Postepy Hig Med Dosw. (online), 2007; 61: 519-533
Review


Profile ekspresji genów w ostrej białaczce limfoblastycznej u dzieci i dorosłych
Gene expression profiles in acute lymphoblastic leukemia in children and adults
Joanna Szczepanek1,2  , Jan Styczyński1  , Olga Haus3,4  , Andrzej Tretyn2  , Mariusz Wysocki1  
1Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii, Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, Uniwersytet im. Mikołaja Kopernika
2Zakład Biotechnologii, Instytut Biologii Ogólnej i Molekularnej Uniwersytet im. Mikołaja Kopernika w Toruniu
3Katedra i Zakład Genetyki Klinicznej, Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, Uniwersytet im. Mikołaja Kopernika
4Katedra i Klinika Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku, Akademia Medyczna we Wrocławiu
Adres do korespondencji
dr hab. n. med. Jan Styczyński, Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy, Uniwersytet im. Mikołaja Kopernika, ul. Curie- -Skłodowskiej 9, 85-094 Bydgoszcz; e-mail: jstyczynski@cm.umk.pl

Źródło finansowania
Praca finansowana ze środków na naukę MNiSW w latach 2007–2010, jako projekt badawczy nr N407 078 32/2964.

Otrzymano:  2007.06.12
Zaakceptowano:  2007.08.29
Opublikowano:  2007.10.02

Streszczenie
Ostre białaczki limfoblastyczne (acute lymphoblastic leukemia – ALL) stanowią heterogenną grupę chorób układu białokrwinkowego. Określono dla nich wiele czynników biologicznych i klinicznych o znaczeniu prognostycznym, jednak dotychczasowa stratyfikacja pacjentów jest nadal niewystarczająca. Wciąż istnieje potrzeba dokładniejszego poznania i zrozumienia biologii ALL, a tym samym reklasyfikacji, rozwoju nowych terapii opartych o precyzyjne przyporządkowanie pacjentów do grup ryzyka. Opracowana i rozwijana w ostatnich dwóch dekadach technika mikromacierzy budzi coraz większe nadzieje na zrewolucjonizowanie badań klinicznych chorób nowotworowych. Jej ogromny potencjał wynika z możliwości analizy setek sekwencji genowych w jednym eksperymencie. Tworzone na podstawie kompleksowych danych profile ekspresji genów mogą mieć zastosowanie w wielu aspektach analizy ostrych białaczek limfoblastycznych. Badania wzorców ekspresji genów u pacjentów z ALL dostarczają nowych informacji o biologii poszczególnych podgrup białaczek. Dzięki tej metodzie można dokładniej ocenić ryzyko wśród pacjentów z ALL we wszystkich grupach wiekowych; możliwe jest poszukiwanie nowych markerów o znaczeniu diagnostycznym oraz prognostycznym, a także przydatnych w reklasyfikacji, można również odkrywać nowe cząsteczki docelowe dla zindywidualizowanej terapii. Do 2007 r. opublikowano dużą liczbę prac dotyczących wykorzystania technologii macierzy ekspresyjnych w badaniach nowotworów hematologicznych. W prezentowanej pracy przedstawiono obecny poziom wiedzy dotyczącej profili ekspresji genów w ostrych białaczkach limfoblastycznych u dzieci oraz u dorosłych.
Słowa kluczowe: ostra białaczka limfoblastyczna • mikromacierz • profile ekspresji genów • lekooporność


Summary
Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is a heterogeneous group of white blood cell malignancies. Though a number of clinical and biological prognostic factors have been determined, the current patient stratification in this disease is still not satisfactory. Better knowledge and understanding of the biology of ALL is necessary for re-classification and risk-adapted therapy. Microarray technology, developed over last two decades, provides a potential for revolutionary changes in the diagnosis and monitoring of malignant diseases. Hundreds of genomic sequences can be analyzed in a single microarray experiment. A large amount of data have been obtained by microarray technology in hematological malignancies. Gene expression profiles based on this technology are currently being extensively studied in patients with ALL, and new data are being obtained in specific subgroups of patients. New markers based on gene expression might be identified and used to stratify patients and to individualize therapy. As the biology of ALL differs with respect to age, microarray technology can improve the determination of risk factors in each age group. This review presents the current status of knowledge on gene expression profiles in ALL in children and adults.
Key words: acute lymphoblastic leukemia • microarray • gene expression profile • drug resistance




WPROWADZENIE
Znaczący postęp genetyki molekularnej, związany z ukończeniem projektu sekwencjonowania ludzkiego genomu (Human Genome Project), umożliwia prowadzanie kompleksowych analiz funkcji różnych genów człowieka, zwłaszcza pod kątem ich udziału w procesach chorobowych [5,19,24]. Zrewolucjonizował również charakterystykę ostrych białaczek [12,42]. Główną techniką służącą analizie profili genetycznych stały się tzw. mikromacierze [5,39]. Odróżnienie poszczególnych typów nowotworów jest możliwe obecnie nie tylko na podstawie ich cech ogólnych, takich jak np. morfologia, cechy biochemiczne, zmiany w strukturze (translokacje, delecje) i liczbie (hipoi hiperdiploidia) chromosomów, ale również poprzez określanie molekularnych mechanizmów patofizjologicznych, identyfikację genów zaangażowanych w procesy leukemogenezy [3,42]. Profilowanie ekspresji w obrębie całego genomu nie tylko stwarza możliwość zastąpienia pracochłonnych i często niewygodnych technik klasycznych, ale umożliwia uzyskanie dodatkowych informacji, które pozwolą zanalizować szczegółowo i poprawić protokoły leczenia w stosunku do oceny ryzyka [42]. Analiza profilu aktywności genów może dostarczyć znacznie więcej użytecznych informacji niż klasyczne metody badań komórek nowotworowych.
Ostra białaczka limfoblastyczna u dzieci i dorosłych
Ostre białaczki limfoblastyczne (acute lymphoblastic leukemia – ALL) stanowią heterogenną grupę chorób nowotworowych, występujących u dzieci i dorosłych, przy czym częstość zachorowań maleje wraz z wiekiem [37,54,62]. Cechują się występowaniem niedojrzałych komórek limfoidalnych w szpiku kostnym, krwi oraz tworzących nacieki w różnych organach [18,21,35]. ALL występują głównie u dzieci i stanowią 80% wszystkich białaczek w tej grupie wiekowej. U dorosłych ALL stanowią 20% wszystkich ostrych białaczek, zaś ich występowanie obserwuje się przeważnie przed 30 rokiem życia [35]. U dzieci ostra białaczka limfoblastyczna cechuje się większą podatnością na leczenie niż u dorosłych. Za różnice biologiczne i kliniczne mogą być odpowiedzialne odrębne zmiany genetyczne występujące w limfoblastach [22].
Ostrą białaczkę limfoblastyczną charakteryzują liczne zaburzenia genetyczne, które definiują jej poszczególne podtypy, różniące się od siebie pod względem cytomorfologii, immunofenotypu oraz aberracji chromosomowych i genowych, a także odpowiedzi na terapię oraz ryzykiem nawrotu [29,37,43,48,62]. Na podstawie charakterystyki immunofenotypowej wyróżnia się B-prekursorową ALL oraz ostrą białaczkę limfoblastyczną z linii komórek T (T-ALL). W ALL linii B-komórkowej często stwierdza się występowanie kilku podklas genetycznych takich jak: z występowaniem hiperdiploidii >50 chromosomów, t(12;21)(TEL-AML1 ), z obecnością rearanżacji MLL, t(1;19)(E2A-PBX1), t(9;22)(BCR-ABL) [21,43,48,62]. Częstości poszczególnych podtypów ALL są odmienne w różnych grupach wiekowych [9,43,45,54]. Dotychczas zidentyfikowano wiele aberracji i fuzji genowych charakterystycznych dla tego typu nowotworów, zaś liczne prowadzone badania koncentrują się na analizie transkryptomu blastów białaczkowych i możliwościach opracowania profili genetycznych, użytecznych klinicznie [12,16].
Ze względu na łatwość pozyskiwania próbek do analizy oraz izolacji homogennej puli komórek z krwi obwodowej czy szpiku kostnego w nowotworach hematologicznych, pierwsze badania ekspresji z wykorzystaniem technologii mikromacierzy dla tkanek nowotworowych, przeprowadzano w białaczkach [16,39].
Technika macierzy ekspresyjnych: budowa i założenia metody
Technika macierzy DNA (biochipów) należy do najszerzej stosowanych w badaniach molekularnych metod transkryptomiki. Macierze DNA to zminiaturyzowany układ hybrydyzacyjny, na który składają się uporządkowane zestawy genów lub częściej ich fragmentów (tzw. sond molekularnych) w postaci oligonukleotydów lub sekwencji cDNA, unieruchomione na stałym podłożu (szkiełko podstawowe, nylonowa, nitrocelulozowa lub plastikowa membrana, krzemowa płytka) w ściśle określonym porządku [19,24,52,56]. Typową mikromacierz stanowi prostokątna płytka, o powierzchni od jednego do kilkudziesięciu cm2 [16], na której unieruchomionych jest obok siebie 200–500 tys. sond molekularnych (tabela 1) [5]. Poprzez numer kolumny i wiersza są definiowane pozycje genów.
