Postepy Hig Med Dosw. (online), 2013; 67: 1331-1339
Review
Full Text PDF  

Glikoforyna C erytrocytów ludzkich jako receptor dla liganda EBA-140 merozoitów Plasmodium falciparum
Human erythrocyte glycophorin C as the receptor for EBA-140 Plasmodium falciparum merozoite ligand
Joanna Rydzak1  , Alicja M. Kmiecik1  , Ewa Jaśkiewicz1,2  
1Zakład Immunochemii, Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu
2Katedra Biologii Molekularnej, Wydział Nauk Biologicznych, Uniwersytet Zielonogórski
Adres do korespondencji
Zakład Immunochemii Glikokoniugatów, Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN im. Ludwika Hirszfelda, ul. R. Weigla 12, 53-114 Wrocław; e-mail: jaskiew@iitd.pan.wroc.pl

Źródło finansowania
Praca została sfinansowana z grantów: MNSiW (nr N N302 281436) oraz NCN (nr 2012/05/N/NZ6/00667)

Otrzymano:  2013.06.24
Zaakceptowano:  2013.11.15
Opublikowano:  2013.12.23

Streszczenie
Proces inwazji erytrocytów ludzkich przez zarodźce malarii jest wynikiem kaskady wzajem­nych interakcji między pasożytem a krwinką czerwoną. Bierze w nim udział wiele ligandów merozoitów Plasmodium falciparum, w tym białka z rodziny EBL (erythrocyte-binding-like). Poznanie struktury rekombinowanego regionu wiążącego (Regionu II) liganda EBA-140, nale­żącego do tej rodziny białek, pozwoliło na wyjaśnienie molekularnych podstaw jego oddzia­ływania z receptorem erytrocytów. Struktura krystaliczna Regionu II otrzymana w obecności α(2,3)-sjalolaktozy, wykazała, że region ten wiąże się do receptora jako monomer. Ustalono, że Region II białka EBA-140 zawiera dwie kieszenie wiążące glikan, przy czym każda z nich znajdu­je się wewnątrz odrębnej domeny, F1 lub F2. Stwierdzone dla domen F1 i F2 Regionu II różnice w oddziaływaniach wskazują na ich odmienne role w wiązaniu receptora. Uważa sie, że chociaż obie domeny są konieczne do efektywnego wiązania, domena F1 pełni decydującą rolę w od­działywaniu z receptorem. Otrzymane wyniki wykazały, że struktura regionu wiążącego liganda EBA-140 P. falciparum oraz mechanizm wiązania glikanu jest unikalny wśród innych białek EBL. Ligand EBA-140 P. falciparum wiąże się do ludzkich erytrocytów poprzez błonową sjalogliko­proteinę - glikoforynę C. Sugeruje się, że w oddziaływaniu ligand - receptor może uczestniczyć klaster usjalowanych łańcuchów N- i O-glikozydowych, których dostępność zależy od regionu łańcucha polipeptydowego glikoforyny C, który obejmuje reszty aminokwasowe w poz. 36-63. Szczegółowa charakterystyka miejsca receptorowego na glikoforynie C może mieć potencjalne znaczenie w hamowaniu inwazji erytrocytów ludzkich przez P. falciparum w oparciu o receptor.
Słowa kluczowe: ligand EBA-140 P. falciparum • glikoforyna C • oddziaływanie ligand -receptor erytrocytów


Summary
Erythrocyte invasion by the blood-stage Plasmodium falciparum parasites is a multistep process involving specific interactions between parasites and red blood cells. Several proteins are in­volved in this process, including EBL ligands.
The structure of the EBA-140 ligand, a member of the EBL protein family, provides a full de­scription of its molecular interactions with the erythrocyte receptor. The crystal structure of the EBA-140 Region II in a complex with sialolactose revealed that the binding region is monomeric. Two glycan binding pockets, one in each F1 or F2 domain, were identified. Stark differences in the receptor binding for the F1 and F2 domains suggests that each domain per­forms a distinct function. Although both domains are required for effective glycan binding, it seems that the interaction may be mediated solely by the F1 domain. The structure of the binding region and the interaction with glycan are unique to the EBA-140 ligand and not sha­red by other EBL ligands.
