., Högestätt E.D.: Differential actions of anandamide, potassium ions and endothelium-derived hyperpolarizing factor in guinea-pig basilar artery. Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol., 2000; 361: 535-542
[PubMed]