Tabela 1. Charakterystyka głównych typów macierzy genowych (opracowanie własne)

Ze względu na różnice w kilku parametrach (tabela 1) macierze ekspresyjne klasyfikuje się jako makromacierze, mikromacierze, macierze oligonukleotydowe o dużej gęstości (GeneChips) oraz macierze mikroelektroniczne [1,56].
We wszystkich odmianach tej technologii wyróżnić można kilka wspólnych etapów [8,16,56]. Przeprowadzenie analizy ekspresji genów wymaga przede wszystkim wyizolowania puli całkowitego RNA lub mRNA wysokiej jakości, zarówno z materiału badanego jak i referencyjnego. Materiał genetyczny jest następnie wykorzystywany do syntezy znakowanego (najczęściej barwnikami fluorescencyjnymi) cDNA lub cRNA, który w kolejnym etapie poddaje się reakcji hybrydyzacji z sondami na wybranym typie macierzy [46,47,52]. Pomiar intensywności sygnału zhybrydyzowanych prób jest wykonywany z zastosowaniem odpowiednich detektorów (np. laser w przypadku znaczników fluorescencyjnych) [24,46]. Intensywność sygnału jest następnie korelowana z wyjściowym stężeniem mRNA w analizowanym materiale, co pozwala na porównawczą ocenę genów ulegających nadekspresji lub wyciszaniu, pozostających na niezmienionym poziomie, czy też nieobecnych (ryc. 1) [5,19,24,56].
Ryc. 1. Schemat przebiegu doświadczenia analizy ekspresji genów na przykładzie macierzy oligonukleotydowej (na podstawie GeneChip® Expression Analysis Technical Manual firmy Affymetrix, zmodyfikowane)

Dzięki mikromacierzom możliwe jest ocenienie ekspresji tysięcy genów w sposób jakościowy jak i półilościowy [24,25]. Technika ta wyróżnia się bardzo wysoką czułością: dzięki niej można wykryć obecności 1 kopii mRNA na komórkę. Do przeprowadzenia analizy wymagana jest stosunkowo niewielka ilość RNA (0,1–40 µg) [5,16,19].
W szerokogenomowych analizach ekspresji genów najczęściej wykorzystuje się macierze cDNA oraz macierze oligonukleotydowe [42,56]. Skonstruowano również mikromacierz przeznaczoną do analizy prawidłowych i chorobowych stanów układu immunologicznego, tzw. lymphochip. Chip ten zawiera 15 tysięcy sond (klonów cDNA z biblioteki ludzkich komórek immunologicznych), odpowiadających 3000 genów o dobrze znanej funkcji [52]. Po zakończeniu sekwencjonowania genomu ludzkiego opracowano macierz wysokiej gęstości HGU-133 Set firmy Affymetrix, zawierająca całą znaną sekwencję człowieka. Obecnie z jej użyciem prowadzona jest większość badań dotyczących ekspresji genów w ostrych białaczkach oraz innych chorobach nowotworowych. Golub i wsp. [28] jako pierwsi wprowadzili technikę mikromacierzy do badań ostrych białaczek limfoblastycznych.
Zastosowanie techniki mikromacierzy w charakterystyce chorób nowotworowych
Technika wykorzystywana jest przede wszystkim w określaniu profilu ekspresji genów, czyli analiz transkryptomu (puli cząsteczek RNA) [8]. Profilem ekspresji określa się zestaw kompleksowych danych otrzymanych tą metodą. Wzór ekspresji opracowany dla ograniczonej grupy genów stanowi podpis/sygnaturę molekularną. Klasyfikatory molekularne to dane służące klasyfikacji tkanek.
Biochipy są coraz powszechniej stosowane w badaniach naukowych, mających na celu poznanie biologii nowotworów, poszukiwanie nowych biomarkerów wczesnych stadiów rozwoju choroby, molekularne klasyfikowanie nowotworów oraz postawienie odpowiednio wczesnej i prawidłowej diagnozy. Określanie najbardziej charakterystycznych elementów profilu i korelowanie ich z rokowaniami ma szanse na zrewolucjonizowanie właściwego doboru leczenia, jak również poznawania czynników wpływających na przebieg choroby i stosowanej terapii, ocenę prawdopodobieństwa wystąpienia przerzutów czy nawrotów [8,16,19,24,25,46,52,56,61]. Możliwości, jakie daje technika mikromacierzy, budzą nadzieje przede wszystkim na lepsze poznanie i zrozumienie patogenezy ostrych białaczek. Dzięki identyfikacji nowych szlaków metabolicznych zaangażowanych w proces leukemogenezy oraz leżących u podstaw zjawiska oporności na chemioterapię być może w przyszłości stanie się możliwe opracowanie potencjalnych dróg nowoczesnej, zindywidualizowanej terapii [12,42,45,61].
ZASTOSOWANIE TECHNIKI CHIPÓW GENOWYCH W KLASYFIKACJI TYPÓW BIAŁACZEK
Klasyfikacja nowotworów odgrywa ważną rolę we współczesnej onkologii [63]. Od 10 lat technikę tę często wykorzystuje się w badaniach nowotworów hematologicznych (tabela 3) [28,53]. Bardzo duże znaczenie w leczeniu ostrych białaczek ma zaliczenie pacjentów do właściwych grup ryzyka, co umożliwia zarówno maksymalizację efektywności terapii jak i minimalizację jej toksyczności [28,48,57]. Obecnie dokładna stratyfikacja pacjentów do odpowiednich podklas genetycznych, a zatem i grup ryzyka jest wciąż pracochłonnym i kosztownym procesem diagnostycznym, obejmującym kompleksowe analizy morfologii, immunofenotypu, cytogenetyki, odpowiedzi na terapię indukcyjną oraz badania genetyczne [25,30,35,60,62]. Obecnie w ostrej białaczce limfoblastycznej możliwe jest przeprowadzenie kilku rodzajów klasyfikacji. Główne z nich to:
(a) klasyfikacja morfologiczna FAB, wyróżniająca trzy podtypy ALL (L1-L3);
(b) klasyfikacja cytochemiczna;
(c) klasyfikacja immunologiczna, obejmująca 7 podtypów ALL;
(d) klasyfikacja cytogenetyczna oraz
(e) klasyfikacja molekularna.
Taka klasyfikacja jest nadal niezadowalająca, gdyż do większości wznów dochodzi w grupie pośredniego i standardowego ryzyka [12,41]. Profilowanie ekspresji genów umożliwia precyzyjną klasyfikację znanych podtypów ostrych białaczek, stąd też pierwsze analizy transkryptomu w ostrych białaczkach miały na celu ich reklasyfikację [42]. Molekularna klasyfikacja w oparciu o metodę profilowania ekspresji genów pozwala na określenie profilu genetycznego nowotworów mieloidalnych i limfoidalnych, B-liniowej i T-liniowej ALL, jak również wyszczególnienie podklas w obrębie podtypów białaczek [4,10,15,26,48,58,62]. Na podstawie analiz mikromacierzowych, wykazano korelację między immunofenotypem i zaburzeniami chromosomowymi a różnymi wzorcami ekspresji genów we wszystkich podtypach ostrych białaczek [37].