The EBA-140 ligand binds specifically to human erythrocytes through the membrane sialogly­coprotein glycophorin C. The receptor site for the EBA-140 ligand was suggested to be a cluster of N-and O-linked sialylated glycans on the GPC molecule, whose conformation is dependent on the polypeptide chain region composed of amino acid residues 36-63. Precise definition of the binding site for the EBA-140 ligand on glycophorin C may be impor­tant with respect to human erythrocyte invasion inhibition strategies based on a receptor.
Key words: Plasmodium falciparum EBA-140 ligand • glycophorin C • ligand-receptor interactions




Wprowadzenie
Malaria jest chorobą pasożytniczą wywoływaną przez pierwotniaki z rodzaju Plasmodium [39]. Wyróżnia się pięć gatunków zarodźców zdolnych do rozwoju w organizmie ludzkim: ruchliwy (P. vivax), pasmowy (P. malariae), sierpo­wy (P. falciparum), owalny (P. ovale) oraz P. knowlesi, który zakaża również małpy.
Według raportu WHO około 219 milionów osób, głów­nie mieszkańców subsaharyjskich regionów Afryki oraz Indochin, zachorowało w 2010 roku na malarię, a około 660 tysięcy zmarło [13]. Przypadki śmiertelne dotyczą głównie kobiet w ciąży oraz dzieci, które nie ukończy­ły piątego roku życia. Za najcięższą postać malarii oraz większość zgonów odpowiedzialny jest P. falciparum [15]. Niestety, nie wprowadzono dotąd skutecznej szczepionki przeciw malarii. Stosowane obecnie metody zapobiega­nia rozprzestrzenianiu się choroby to wczesna diagnoza i leczenie uwzględniające lekooporność zarodźca oraz profilaktyka obejmująca kontrolę wektorową.
Mimo że problem malarii wydaje się dotyczyć jedynie krajów trzeciego świata, to przypadki zachorowań od­notowuje się również na terenach wysoce zurbanizowa­nych [10,11]. Wprawdzie malaria nie stanowi poważnego zagrożenia na terenach Polski, to ze względu na łatwość i częstość podróżowania wciąż zdarzają się pojedyncze przypadki zachorowań wśród osób powracających z za­granicy, marynarzy i żołnierzy [14,20].
Cykl rozwojowy zarodźca malarii obejmuje dwie fazy: płciową (sporogonię) oraz bezpłciową (schizogonię) [13,34,35,39]. Do rozmnażania bezpłciowego Plasmodium dochodzi w organizmie człowieka, który pełni rolę żywi­ciela pośredniego. Rozmnażanie płciowe pierwotniaka odbywa się natomiast w układzie pokarmowym samicy komara z rodzaju Anopheles, który jest żywicielem osta­tecznym. Pasożyt dostaje się do krwi człowieka w wyniku ukąszenia komara, wraz z jego śliną. Następnie sporozoity przemieszczają się z krwią i docierają do wątroby. W he­patocytach sporozoity po wielokrotnych podziałach ko­mórkowych przekształcają się w schizonta, który uwalnia do krwiobiegu żywiciela merozoity, zarażające następnie erytrocyty. W krwince merozoit ulega przeobrażeniu po­nownie w schizonta, który daje początek nowym merozo­itom, atakującym kolejne erytrocyty. Rozpadowi erytro­cytów towarzyszy występowanie objawów chorobowych typowych dla malarii: gorączki i dreszczy [16,35].
Inwazja erytrocytów przez merozoity zarodźca malarii jest złożonym procesem, obejmującym kaskadę oddzia­ływań pomiędzy białkami pasożyta a receptorami ery­trocytu [3,8,9,12,38]. Obejmuje ona kilka najważniejszych etapów: wstępne wiązanie merozoitu do powierzchni erytrocytu, apikalną reorientację merozoitu, utworze­nie „ścisłego" i nieodwracalnego wiązania między mero­zoitem a erytrocytem oraz ostatecznie wniknięcie mero­zoitu do wnętrza czerwonej krwinki.