Różnice w profilu genetycznym między ostrą białaczką limfoblastyczną a mieloblastyczną
Golub i wsp. [28] wprowadzili do klasyfikacji chorób nowotworowych koncepcję „odkrywania klas” (class discovery), to jest identyfikacji wcześniej nieznanych podtypów nowotworów oraz „przewidywania klas” (class prediction); określania przynależności nowotworów do określonych, dobrze zdefiniowanych klas w oparciu o profil ekspresji [28]. Na podstawie tych badań wykazano, iż możliwe jest molekularne klasyfikowanie poszczególnych przypadków choroby bez konieczności znajomości a priori danej podklasy, a nawet odkrywanie nowych klas i podtypów białaczek o znaczeniu biologicznym jak i klinicznym [16,28]. Zróżnicowanie ostrej białaczki szpikowej i ostrej białaczki limfoblastycznej jest możliwe w odniesieniu do danych dotyczących profilu zaledwie kilkudziesięciu genów. Zidentyfikowano 50 genów (w tym CD11c, CD33, MB-1, Op18, MCM3, RbAp48, SNF2, TF2Eb, c-MYB, E2A, HOXA9, gen receptora leptyn), ulegających wyraźnie różnej ekspresji u pacjentów z AML i ALL. Odróżnienie tych dwu podklas ostrych białaczek można wykonać na podstawie jednego badania. Badacze ci podkreślili, iż tak szczegółowe dane stanowią nie tylko wygodne narzędzie klasyfikacji linii komórek hematopoetycznych, ale również dostarczają nowego spojrzenia na patogenezę oraz farmakologię ostrych białaczek. Armstrong i wsp. [4] przeanalizowali przypadki ostrych białaczek z obecnością i bez rearanżacji MLL. Translokacja między chromosomem 4 a 11, angażująca locus genu MLL od regionu 11q23, skutkuje koekspresją markerów, które towarzyszą zarówno ALL, jak i AML, utrudniając tym samym precyzyjną diagnozę. Wykazano, iż przypadki z rearanżacją MLL znacznie różnią się wzorem ekspresji od podtypów ALL i AML. Grupowanie w oparciu o profil ekspresji ujawniło, iż możliwe jest (z 95% dokładnością) odróżnienie MLL (mixed-lineage leukemia – MLL) od pozostałych typów ostrej białaczki [4]. Stwierdzono, że około 1000 genów jest nieaktywnych albo bardzo słabo aktywnych w komórkach MLL w porównaniu z ALL. Natomiast prawie 200 genów wykazuje nadmierną ekspresję. Zaobserwowane różnice dotyczyły przede wszystkim nadekspresji genów zaangażowanych w nowotworową transformację komórek szpiku: HOXA9 i PRG1 oraz powodujących zatrzymanie dojrzewania komórek we wczesnym stadium [4].
Zróżnicowane profile ekspresji genów między T-ALL i B-prekursorową ALL
Chiaretti i wsp. [15] wykazali, iż między 2 liniami komórkowymi limfoblastów istnieją znaczące różnice w ekspresji 792 genów. T-komórkowa ALL charakteryzowała się przede wszystkim homogennością ekspresji antygenów CD3d i CD3z. Natomiast B-liniowa ALL cechuje się zmianami w ekspresji takich genów jak: MHC klasy II, CD19, immunoglobulin, przy czym stwierdzono heterogenność tego typu ostrej białaczki [15]. Willenbrock i wsp. [60] wytypowali jako element różnicujący 29 genów, za pomocą których ze znaczną dokładnością, wyodrębnili podtypy dziecięcej ALL zgodnie z immunofenotypem (pre-B, T-ALL). Dla dziewięciu genów stwierdzono zgodność danych o ekspresji z uprzednio otrzymanymi przez Ross i wsp. [48]. Ponadto wykazano, iż profil ekspresji genów, jest wysoce swoisty nawet w próbkach szpiku kostnego mających niski odsetek komórek białaczkowych [60]. Cecha ta niewątpliwie może usprawnić immunofenotypowanie ostrych białaczek. Holleman i wsp. [34] wykazali, iż pomiędzy Ti B-liniową ALL istnieją wyraźne różnice w ekspresji 44 z 70 analizowanych genów apoptotycznych.
Próby porównawczej analizy przeprowadzone na liniach komórkowych przez Andersson i wsp. [2], pozwoliły na określenie różnic pomiędzy AML a ALL oraz pomiędzy ostrą białaczką limfoblastyczną B- a T-liniową. W pierwszym przypadku zmiany dotyczyły 367 genów, w drugim 88 genów. W przypadku AML najsilniejszą ekspresję odnotowano dla takich genów jak: CEBPA, MEIS2, zaś w ALL dla: CBFB, LEF1. Komórki linii B cechowały się przede wszystkim podwyższonym poziomem transkryptów PAX5, w porównaniu z komórkami T, w których nadekspresję odnotowano dla GATA3 oraz CD3G. Wykazano, że w komórkach hematopoetycznych program transkrypcyjny jest stabilny, gdyż w oparciu o profile ekspresji linie komórkowe klasyfikowano zgodnie z podtypem klinicznym oraz obecnością pierwotnych aberracji genetycznych komórek. Zarówno w badaniach Andersson i wsp. [2] jak i Fine’a i wsp. [27] w większości przypadków wzorzec ekspresji genów w komórkach pochodzących z hodowli oraz pobranych bezpośrednio od pacjentów również był zgodny.
Klasyfikacja znanych podtypów ostrych białaczek limfoblastycznych w oparciu o profile ekspresji genów
Jak wskazują badania przeprowadzone przez Yeoh i wsp. [62], na 360 przypadkach dziecięcej ALL, każdy z 6 głównych podtypów ALL ma odmienny, charakterystyczny profil ekspresji. Większość różnic dotyczyła zaburzeń onkogenetycznych, a nie immunofenotypowego stadium dojrzewania blastów. Wyodrębniono jednak 14 przypadków ALL bez aberracji cytogenetycznych, które charakteryzowały się zdecydowanie odmiennym, unikalnym wzorcem ekspresji genów. W grupie tej obserwowano przede wszystkim nadekspresję genów: PTPRM i LHFPL2. U pacjentów z hiperdiploidią 70% genów jest umiejscowionych na chromosomach 21 i X, których trisomie są w HD >50 najczęstsze. Nadekspresja genów na chromosomie X występowała niezależnie od trisomii tego chromosomu. Yeoh i wsp. [62] wykazali, że dzięki zastosowaniu odpowiedniego algorytmu analizy danych o ekspresji zaledwie jednego genu możliwe jest sklasyfikowanie T-ALL (CD3D) albo np. E2APBX1 ALL (PBX1), zaś w innych podgrupach wymagane jest oszacowanie ekspresji 7-20 genów. Yeoh i wsp. [62] uzyskali również korelację poziomu ekspresji dla 5 wybranych genów techniką mikromacierzy z analizami metodą Q-PCR oraz ekspresją odpowiedniego białka określonego metodą cytometrii przepływowej. Dokładność identyfikacji dobrze znanych podtypów ALL w pojedynczym doświadczeniu sięga 96% (tabela 2) [16,40]. Co więcej, tego rodzaju klasyfikację cechuje większa dokładność od obecnie stosowanych metod konwencjonalnych. Na przykład u 4 na 327 diagnozowanych pacjentów stwierdzono obecność rearanżacji TEL-AML1, której nie wykryto w standardowej analizie [62].
Tabela 2. Dokładność przewidywania klas na przykładzie analiz różnymi typami macierzy ekspresyjnych (na podstawie [40], zmodyfikowane)

Profile genetyczne analizowanych podtypów genetycznych ALL nie odzwierciedlają jednak stadium różnicowania blastów. Nie udało się również opracować wzorca ekspresji genów korelującego z immunofenotypowym stadium zróżnicowania B-prekursorowej ALL.
Późniejsze badanie tej samej grupy badaczy, ale na bardziej zaawansowanym technicznie chipie, zawierającym liczniejszy zestaw genów (HGU-133 Set) nie tylko potwierdziły istnienie różnic pomiędzy 6 analizowanymi podklasami ostrych białaczek, ale pozwoliły również na wyodrębnienie nowej, nieznanej dotąd podgrupy białaczek w linii B-komórkowej [48]. W obrębie znanych podtypów genetycznych stworzono profile charakteryzujące każdy z nich. Dla poszczególnych klas liczba genów różnicujących wyniosła odpowiednio: T-ALL – 2063; E2A-PBX1 – 1059; TEL-AML1 – 805; BCR-ABL – 201; MLL – 726; hiperdiploidia >50 chromosomów – 994 [48]. Widoczne rozbieżności w liczbie genów danego profilu sugerują znaczące różnice w globalnych profilach ekspresji genów białaczek, prawdopodobnie zależnych od swoistych zaburzeń genetycznych, biorących udział w inicjacji procesu leukemogenezy. Kohlemann i wsp. [37] porównali wyniki swoich badań dorosłych pacjentów z wzorami ekspresji genów u dzieci [62] i stwierdzili, iż za pomocą wzorców genetycznych, opracowanych dla dziecięcej ALL, można różnicować również podtypy białaczek u dorosłych.
Chiaretti i wsp. [14], na podstawie analizy ekspresji 131 genów, sklasyfikowali przypadki T-ALL u dorosłych w 2 grupach. Pierwsza z nich objęła mniej zróżnicowane postaci pre-T-ALL, w drugiej zaś sklasyfikowano białaczki z fenotypem limfocytów T w późnych stadiach dojrzewania. Późniejsze badania tej samej grupy badaczy doprowadziły do opracowania profilu genetycznego dla podgrup ALL u dorosłych [15]. Dla MLL-AF4 wyselekcjonowano grupę 50 genów. W przypadku rearanżacji E2A-PBX1 zaobserwowano nadekspresję 35 genów, najsilniejszą PBX1, FAT, NID2, KANK oraz genów kinaz PRKCZ, BLK, MERTK. Wzorzec ekspresji dla podtypu BCR-ABL charakteryzował się znaczną heterogennością i obejmował prawie 70 genów. Różnice dotyczyły przede wszystkim genów kinaz tyrozynowych (ABL, FYN, YES1) oraz genów związanych z przebiegiem cyklu komórkowego (CCDN2, E2F2). Wyniki otrzymane przez dwie grupy badawcze dla B-prekursorowej ALL z rearanżacjami E2A-PBX1 oraz MLL-AF4, są zbieżne u dzieci i u dorosłych [15,62].
Odróżnienie poszczególnych podtypów ALL jest możliwe również w odniesieniu do danych o ekspresji ograniczonego zestawu genów. Holleman i wsp. [34] w analizach zawężonych do grupy 70 genów apoptotycznych wykazali, iż pomiędzy ALL o fenotypie hiperdiploidalnym istnieją różnice w poziomie ekspresji 22 genów w stosunku do prawidłowego kariotypu. Natomiast rearanżacji TEL-AML1 towarzyszą zmiany w poziomie transkryptów 16 genów, zaś komórki, w których występowała rearanżacja E2A-PBX1 wykazywały różnice ekspresji dla 13 genów. Co więcej wyniki badania ekspresji wielu genów, były zgodne z prezentowanymi przez Armstronga i wsp. [4], Ross i wsp. [48] oraz Yeoha i wsp. [62].
Kees i wsp. [36] oraz Fine i wsp. [27] wykazali, iż podobny profil genetyczny, związany z występowaniem translokacji TEL-AML1, BCR-ABL lub MLL, charakteryzuje zarówno linie komórkowe jak i limfoblasty pacjentów. Wyniki ekspresji dla wielu genów były zgodne z wcześniejszymi pracami [4,48,62]. Wykazano również, iż dla translokacji BCR/ABL można określić jedynie heterogenny wzór ekspresji [27].
Wykorzystanie analizy ekspresji genów w poszczególnych grupach białaczek z różnymi aberracjami chromosomowymi, potwierdziło wcześniejsze przypuszczenia, iż specyficzne zaburzenia charakteryzują poszczególne podklasy w obrębie omawianej grupy nowotworów [3]. Wzorce ekspresji genów, w porównaniu z analizą obecności charakterystycznych aberracji genetycznych, umożliwiają bardziej precyzyjną stratyfikację pacjentów (tabela 2) [62].
Identyfikacja nowych genów zaangażowanych w leukemogenezę
Technologia mikromacierzy DNA umożliwia identyfikację nowych genów o znaczeniu prognostycznym, biorących udział w powstawaniu nowotworów [45,61,62]. De Pitta i wsp. [20] stosując mikromacierze cDNA wytypowali 2 nowe geny, tj. EMCN i USP33, ulegające podwyższonej ekspresji w Bprekursorowej ALL w porównaniu z T-ALL. Również Yeoh i wsp. [62], stwierdzili, że rearanżacji E2A-PBX1 towarzyszy nadekspresja receptora kinazy tyrozynowej MERTK, natomiast rearanżację MLL charakteryzuje wysoki poziom HOXA9 oraz MEIS1. Z kolei podwyższona ekspresja MTG16 występuje w przypadkach TEL-AML1. Golub i wsp. [28] zaobserwowali zmiany w ekspresji 2 genów (dla zyksyny oraz receptora leptyny), których fizjologiczna rola w komórkach hematopoetycznych była dotychczas nieznana. Fine i wsp. [27] zidentyfikowali kilka genów korelujących z występowaniem określonych translokacji, którym nie przypisywano roli w patofizjologii ALL. Jako przykład podali EPOR (gen receptora erytropoetyny), którego nadekspresja towarzyszyła TEL-AML1. W badaniach Holleman i wsp. [33] wśród 124 analizowanych pod kątem mechanizmu lekooporności genów o zróżnicowanej ekspresji, aż 121 nie było dotychczas wiązanych z występowaniem tego zjawiska. Song i wsp. [50], na podstawie analizy transkryptomu komórek białaczkowych, wytypowali 32 geny, za pomocą których można klasyfikować białaczki jako ostre lub przewlekłe. Spośród nich 22 geny nie były dotychczas wiązane z udziałem w rozwoju choroby białaczkowej.
WYKORZYSTANIE PROFILOWANIA GENETYCZNEGO W IDENTYFIKACJI CZYNNIKÓW PROGNOSTYCZNYCH BIAŁACZEK
Nowotwór jest heterogenną chorobą, stąd też obserwuje się różne wyniki leczenia u pacjentów ze zbliżonym rozpoznaniem histopatologicznym, stadium rozwoju i przy zastosowaniu podobnego protokołu leczenia. Stąd ogromne znaczenie prawidłowej stratyfikacji pacjentów do grup wysokiego ryzyka wystąpienia nawrotu choroby (zastosowanie intensywniejszego leczenia) oraz pacjentów niskiego ryzyka (uniknięcie toksyczności terapii) [6,16,53]. Dotychczasowa stratyfikacja nie spełnia wyżej wspomnianych oczekiwań, dlatego duże nadzieje pokłada się w możliwościach badań metodami genomiki i transkryptomiki [10,16,58].
Zasadniczo dotychczasowa stratyfikacja opiera się o czynniki prognostyczne, takie jak wiek pacjenta czy początkowa leukocytoza. Ze względu na to, iż jest ona niewystarczająca proponuje się zastąpienie jej stratyfikacją opartą na profilu cytogenetycznym i białkowym (microarray i protein array).
Ocena ryzyka w ALL opiera się na charakterystyce klinicznej, wynikach badań laboratoryjnych oraz na specyfikacji blastów białaczkowych [32,38,48]. Za najważniejsze czynniki prognostyczne są uważane obecnie odpowiedź kliniczna na 7-dniową monoterapię prednizolonem, profil oporności in vitro na cytostatyki, obecność minimalnej choroby resztkowej oraz występowanie rearanżacji BCR-ABL [44,55,62]. Wiele uwagi poświęca się możliwości wykorzystania profilu ekspresji jako wskaźnika prognozy [42]. Niektórzy badacze pozostają sceptyczni wobec tych analiz i nie uznają profilu ekspresji jako czynnika prognostycznego [42].
Badania ekspresji genów mogą być również stosowane do identyfikacji pacjentów obarczonych zwiększonym ryzykiem wtórnych nowotworów, co wykazano w przypadku pacjentów, u których po leczeniu ALL rozpoznano wtórne guzy mózgu [23]. Na podstawie wyodrębnionych genetycznych podklas ostrych białaczek możliwe jest wyróżnienie genotypów prognostycznie korzystnych i niekorzystnych [58]. Valk i wsp. [58] wykazali istnienie 16 grup ekspresyjnych, wśród 285 przypadków AML. Część z nich korelowała ze zdefiniowanymi podgrupami cytogenetyczni oraz grupami klasyfikacji FAB. Ujawniono również istnienie kilku nowych grup [58]. Bullinger i wsp. [10] przeanalizowali poziom ekspresji w 116 przypadkach AML u dorosłych i na jego podstawie stworzyli model 133 genów dokładnie charakteryzujący długość przeżycia.
Chiaretti i wsp. [14], dzięki analizie profilu ekspresji w T-ALL u dorosłych, opracowali jednolity wzór ekspresji dla komórek opornych, charakteryzujący się nadekspresją zaledwie jednego genu, tj. interleukiny 8 (IL-8) oraz wyciszaniem ekspresji genów kodujących białka histonowe (H1F0, H2AFL) oraz genów, których białkowe produkty biorą udział w adhezji komórkowej (CR2, SELL) i progresji cyklu komórkowego (GFI1, BCL6). Natomiast obecność w komórkach białaczkowych grupy 30 genów o znaczącej nadekspresji koreluje z uzyskaniem całkowitej remisji przez pacjentów dorosłych. Niemniej jednak nie udało się stworzyć wyraźnego wzorca ekspresji dla komórek wrażliwych na chemioterapię. Ta sama grupa badawcza w oparciu o otrzymane dane z eksperymentu mikromacierzowego opracowała 3-genowy model (AHNAK, CD2, TTK), na podstawie którego była w stanie przyporządkowywać pacjentów do grup dobrego i złego rokowania. Model ten pozwolił na dokładniejszą ocenę ryzyka niż standardowo stosowane parametry [14]. Dane otrzymane za pomocą mikromacierzy zostały dodatkowo potwierdzone za pomocą reakcji ilościowego PCR (Q-PCR). Wykazano, że na podstawie olbrzymiej ilości złożonych danych o ekspresji można wyselekcjonować niewielką liczbę genów, związanych z niepowodzeniem terapii u danego pacjenta. Późniejsze analizy tej grupy badawczej doprowadziły do wyselekcjonowania kilku grup genów związanych z możliwością wystąpienia nawrotu choroby. Do najważniejszych genów należały: odpowiedzialne za ruchliwość komórki, interakcje komórkowe oraz organizację cytoszkieletu (SDFR1, DAAM1, IQGAP1, ADD3, TLN1, ITGB1, LGALS8, CAPZB, DNCI2, LSP1); antygeny błonowe (CD24, CD45, CD62L, CD79a, CD79b, CD85D); związane z opornością na cytostatyki (ASNS, CROP, MVP); biorące udział w metabolizmie kwasów nukleinowych (HIST1H2BD, HIST1H2AC, ATRX, ATR) [15].