Wśród adhezyn odpowiedzialnych za „ścisły" kontakt merozoitu z erytrocytem wyróżnić można dwie rodziny białek: RBL (reticulocyte-binding-like) oraz DBL (Duffy­-binding-like) [8,9,12,34,42]. Do rodziny DBL należą białka EBL (erythrocyte-binding-like antigens) oraz Var (variant surface antigens). Termin DBL pochodzi od antygenu Duffy na krwinkach czerwonych, którego identyfikacja dała po­czątek badaniom ligandów P. vivax i P. knowlesi. Wymienio­ne białka są umiejscowione w organellach wydzielniczych merozoitów: ligandy EBL w mikronemach, natomiast białka RBL w roptriach. Rodzina EBL P. falciparum reprezentowa­na jest przez cztery białka: EBA-175 (erythrocyte binding antigen-175), EBA-140 (erythrocyte binding antigen-140), EBA-181 (erythrocyte binding antigen-181) oraz EBL-1 (ery­throcyte-binding-ligand-1) [1,2].
Ligandy P. falciparum z rodziny EBL należą do białek trans­błonowych typu I [1,2]. W obrębie zewnątrzbłonowego, N-końcowego fragmentu łańcucha polipeptydowego biał­ka EBA zawierają domenę wiążącą receptor, nazwaną Re­gionem II (RII). Region II ligandów EBL P. falciparum zbu­dowany jest z dwóch homologicznych domen DBL: F1 i F2. Region wiążący ligandów EBL wykazuje homologię sekwencji aminokwasowej [44].
Zidentyfikowano wiele receptorów na erytrocytach ludz­kich, które są wiązane przez białka EBL. Dla większości z nich receptorami są glikoforyny - sjaloglikoproteiny błon erytrocytów [7,17,24]. Glikoforyna A (GPA) i C (GPC) pełni rolę receptora odpowiednio dla ligandów EBA-175 oraz EBA-140 [25,27,32,37,40,41]. Obie z nich można usu­nąć z powierzchni erytrocytów w wyniku trawienia tryp­syną. Ligand EBL-1 wiąże się do glikoforyny B, która jest wrażliwa na działanie chymotrypsyny [30]. Oddziaływanie między receptorami a ligandami z rodziny EBL jest zależ­ne od obecności reszt kwasu sjalowego i z tego powodu neuraminidaza znosi wiązanie tych ligandów.
Ligand EBA-140 P. falciparum i jego receptor glikoforyna C
Wykazano, że białko EBA-140 pochodzące z klonów Dd2/ Nm oraz 3D7 P. falciparum, nie wiąże się do erytrocytów traktowanych trypsyną oraz neuraminidazą. Wynik ten potwierdzono na podstawie spadku wiązania liganda EBA- 140 do erytrocytów o fenotypach Yus i Gerbich, które zawierają wariantową GPC z delecją odpowiednio reszt aminokwasowych 17-35 oraz 36-63 [6]. Sugeruje to, że białko EBA-140 wiąże się do ludzkich erytrocytów po­przez błonową sjaloglikoproteinę - glikoforynę C (GPC) [26,27,28]. Należy wspomnieć, że istnieją również donie­donie­sienia o braku wpływu lub jedynie częściowym spadku wiązania liganda EBA-140 do erytrocytów traktowanych trypsyną, na której działanie wrażliwa jest GPC, co wyklu­cza jej udział w wiązaniu białka EBA-140 [36,43].
Obserwowane rozbieżności mogą być związane z polimor­fizmem reszt aminokwasowych regionu wiążącego biał­ka EBA-140, który stwierdzono wśród różnych klonów P. falciparum, pochodzących z odmiennych regionów świata [26,33]. Zidentyfikowano pięć typów polimorficznych Re­gionu II EBA-140: VSTK, VSKK, ISKK, INRE, które dotyczą czterech reszt aminokwasowych domeny F1 odpowiednio w pozycjach: 185, 239, 261, 285 (ryc. 1).