Problem przewidywania rokowania na podstawie profilu ekspresji podjęli również Yeoh i wsp. [62], którzy stwierdzili, że przyporządkowanie danego przypadku ALL do odpowiedniej podgrupy nie umożliwia precyzyjnego określenia powodzenia stosowanej terapii. Dane te prawdopodobnie świadczą o istnieniu kilku mechanizmów odpowiedzialnych za niepowodzenie leczenia w ostrych białaczkach. Yeoh i wsp. [62], po przeanalizowaniu przypadków ALL, w których dochodziło do rozwoju AML indukowanej terapią, w oparciu o dane o ekspresji obejmujący 20 genów (w tym RSU1 i MSH3) opracowali model korelujący z wystąpieniem takich powikłań u pacjentów z rearanżacją TEL-AML1. U pacjentów z hiperdiploidią stwierdzono silną korelację między występowaniem trisomii a nadekspresją większości genów zlokalizowanych na trisomicznych chromosomach [42,62]. Dzięki połączeniu badań nowoczesną metodą mikromacierzy i konwencjonalnej cytogenetyki znacznie usprawniono diagnostykę liczbowych aberracji chromosomowych. Duży krok w kierunku wprowadzenia metody profilowania ekspresji do rutynowej diagnostyki stanowi uznanie przez Children’s Oncology Group obecności potrójnej trisomii 4, 10 i 17 jako czynnika stratyfikacyjnego, korzystnego rokowniczo w obrębie grupy HD>50 [42].
Udział niedużej liczby genów odpowiedzialnych za możliwość wystąpienia powikłań w ALL potwierdzili jako jedni z pierwszych Staal i wsp. [51]. Na podstawie profilu ekspresji genów w blastach pochodzących od pacjentów z T-ALL i pre-B ALL, Beesley i wsp. [6] zasugerowali istnienie podobnego mechanizmu występowania nawrotów choroby w ostrej białaczce limfoblastycznej. Mimo istnienia odrębnych profili ekspresji pomiędzy 2 liniami limfoblastów [62], otrzymano podobne zmiany w poziomie transkryptów genów odpowiedzialnych za niekorzystne rokowanie. Ponadto wykazano, iż zmiany genetyczne dotyczą szlaków progresji cyklu komórkowego, onkogenezy, lekooporności oraz metastazy, nie są natomiast powiązane z opornością wielolekową. Zarówno Staal i wsp. [51], jak i Beesley i wsp. [6] stwierdzili nadekspresję w obrębie podobnych grup genów, mimo stosowania różnego typu macierzy ekspresyjnych.
Pionierskie analizy przeprowadził zespół Edicka i wsp. [23], który określił korelacje profilu ekspresji genów w limfoblastach z możliwością wystąpienia wtórnych nowotworów mózgu. Wyodrębniono 5 współdziałających genów: FGFRI, HNRPL, KPNBI, NFIC, STAT4, których zmieniona ekspresja świadczy o możliwości wystąpienia powikłań po radioterapii. Tym samym udowodniono, iż zastosowanie techniki mikromacierzy umożliwia przewidywanie odpowiedzi na spowodowany przez mutagenne leczenie stres genotoksyczny w innych tkankach.
Niezależna od klasycznych metod identyfikacja nowych grup prognostycznych daje nadzieję na stworzenie nowoczesnej optymalnej strategii terapii dobranej dla indywidualnego pacjenta. Znaczna ilość danych otrzymywanych techniką mikromacierzy dostarcza nowego spojrzenia na patogenezę ALL, a w konsekwencji może doprowadzić do rozwoju nowoczesnej diagnostyki oraz spersonalizowanej strategii leczenia [16].
PRZEWIDYWANIE LEKOOPORNOŚCI W OSTRYCH BIAŁACZKACH NA PODSTAWIE PROFILU EKSPRESJI GENÓW
Prawidłowe przyporządkowanie pacjentów do grup ryzyka wyznacza kolejne zadanie, jakim jest zastosowanie odpowiedniej terapii [48]. Przewidywanie odpowiedzi na zastosowany lek jest wyzwaniem we współczesnej onkologii [47]. ALL u dzieci jest wyleczalna prawie w 80% przypadków, a u dorosłych zaledwie w 40% [9,29,43,45,54]. Kilka grup badawczych podjęło próby poszukiwania zestawów genów zaangażowanych w niepowodzenie terapii [1,38]. Przy założeniu, iż zjawisko lekooporności jest pierwotną cechą blastów białaczkowych możliwe jest przewidywanie nieskuteczności leczenia [11]. Omawiana technika coraz częściej znajduje zastosowanie w badaniach tak wieloczynnikowego zjawiska jak lekooporność, ze względu na możliwość jednoczesnego przeanalizowania najważniejszych genów dla tego procesu [47]. Na mechanizm lekooporności składa się wiele zjawisk oraz złożonych procesów, wzajemnie na siebie zachodzących, obejmujących przede wszystkim: zmianę funkcji receptorów, heterogenność populacji komórek nowotworowych, mikrośrodowisko tkanki, interakcje międzykomórkowe, zaburzenia w transporcie i przekazywaniu sygnału oraz zmianę ekspresji kluczowych genów [1]. Wciąż nie są jednak dobrze poznane genetyczne podstawy oporności na chemioterapię [33]. Wynika stąd konieczność globalnego wglądu w zjawisko niepowodzeń stosowanych metod leczenia, gdyż poszukiwanie pojedynczych markerów jest ograniczone. Na podstawie profilu genetycznego możliwe jest przewidywanie odpowiedzi na zastosowane leczenie dzięki ustaleniu korelacji pomiędzy ekspresją określonych grup genów a wrażliwością/opornością na dany czynnik przeciwnowotworowy lub efektywnością stosowanego leczenia [16,47]. Tego typu podejście zostało zastosowane w systemach in vitro przez National Cancer Institute i jest realizowane przez wiele publicznych i prywatnych laboratoriów na całym świecie [47].
Najwcześniejsze z analiz dotyczyły wpływu na komórkę metotreksatu i merkaptopuryny oraz kombinacji tych leków; Cheok i wsp. [13], stwierdzili występowanie różnic w ekspresji 124 genów. W odpowiedzi na stosowane leczenie zmiany w ekspresji zachodziły w obrębie genów odpowiedzialnych za apoptozę (BAX, GADD45), reakcję na stres (CTSG, defensyna), metabolizm kwasów komórkowych (MLH1, MRE11), kontrolę cyklu komórkowego (ATM, E2F5, CDKN1B, RBBP8), transdukcję sygnału, metabolizm komórkowy, transport. Cheok i wsp. [13] zasugerowali, iż analiza profilu genetycznego komórki, odzwierciedlającego odmienną naturę biologicznej odpowiedzi na stosowane leczenie, stwarza możliwość na optymalizację chemioterapii oraz ułatwia poszukiwanie nowych cząsteczek docelowych dla leków [13].
Opublikowane w 2005 r. wyniki grupy BFM (Berlin- Frankfurt-Münster) wskazują, że na podstawie profilu ekspresji genetycznej można przewidzieć odpowiedź na zastosowane leczenie [11]. Porównanie uzyskanych wzorców genetycznych z wielkością minimalnej choroby resztkowej po zakończeniu indukcji remisji i przed rozpoczęciem leczenia konsolidującego remisję pozwoliło na identyfikację 54 genów, które różnicują ALL na wrażliwe i oporne na leczenie [11]. Wśród transkryptów, których poziom ekspresji uległ największemu obniżeniu w białaczkach opornych znalazły się przede wszystkim geny związane z apoptozą (E2F1, GRIM19, SIVA, TNF), kontrolą podziałów komórki oraz progresją cyklu komórkowego (CDCA1, CDCA4, E2F1, E2F6, MCM5, MYBL2, PARD3, TTK), co sugeruje ich największy udział tego typu regulacji w powstawaniu oporności. Otrzymane wyniki są zbliżone do prezentowanych uprzednio przez Chiaretti i wsp. [14], co wskazuje na podobieństwa odpowiedzi na leczenie między dziecięcą B-prekursorową ALL, a ALL T-komórkową, występującą u dorosłych. Badania te mogą sugerować wspólne podłoże mechanizmu lekooporności w tym podtypie ostrej białaczki limfoblastycznej [11,14]. Wyniki uzyskane po zastosowaniu macierzy genowych korelowały również z wynikami badań wrażliwości na cytostatyki in vitro. U pacjentów z opornością krzyżową na leki najczęściej stosowane w leczeniu ALL, takie jak prednizolon (PRD), winkrystyna (VCR), L-asparaginaza (ASP) i daunorubicyna (DNR), komórki białaczkowe cechował swoisty profil ekspresji 45 genów [38]. Chiaretti i wsp. [14] dokonali analizy porównawczej profilu ekspresji opracowanych dla grupy dorosłych pacjentów z T-ALL z wynikami prezentowanymi przez Yeoha i wsp. [62], dla pacjentów pediatrycznych z ostrą białaczką T-komórkową. Na podstawie zestawienia genów zidentyfikowanych jako odpowiedzialne za wystąpienie nawrotu choroby nie stwierdzono powtarzalności wyników u dzieci i dorosłych. Dane te sugerują inny genetyczny mechanizm wystąpienia zjawiska lekooporności u dzieci i dorosłych z ostrą białaczką limfoblastyczną T-komórkową. Dlatego też wywnioskowano, iż u podłoża osiągnięcia remisji leżą zmiany w ekspresji innych genów, co nie jest zaskakujące przy występujących różnicach w biologii omawianego typu białaczek. Precyzyjna stratyfikacja pacjentów do odpowiednich grup ryzyka znacznie zwiększa szanse trwałego wyleczenia, co ma istotne znaczenie w terapii chorób nowotworowych.
Określono również ekspresję genów w komórkach białaczkowych pod względem oporności i wrażliwości in vitro na specyficzne leki przeciwbiałaczkowe (prednizolon, winkrystynę, L-asparaginazę oraz daunorubicynę) oraz ich kombinacje. Zidentyfikowano geny, dla których zmiany w ekspresji korelowały z wystąpieniem lekooporności na jeden z 4 głównych leków przeciwbiałaczkowych. Zaobserwowano istotne zmiany w poziomie ekspresji 124 genów; 33 związanych z wystąpieniem oporności na prednizolon, 40 na winkrystynę, 35 na L-asparaginazę oraz 20 na daunorubicynę [33]. W badaniach tych wykazano, iż za mechanizm lekooporności odpowiadają różne grupy funkcjonalne genów. Wśród genów odpowiedzialnych za wrażliwość komórek na działanie prednizolonu dominowały przede wszystkim geny związane z metabolizmem węglowodanów, a oporności na ten lek towarzyszyła nadekspresja MCL1 (genu antyapoptotycznego) oraz obniżenie poziomu ekspresji genów biorących udział w regulacji procesu transkrypcji (SMARCB1, PRPF18, CTCF). W grupie genów, związanych z podatnością limfoblastów na winkrystynę, znalazły się przede wszystkim geny zaangażowane w metabolizm kwasów nukleinowych, a oporność korelowała ze zmianami w ekspresji genów kodujących elementy cytoszkieletu i macierzy zewnątrzkomórkowej (TMSB10, PDLIM1, DSC3). W komórkach wrażliwych na L-asparaginazę odnotowano wysoki poziom ekspresji genów metabolizmu białek, a w komórkach opornych obserwowano nadekspresję genów białek rybosomalnych (RPL3, RPL4, RPL5, RPL6, RPL11). W kolejnej analizie określono fenotyp odpowiedzialny za zjawisko oporności na 2 lub więcej leków jednocześnie, związanego z bardzo złym rokowaniem u pacjentów [38]. Model oporności krzyżowej de novo opracowano w oparciu o zróżnicowaną ekspresję 45 genów, przede wszystkim związanych z transkrypcją, transportem komórkowym oraz cyklem komórkowym. Za wystąpienie zjawiska niezgodnej oporności na winkrystynę i L-asparaginazę odpowiadały zmiany w ekspresji 139 genów, głównie związanych z biosyntezą białek (białka rybosomalne, translacyjne czynniki elongacji). W analizie porównawczej transkryptomu komórek niewrażliwych na indywidualne leki z wykazującymi oporność krzyżową stwierdzono zgodność jedynie dla 15% analizowanych genów (w przypadku PRD – 12 genów, DNR – 5, ASP – 3, VCR – 0), co świadczy o odmiennym mechanizmie lekooporności w rozpatrywanych przypadkach. Geny związane z opornością na wyżej wymienione leki, które znacząco korelowały ze wzrostem ryzyka nawrotu w przebadanej grupie pacjentów oraz w niezależnej grupie 98 pacjentów leczonych w ten sam sposób. W badaniach Hollemana i wsp. [34] dotyczących analizy ekspresji genów związanych z apoptozą, wykazano, iż zmiany towarzyszące oporności na prednizolon i L-asparaginazę dotyczyły zaledwie 2–3 genów szlaku apoptotycznego. Z kolei brak wyraźnej korelacji zmian w ekspresji analizowanej grupy genów z opornością na winkrystynę i daunorubicynę, sugeruje iż za mechanizm lekooporności nie odpowiadają zmiany w poziomie transkryptów genów proapoptotycznych. Powyższe dane wskazują również, że wynik leczenia dziecięcej ALL jest zależny od innych szlaków metabolicznych niż apoptoza.
ZASTOSOWANIE MIKROMACIERZY DO OPRACOWYWANIA NOWYCH LEKÓW PRZECIWBIAŁACZKOWYCH
Technika mikromacierzy może być również stosowana w poszukiwaniu celu molekularnego, w projektowaniu leku, określeniu wpływu in vitro i in vivo leku na globalny poziom ekspresji genów, identyfikacji mechanizmów działania, wykrywaniu potencjalnej toksyczności oraz określaniu efektu farmakodynamicznego [3,8,16,17,19,47,49]. Farmakogenomika nowotworów (dziedzina zajmująca się oceną wrodzonych genetycznych uwarunkowań odmiennego działania leków) umożliwia odkrywanie nowych leków przeciwnowotworowych oraz genetycznych celów dla nich na podstawie dobrze sprecyzowanego mechanizmu onkogenezy [9,47]. Technika mikromacierzy stała się jednym z ważniejszych narzędzi farmakogenomiki.
Dzięki możliwościom tej techniki do uzyskania „molekularnego portretu” komórki nowotworowej, najprawdopodobniej możliwe będzie w niedalekiej przyszłości jej włączenie w diagnozowanie, prognozowanie oraz przewidywanie odpowiedzi na terapię. Z kolei identyfikacja i pomiar ekspresji genów odpowiedzialnych za oporność na leki w próbkach klinicznych umożliwia zarówno przewidywanie reakcji komórek nowotworowych na leczenie, jak również selekcję najbardziej odpowiednich leków lub ich zestawów [11,47]. Budzi to nadzieje na indywidualizację intensywności i strategii leczenia [47,53]. W literaturze funkcjonuje już termin „profil farmakogenetyczny” pacjenta [24]. Obecnie kilka leków dla docelowych cząsteczek wytypowanych za pomocą mikromacierzy znajduje się we wczesnej fazie badań klinicznych, np. inhibitor kinazy tyrozynowej FLT3 [12] czy inhibitory kinaz białkowych ZAP70 i ERBB2 [2].
Zestawienie dotychczasowych badań ostrych białaczek limfoblastycznych za pomocą techniki macierzy ekspresyjnych przedstawiono w tabeli 3.
Tabela 3. Badania ekspresji genów w ostrych białaczkach limfoblastycznych u dzieci i dorosłych (opracowanie własne)

PODSUMOWANIE
Metodyka badań z wykorzystaniem macierzy DNA znajduje się w fazie szybkiego rozwoju. Technika ta jest wciąż ulepszana i staje się coraz bardziej czuła. Na macierzach producenci umieszczają coraz większą liczbę sond dla różnych genów, w niektórych przypadkach nawet kilkaset tysięcy. Technika ta wyznacza ważne i obiecujące kierunki poszukiwań badawczych. Być może coraz lepsza znajomość mechanizmów i przebiegu choroby nowotworowej, postęp w dziedzinie genetyki i biologii molekularnej oraz rozwój czułych metod analitycznych umożliwią w niedalekiej przyszłości dokładną ocenę ich rzeczywistego związku z odległymi wynikami onkologicznymi. Badania profili genetycznych w poszczególnych etapach kancerogenezy mogą doprowadzić do lepszego zrozumienia samego procesu chorobowego, a także doprowadzić do rozwoju nowoczesnej klasyfikacji oraz skuteczniejszej terapii. Bez wątpienia technika macierzy ekspresyjnych jest ważnym narzędziem w onkologii.
Technika o tak ogromnym potencjale dostarcza nowego spojrzenia na przebieg molekularnych ścieżek prowadzących do rozwoju nowotworu oraz molekularnej patogenezy ostrych białaczek. Przeprowadzone w ostatnim dziesięcioleciu analizy transkryptomu limfoblastów wykazały, iż nowotwory hematologiczne mogą być precyzyjnie klasyfikowane w oparciu o profil ekspresji, który ma związek z morfologicznymi, immunofenotypowymi, genetycznymi oraz innymi cechami komórek. Nie mniej jednak wprowadzenie macierzy ekspresyjnych do rutynowej diagnostyki i terapii stanowi wyzwanie oraz wymaga dalszego dopracowania przede wszystkim standardów wykonywania analiz. W tej dziedzinie dużym osiągnięciem są zbieżne wyniki analiz różnych zespołów badawczych otrzymywane na niezależnych grupach pacjentów z ALL. Jest to możliwe mimo przeprowadzenia eksperymentu w różnych warunkach i przy odmiennych parametrach, w niezależnych laboratoriach diagnostycznych. Pojawiła się wobec tego możliwość wykorzystania mikromacierzy w klasyfikacji i ocenie grup ryzyka w przypadku ostrych białaczek limfoblastycznych.