Ryc. 1. Sekwencja aminokwasowa Regionu II EBA-140 klonu Dd2 wraz z rozmieszczeniem polimorficznych reszt aminokwasowych (wg [33], zmodyfikowano)

Wykazano różnicę w swoistości wiązania rekombinowa­nych wariantów polimorficznych Regionu II liganda EBA- 140 poddanych ekspresji w komórkach COS7. Ustalono, że spośród pięciu wariantów, jedynie wariant VSTK (po­chodzący z klonu Dd2/Nm) nie wiąże się do erytrocytów trawionych neuraminidazą lub trypsyną oraz do erytro­cytów o fenotypie Gerbich, a zatem wykazuje swoistość wobec GPC. Różnica w wiązaniu do erytrocytów dwóch odmiennych wariantów polimorficznych Regionu II ligan­da EBA-140: VSTK i VSKK, została potwierdzona również dla rekombinowanych białek poddanych ekspresji na po­wierzchni komórek CHO-K1 [18]. Stwierdzono, że warian­towa postać VSTK nie wiąże się do erytrocytów traktowa­nych neuraminidazą oraz erytrocytów o fenotypie Gerbich, podczas gdy wariant VSKK zachowuje zdolność wiązania w obu przypadkach. Ponieważ warianty te różnią się jedy­nie jedną resztą aminokwasową domeny F1 (lizyna zamiast treoniny w poz. 121), zaproponowano, że to właśnie T121 jest resztą aminokwasową kluczową dla wiązania kwasu sjalowego GPC [18]. Modelowanie struktury przestrzennej RII liganda EBA-140 na podstawie znanej struktury krysta­licznej RII homologicznego liganda EBA-175 [44] pozwoliło na ujawnienie w sąsiedztwie T121 czterech reszt amino­kwasowych zawierających ładunek, a więc potencjalnie zaangażowanych w oddziaływanie z kwasem sjalowym: dwóch reszt argininy w poz. 52 i 114 oraz reszty kwasu glutaminowego w poz. 54 i kwasu asparaginowego w poz. 125. Analiza wiązania mutantów Regionu II do erytrocytów, wykazała, że zamiana reszt argininy (R52 i R114) na resz­ty alaniny lub lizyny spowodowała wiązanie się wariantu VSTK do erytrocytów traktowanych neuraminidazą oraz erytrocytów typu Gerbich. Na tej podstawie wysunięto przypuszczenie, że reszty R52, R114 oraz T121 Regionu II liganda EBA-140 uczestniczą w wiązaniu kwasu sjalowego i decydują o swoistości wiązania wobec GPC.
Wyniki dowodzące, że jedynie polimorficzny wariant VSTK liganda EBA-140 wiąże się do glikoforyny C, zostały jednak podważone [26]. Stosując immunoblotting z uży­ciem błon erytrocytów wykazano wiązanie wszystkich pięciu polimorficznych wariantów liganda EBA-140 do GPC. Wykazano również, że żaden z wariantów nie wiąże się do erytrocytów traktowanych neuraminidazą i trypsy­ną oraz do krwinek o fenotypach Gerbich, Yus, Yus/Ger­bich, które mają wariantowe postaci GPC. Stwierdzono, że polimorfizm Regionu II nie wpływa na swoistość liganda EBA-140 wobec receptora, którym jest GPC, a jedynie na powinowactwo. Sprzeczne wyniki można wytłumaczyć tym, że w pierwszym przypadku użyto rekombinowanych form Regionu II białka EBA-140 poddanych ekspresji w ko­mórkach COS7 [30] lub CHO-K1 [34], natomiast w drugim przypadku natywnym białkiem EBA-140 pochodzącym z nadsącza hodowlanego różnych klonów P. falciparum.