Znaczący postęp techniczny nie idzie jeszcze w parze z badaniami klinicznymi. Ogromna liczba analiz technicznych i statystycznych, jak również konieczność przeniesienia tych złożonych danych do rutynowych badań klinicznych, ich zrozumienie oraz wcielenie w praktykę kliniczną stanowi wciąż ogromne wyzwanie.
Tabela 4. Słownik nazw genów występujących w publikacji

PIŚMIENNICTWO
[1] Alaoui-Jamali M.A., Dupré I., Qiang H.: Prediction of drug sensitivity and drug resistance in cancer by transcriptional and proteomic profiling. Drug Resist. Updat., 2004; 7: 245-255
[PubMed]  
[2] Andersson A., Edén P., Lindgren D., Nilsson J., Lassen C., Heldrup J., Fontes M., Borg A., Mitelman F., Johansson B., Hoglund M., Fioretos T.: Gene expression profiling of leukemic cell lines reveals conserved molecular signatures among subtypes with specific genetic aberrations. Leukemia, 2005; 19: 1042-1050
[PubMed]  
[3] Armstrong S.A., Look A.T.: Molecular genetics of acute lymphoblastic leukemia. J. Clin. Oncol., 2005; 23: 6306-6315
[PubMed]  
[4] Armstrong S.A., Staunton J.E., Silverman L.B., Pieters R., den Boer M.L., Minden M.D., Sallan S.E., Lander E.S., Golub T.R., Korsmeyer S.J.: MLL translocations specify a distinct gene expression profile that distinguishes a unique leukemia. Nat. Genet., 2002; 30: 41-47
[PubMed]  
[5] Barrett J.C., Kawasaki E.S.: Microarrays: the use of oligonucleotides and cDNA for the analysis of gene expression. Drug Discov. Today, 2003; 8: 134-141
[PubMed]  
[6] Beesley A.H., Cummings A.J., Freitas J.R., Hoffmann K., Firth M.J., Ford J., de Klerk N.H., Kees U.R.: The gene expression signature of relapse in paediatric acute lymphoblastic leukaemia: implications for mechanisms of therapy failure. Br. J. Haematol., 2006; 131: 447-456
[7] Bhojwani D., Kang H., Moskowitz N.P., Min D.J., Lee H., Potter J.W., Davidson G., Willman C.L., Borowitz M.J., Belitskaya-Levy I., Hunger S.P., Raetz E.A., Carroll W.L.: Biologic pathways associated with relapse in childhood acute lymphoblastic leukemia: a Children's Oncology Group study. Blood, 2006; 108: 711-717
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[8] Blohm D.H., Guiseppi-Elie A.: New developments in microarray technology. Curr. Opin. Biotechnol., 2001; 12: 41-47
[PubMed]  
[9] Brenner T.L., Pui C.H., Evans W.E.: Pharmacogenomics of childhood acute lymphoblastic leukemia. Curr. Opin. Mol. Ther., 2001; 3: 567-578
[PubMed]  
[10] Bullinger L, Dohner K, Bair E, Fröhling S., Schlenk R.F., Tibshirani R., Döhner H., Pollack J.R.: Use of gene-expression profiling to identify prognostic subclasses in adult acute myeloid leukemia. N. Engl. J. Med., 2004; 350: 1605-1616
[PubMed]  
[11] Cario G., Stanulla M., Fine B.M., Teuffel O., Neuhoff N.V., Schrauder A., Flohr T., Schäfer B.W., Bartram C.R., Welte K., Schlegelberger B., Schrappe M.: Distinct gene expression profiles determine molecular treatment response in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood, 2005; 105: 821-826
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[12] Carroll W.L., Bhojwani D., Min D.-J., Moskowitz N., Raetz E.A.: Childhood acute lymphoblastic leukemia in the age of genomics. Pediatr. Blood Cancer, 2006; 46: 570-578
[PubMed]  
[13] Cheok M.H., Yang W., Pui C.H., Downing J.R., Cheng C., Naeve C.W., Relling M.V., Evans W.E.: Treatment-specific changes in gene expression discriminate in vivo drug response in human leukemia cells. Nat. Genet., 2003; 34: 85-90
[PubMed]  
[14] Chiaretti S., Li X., Gentleman R., Vitale A., Vignetti M., Mandelli F., Ritz J. Foa R.: Gene expression profile of adult T-cell acute lymphocytic leukemia identifies distinct subsets of patients with different response to therapy and survival. Blood, 2004; 103: 2771-2778
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[15] Chiaretti S., Li X., Gentleman R., Vitale A., Wang K.S., Mandelli F., Foa R., Ritz J.: Gene expression profiles of B-lineage adult acute lymphocytic leukemia reveal genetic patterns that identify lineage derivation and distinct mechanisms of transformation. Clin. Cancer Res., 2005; 11: 7209-7219
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[16] Chung C.H., Levy S., Chaurand P., Carbone D.P.: Genomics and proteomics: Emerging technologies in clinical cancer research. Crit. Rev. Oncol. Hematol., 2007; 61: 1-25
[PubMed]  
[17] Clarke P.A., te Poele R.,Workman P.: Gene expression microarray technologies in the development of new therapeutic agents. Eur. J. Cancer, 2004; 40: 2560-2591
[PubMed]  
[18] Colby-Graham M.F., Chordas C.: The childhood leukemias. J. Pediatr. Nurs., 2003; 18: 87-95
[PubMed]  
[19] Cussenot O.: DNA microarrays in clinical practice: present or future? Eur. J. Intern. Med., 2002; 13: 225-226
[PubMed]  
[20] De Pitta C., Tombolan L., Campo Dell'Orto M., Accordi B., Te Kronnie G., Romualdi C., Vitulo N., Basso G., Lanfranchi G.: A leukemia-enriched cDNA microarray platform identifies new transcripts with relevance to the biology of pediatric acute lymphoblastic leukemia. Haematologica, 2005; 90: 890-898
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[21] Downing J.R., Mullighan C.G.: Tumor-specific genetic lesions and their influence on therapy in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program, 2006;: 118-122
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[22] Downing J.R., Shannon K.M.: Acute leukemia: A pediatric perspective. Cancer Cell, 2002; 2: 437-445
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[23] Edick M.J., Cheng C., Yang W., Cheok M., Wilkinson M.R., Pei D., Evans W.E.,. Kun L.E., Pui C.H., Relling M.V.: Lymphoid gene expression as a predictor of risk of secondary brain tumors. Genes Chromosomes Cancer, 2005; 42: 107-116
[PubMed]  
[24] Fernandez Zapico M.E., Ahmad U.S., Urrutia R.: DNA microarrays: Revolutionary insight into the living genome. Surgery, 2001; 130: 403-407
[PubMed]  
[25] Ferrando A.A., Look A.T.: Gene expression profiling: will it complement or replace immunophenotyping? Best Pract. Res. Clin. Haematol., 2003; 16: 645-652
[26] Ferrando A.A., Neuberg D.S., Staunton J., Loh M.L., Huard C., Raimondi S.C., Behm F.G., Pui C.H., Downing J.R., Gilliland D.G., Lander E.S., Golub T.R., Look A.T.: Gene expression signatures define novel oncogenic pathways in T cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Cell, 2002; 1: 75-87
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[27] Fine B.M., Stanulla M., Schrappe M., Ho M., Viehmann S., Harbott J., Boxer L.M.: Gene expression patterns associated with recurrent chromosomal translocations in acute lymphoblastic leukemia. Blood, 2004; 103: 1043-1049
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[28] Golub T.R., Slonim D.K., Tamayo P. Huard C., Gaasenbeek M., Mesirov J.P., Coller H., Loh M.L., Downing J.R., Caligiuri M.A., Bloomfield C.D., Lander E.S.: Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science, 1999; 286: 531-537
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[29] Greaves M.: Science, medicine, and the future: Childhood leukemia. BMJ, 2002; 324: 283-287
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[30] Haferlach T., Kern W., Schnittger S., Schoch C.: Modern diagnostics in acute leukemias. Crit. Rev. Oncol. Hematol., 2005; 56: 223-234
[PubMed]  
[31] Haferlach T., Kohlmann A., Schnittger S., Dugas M., Hiddemann W., Kern W., Schoch C.: Global approach to the diagnosis of leukemia using gene expression profiling. Blood, 2005; 106, 1189-1198
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[32] Hoffmann K., Firth M.J., Beesley A.H., de Klerk N.H., Kees U.R.: Translating microarray data for diagnostic testing in childhood leukaemia. BMC Cancer, 2006, 6: 229