Obserwowany spadek wiązania liganda EBA-140 do krwi­nek o fenotypie Gerbich [26,27,33] sugerował istotny udział fragmentu łańcucha polipeptydowego GPC ko­dowanego przez ekson 3 (r. a. 36-63). Wynik ten nie po­twierdził się dla liganda EBA-140 pochodzącego z nad­sączu hodowlanego klonu 3D7 (wariant INKK), który wiązał się nawet silniej do erytrocytów typu Gerbich, niż do prawidłowych erytrocytów [25]. Spadek wiązania tego liganda zaobserwowano natomiast w przypadku wariantowych erytrocytów o fenotypie Yus. Otrzyma­ne wyniki wskazywały zatem, że reszty aminokwaso­we w poz. 17-35, nieobecne w GPC typu Yus, są istotne w wiązaniu liganda EBA-140, a nie reszty w poz. 36-63, nieobecne w GPC typu Gerbich, jak wskazano poprzed­nio. Jednakże za tezą, że region glikoforyny C obejmu­jący reszty aminokwasowe 36-63 ma znaczenie w wią­zaniu liganda EBA-140, przemawia to, że na obszarach endemicznych malarii, takich jak Papua-Nowa Gwinea, prawie 50% populacji posiada erytrocyty typu Gerbich, z delecją tego fragmentu [27]. Prawdopodobnie muta­cja ta jest wynikiem ewolucyjnej ochrony przed inwazją P. falciparum. Sprzeczności dotyczące udziału łańcucha polipeptydowego GPC w wiązaniu liganda EBA-140, wy­magają dalszych badań, które są prowadzone również w naszym laboratorium.
Głównym problemem jest jednak udział łańcuchów cu­krowych GPC w wiązaniu białka EBA-140. Przyjmuje się, że zewnątrzbłonowy fragment GPC ma 12 usjalowanych łańcuchów O-glikozydowych związanych z resztami sery­ny i treoniny oraz jeden złożony łańcuch N-glikozydowy związany z resztą asparaginy w poz. 8 [24]. Wykazano, że łańcuch ten jest niezbędny do wiązania białka EBA-140 do GPC [31]. Sugeruje się, że w oddziaływaniu ligand-recep­tor może uczestniczyć klaster usjalowanych łańcuchów N- i O-glikozydowych, przyłączonych do odpowiedniej części łańcucha polipeptydowego glikoforyny C [23,31].
Niedawno, wykorzystując bibliotekę fagową, zawierającą pulę peptydów pochodzących z klonu FCR3 P. falciparum [22], zidentyfikowano syntetyczny peptyd, złożony z 7 reszt aminokwasowych: ETTLKSF, który wiąże się do glikoforyny C. Ponadto wykazano, że peptyd ten hamuje inwazję ery­trocytów ludzkich przez P. falciparum tylko wtedy, gdy gen eba-140 podlega ekspresji. Wynik ten sugerował, że ziden­tyfikowany peptyd powinien odpowiadać sekwencji ami­nokwasowej w obrębie łańcucha polipeptydowego liganda EBA-140, która jest zaangażowana w wiązanie GPC. Okazało się jednak, że znaleziona sekwencja aminokwasowa nie od­powiada żadnemu fragmentowi łańcucha polipeptydowe­go białka EBA-140. Wynik ten jest trudny do wyjaśnienia.
Poznanie struktury krystalicznej rekombinowanego Re­gionu II liganda EBA-140, otrzymanego w bakteriach, po­zwoliło na wyjaśnienie molekularnych podstaw jego od­działywania z receptorem [23,28]. Wykazano, że Region II występuje w roztworze w postaci monomeru (ryc. 2). Dwie domeny: F1 (r. a. 143-422) oraz F2 (r. a. 447-740) są połączone krótkim helikalnym odcinkiem. Każda z do­men zbudowana jest z trzech subdomen i zawiera 12 reszt cysteiny, które tworzą mostki disiarczkowe stabilizujące ich strukturę.
Ryc. 2. Struktura Regionu II liganda EBA-140; A - przestrzenne rozmieszczenie subdomen; B - struktury pojedynczych subdomen; w obrębie domeny F1: subdomena 1- kolor brązowy, subdomena 2 - kolor pomarańczowy, subdomena 3 - kolor ciemnopomarańczowy; w obrębie domeny F2: subdomena 1 - kolor ciemnoniebieski, subdomena 2 - kolor niebieski, subdomena 3 - kolor jasnoniebieski; region łączący (linker) - kolor szary (wg [23], zmodyfikowano)

Chociaż Region II liganda EBA-140 jest strukturalnie po­dobny do domen wiążących innych białek DBL, w tym na­leżących do P. vivax i P. knowlesi, to można wskazać pewne różnice. W obrębie Regionu II białka EBA-140 dwa mostki disiarczkowe utworzone zostały według odmiennego wzo­ru. Połączenia tworzą reszty cysteiny w poz. 7 i 8 oraz 9 i 12, zamiast reszt C7 i C9 oraz C8 i C12. W odróżnieniu od RII homologicznego liganda EBA-175, który zawiera dwa odpowiedzialne za dimeryzację przeciwrównoległe skręty ß o strukturze „spinki do włosów" [44], ligand EBA-140 ma taką strukturę jedynie w obrębie domeny F1. W domenie F2 zastępuje ją natomiast nowy α-helikakalny segment. Ligand EBA-140 nie ma również charakterystycznego dla domeny DBL „supła" w subdomenie 3 domeny F1, co jest spowodowane brakiem jednej reszty glicyny. Brak tego „supła" znacznie zmienia kąt nachylenia między dome­nami F1 i F2, co ogranicza możliwość ruchu, uniemożli­wiając dimeryzację liganda EBA-140.
Struktura krystaliczna Regionu II białka EBA-140 otrzy­mana w obecności α(2,3)-sjalolaktozy potwierdziła, że ligand ten wiąże się do receptora również jako monomer [28]. Ustalono, że Region II zawiera dwie kieszenie wią­żące kwas sjalowy, przy czym każda z nich znajduje się wewnątrz odrębnej domeny, F1 lub F2. Kieszenie obejmu­ją rejon o dużym zagęszczeniu dodatnio naładowanych reszt aminokwasowych, przypuszczalnie ułatwiających oddziaływanie z kwasem sjalowym, który wnika do wnę­trza kieszeni (ryc. 3).
Ryc. 3. Miejsca wiążące kwas sjalowy w domenie F1 i F2 Regionu II EBA-140; A - cząsteczki kwasu sjalowego w ramkach zaznaczono kolorem zielonym; B - przestrzenne rozmieszczenie wiązanego glikanu w obrębie kieszeni wiążących; reszta kwasu sjalowego (kolor czerwony) wnika w głąb kieszeni, a pierścień galaktozy wystaje na zewnątrz; domena F1 - kolor pomarańczowy; domena F2 - kolor niebieski; region łączący (linker) - kolor szary (według [28], zmodyfikowano)

Cząsteczka kwasu sjalowego zawiera pierścień pirano­zowy, grupę karboksylową, resztę glicerolu oraz grupę acetyloamidową. Ustalono, że reszty aminokwasowe za­angażowane w wiązanie kwasu sjalowego są odmienne w każdej z domen (ryc. 4). W kieszeni domeny F1 reszta Q182 tworzy wiązania van der Waalsa z grupą karboksy­lową kwasu sjalowego. Reszta R158 oddziałuje z łańcu­chem glicerolu poprzez wiązania wodorowe oraz z grupą hydroksylową poprzez wiązania van der Waalsa. Po prze­ciwnej stronie kieszeni, położona w obrębie helisy, reszta N251 tworzy wiązanie wodorowe z grupą hydroksylową C-4 pierścienia piranozowego i jest zwrócona w stronę grupy acetyloamidowej. Położone na spodzie kieszeni reszty I181 oraz I185 oddziałują z hydrofobową częścią cukru.
Ryc. 4. Reszty aminokwasowe zaangażowane w wiązanie kwasu sjalowego przez RII EBA-140; A - kieszeń wiążąca domeny F1 (kolor pomarańczowy); B - kieszeń wiążąca domeny F2 (kolor niebieski); cząsteczki kwasu sjalowego (kolor zielony) (według [28], zmodyfikowano)

Mimo że kieszeń domeny F2 ma podobną strukturę, w wiązaniu kwasu sjalowego uczestniczą inne reszty ami­nokwasowe (ryc. 4). Reszta N457, położona w obrębie pętli umiejscowionej w górnej części kieszeni domeny F2, two­rzy wiązania van der Waalsa z grupą karboksylową kwasu. Reszta K464 oddziałuje z łańcuchem glicerolu, tworząc wiązania wodorowe oraz wiązania van der Waalsa z grupą hydroksylową. Za oddziaływania hydrofobowe odpowiada reszta T487 zlokalizowana na spodzie kieszeni domeny F2. Położona po przeciwnej stronie w obrębie helisy reszta Y556 wchodzi w hydrofobowe oddziaływania z grupą ace­tyloamidową kwasu sjalowego.