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[33] Holleman A., Cheok M.H., den Boer M.L., Yang W., Veerman A.J., Kazemier K.M., Pei D., Cheng C., Pui C.H., Relling M.V., Janka-Schaub G.E., Pieters R., Evans W.E.: Gene expression patterns in drug-resistant acute lymphoblastic leukemia cells and response to treatment. N. Engl. J. Med., 2004; 351: 533-542
[PubMed]  
[34] Holleman A., den Boer M.L., Menezes R.X., Cheok M.H, Cheng C., Kazemier K.M., Janka-Schaub G.E., Gobel U., Graubner U.B., Evans W.E., Pieters R.: The expression of 70 apoptosis genes in relation to lineage, genetic subtype, cellular drug resistance, and outcome in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood, 2006; 107: 769-776
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[35] Jabbour E.J., Faderl S., Kantarjian H.M.: Adult acute lymphoblastic leukemia. Mayo Clin. Proc., 2005; 80: 1517-1527
[PubMed]  
[36] Kees U.R., Ford J., Watson M., Murch A., Ringnér M., Walker R.L., Meltzer P.: Gene expression profiles in a panel of childhood leukemia cell lines mirror critical features of the disease. Mol. Cancer Ther., 2003; 2: 671-677
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[37] Kohlmann A., Schoch C., Schnittger S., Dugas M., Hiddemann W., Kern W., Haferlach T.: Pediatric acute lymphoblastic leukemia (ALL) gene expression signatures classify an independent cohort of adult ALL patients. Leukemia, 2004; 18: 63-71
[PubMed]  
[38] Lugthart S., Cheok M.H., den Boer M.L., Yang W., Holleman A., Cheng C., Pui C.H., Relling M.V., Janka-Schaub G.E., Pieters R., Evans W.E.: Identification of genes associated with chemotherapy crossresistance and treatment response in childhood acute lymphoblastic leukemia. Cancer Cell, 2005; 7: 375-386
[PubMed]  
[39] Margalit O., Somech R., Amariglio N., Rechavi G.: Microarray-based gene expression profiling of hematologic malignancies: basic concepts and clinical applications. Blood Rev., 2005; 19: 223-234
[PubMed]  
[40] Mitchell S.A., Brown K.M., Henry M.M., Mintz M., Catchpoole D., LaFleur B., Stephan D.A.: Inter-Platform comparability of microarrays in acute lymphoblastic leukemia. BMC Genomics, 2004; 5: 71
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[41] Moos P.J., Raetz E.A., Carlson M.A., Szabo A., Smith F.E., Willman C., Wei Q., Hunger S.P., Carroll W.L.: Identification of gene expression profiles that segregate patients with childhood leukemia. Clin. Cancer Res., 2002; 8: 3118-3130
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[42] Mullighan C.G., Flotho C., Downing J.R.: Genomic assessment of pediatric acute leukemia. Cancer J., 2005; 11: 268-282
[PubMed]  
[43] Pui C.H., Evans W.E.: Drug therapy: Acute lymphoblastic leukemia. N. Engl. J. Med., 1998; 339: 605-615
[PubMed]  
[44] Pui C.H., Evans W.E.: Drug therapy: treatment of acute lymphoblastic leukemia. N. Engl. J. Med., 2006; 354: 166-178
[PubMed]  
[45] Pui C.H, Relling M.V., Downing J.R.: Mechanisms of disease: Acute lymphoblastic leukemia. N. Engl. J. Med., 2004; 350: 1535-1548
[PubMed]  
[46] Quackenbush J.: Microarray analysis and tumor classification. N. Engl. J. Med., 2006; 354: 2463-2472
[PubMed]  
[47] Robert J., Vekris A., Pourquier P., Bonnet J.: Predicting drug response based on gene expression. Crit. Rev. Oncol. Hematol., 2004; 51: 205-227
[PubMed]  
[48] Ross M.E., Zhou X., Song G., Shurtleff S.A., Girtman K., Williams W.K., Liu H.C., Mahfouz R., Raimondi S.C., Lenny N., Patel A., Downing J.R.: Classification of pediatric acute lymphoblastic leukemia by gene expression profiling. Blood, 2003; 102: 2951-2959
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[49] Scherf U., Ross D.T., Waltham M., Smith L.H., Lee J.K., Tanabe L., Kohn K.W., Reinhold W.C., Myers T.G., Andrews D.T., Scudiero D.A., Eisen M.B., Sausville E.A., Pommier Y., Botstein D., Brown P.O., Weinstein J.N.: A gene expression database for the molecular pharmacology of cancer. Nat. Genet., 2000; 24: 236-244
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[50] Song J.H., Kim H.J., Lee C.H., Kim S.J, Hwang S.Y., Kim T.S: Identification of gene expression signatures for molecular classification in human leukemia cells. Int. J. Oncol., 2006; 29: 57-64
[PubMed]  
[51] Staal F.J., van der Burg M., Wessels L.F., Barendregt B.H., Baert M.R., van den Burg C.M., van Huffel C., Langerak A.W., van der Velden V.H., Reinders M.J., van Dongen J.J.: DNA microarrays for comparison of gene expression profiles between diagnosis and relapse in precursor-B acute lymphoblastic leukemia: choice of technique and purification influence the identification of potential diagnostic markers. Leukemia, 2003; 17: 1324-1332
[PubMed]  
[52] Staudt L.M.: Gene expression physiology and pathophysiology of the immune system. Trends Immunol., 2001; 22: 35-40
[PubMed]  
[53] Stegmaier K.: Genomic approaches in acute leukemia. Best Pract. Res. Clin. Haematol., 2006; 19: 263-268
[54] Styczyński J., Gil L.: Ostra białaczka limfoblastyczna: różnice pomiędzy dziećmi i dorosłymi. Acta Haematol. Pol., 2006; 37: 185-201
[55] Styczyński J., Wysocki M.: Is the in vitro drug resistance profile the strongest prognostic factor in childhood acute lymphoblastic leukemia? J. Clin. Oncol., 2004; 22: 963-964
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[56] Szczepanek J., Budzyński T., Jackowski M., Tretyn A.,: Budowa, zasady działania i zastosowanie chipów DNA w biologii i medycynie. Med. Biol. Sci., 2006; 20, 47-56
[57] Teuffel O., Dettling M., Cario G., Stanulla M., Schrappe M., Bühlmann P., Niggli F.K., Schäfer B.W.: Association of gene expression profiles with risk stratification in childhood acute lymphoblastic leukemia. Haematologica, 2004; 89: 801-808
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[58] Valk P.J., Verhaak R.G., Beijen M.A., Erpelinck C.A., Barjesteh van Waalwijk van Doorn- Khosrovani S.B., Boer J.M., Beverloo H.B., Moorhouse M.J., van der Spek P.J., Löwenberg B., Delwel R.: Prognostically useful gene-expression profiles in acute myeloid leukemia. N. Engl. J. Med., 2004; 350: 1617-1628
[PubMed]  
[59] van Delft F.W., Bellotti T., Luo Z., Jones L.K., Patel N., Yiannikouris O., Hill A.S., Hubank M., Kempski H., Fletcher D., Chaplin T., Foot N., Young B.D., Hann I.M., Gammerman A., Saha V.: Prospective gene expression analysis accurately subtypes acute leukaemia in children and establishes a commonality between hyperdiploidy and t(12;21) in acute lymphoblastic leukaemia. Br. J. Haematol., 2006; 130: 26-35
[PubMed]  
[60] Willenbrock H., Juncker A.S., Schmiegelow K., Knudsen S., Ryder L.P.: Prediction of immunophenotype, treatment response, and relapse in childhood acute lymphoblastic leukemia using DNA microarrays. Leukemia, 2004; 18: 1270-1277
[PubMed]  
[61] Willman C.L.: Discovery of novel molecular classification schemes and genes predictive of outcome in leukemia. Hematol. J., 2004; 5 (suppl. 3): S138-S143
[62] Yeoh E.J., Ross M.E., Shurtleff S.A., Williams W.K., Patel D., Mahfouz R., Behm F.G., Raimondi S.C., Relling M.V., Patel A., Cheng C., Campana D., Wilkins D., Zhou X., Li J., Liu H., Pui C.H., Evans W.E., Naeve C., Wong L., Downing J.R.: Classification, subtype discovery, and prediction of outcome in pediatric acute lymphoblastic leukemia by gene expression profiling. Cancer Cell, 2003; 1: 133-143
[Abstract]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[63] Zhang X., Ke H.: ALL/AML cancer classification by gene expression data using SVM and CSVM approach. Genome Informatics, 2000; 11: 237-239
[Full Text HTML]  [Full Text PDF]