W celu potwierdzenia roli w wiązaniu kwasu sjalowego wymienione reszty aminokwasowe obu domen F1 i F2 zo­stały zastąpione w wyniku mutagenezy resztami alaniny. Mutacje pojedynczych reszt kieszeni wiążącej domeny F1 spowodowały obniżenie lub brak wiązania RII EBA-140 do erytrocytów wskazując, że domena F1 jest niezbędna do wiązania receptora. Wykazano, że reszta I181 jest odpo­wiedzialna za utrzymanie poprawnej konformacji miejsca wiążącego oraz oddziaływania hydrofobowe z glikanem, zaś helisa zawierająca resztę N251 wspomaga wiązanie glikanu oraz stabilizuje strukturę kieszeni. Zamiana reszt R158, Q182 i I181 znosiła wiązanie Regionu II do erytro­cytów, wskazując, że reszty te są kluczowe dla wiązania.
Mutacje reszt wiążących kieszeni domeny F2 tylko w nie­wielkim stopniu wpłynęły na wiązanie liganda do erytro­cytów. Wcześniej zauważono natomiast, że zamiana reszt R485 oraz D554 domeny F2, które są położone w bliskim sąsiedztwie miejsca wiążącego, na alaninę znacząco ob­niżyła wiązanie Regionu II do erytrocytów [23]. Zaburze­nie rozkładu ładunków wewnątrz kieszeni wiążącej miało również negatywny wpływ na wiązanie. Zaobserwowano, że zamiana reszt K464 lub Y556 na resztę kwasu glutami­nowego obniżyło wiązanie o około 30%. Zmiana ładunku na ujemny przypuszczalnie powoduje odpychanie kwasu sjalowego i w ten sposób obniża wiązanie.
Stwierdzone różnice w oddziaływaniach domen F1 i F2 Regionu II EBA-140 wskazują na ich odmienne role w wią­zaniu receptora. Uważa sie, że chociaż obie domeny są konieczne do wiązania, tylko domena F1 uczestniczy bezpośrednio w oddziaływaniu z receptorem. Na uwagę zasługuje to, że jedna z czterech reszt polimorficznych (I185) domeny F1 liganda EBA-140, znajduje się w obrę­bie kieszeni wiążącej kwas sjalowy. Wcześniej wykazano, że zamiana tej reszty na resztę waliny skutkuje obniże­niem wiązania do erytrocytów i glikoforyny C [23]. Wynik ten można wytłumaczyć tym, że reszta I185 uczestniczy w tworzeniu kontaktu z kwasem sjalowym oraz utrzyma­niu odpowiedniego kształtu kieszeni wiążącej domeny F1. Wykazano, że zastąpienie in silico tej reszty izoleucy­ny waliną zmienia wewnętrzną powierzchnię kieszeni i osłabia jej przestrzenne dopasowanie do cząsteczki kwa­su sjalowego. Potwierdza to, że polimorfizm 185 reszty aminokwasowej domeny F1 rzeczywiście ma wpływ na powinowactwo liganda do receptora, a być może decy­duje również o jego swoistości.
Omówione szczegółowo wyniki dotyczące struktury re­gionu wiążącego liganda EBA-140 P. falciparum wskazały, że dwie kieszenie wiążące kwas sjalowy oraz mechanizm wiązania glikanu są unikalne wśród innych białek z rodzi­ny DBL, w tym homologicznego liganda EBA-175 P. falci­parum i DBP P. vivax [4,44]. Wiązanie glikanu przez białka PvDBP oraz EBA-175 wymaga bowiem ich dimeryzacji. Ligand PvDBP występuje w postaci monomeru i dopiero w obecności receptora DARC tworzy dimer. Również di­meryzacja liganda EBA-175 zachodzi w obecności recepto­ra - glikoforyny A i jest niezbędna do wiązania. Natomiast Region II liganda EBA-140 występuje jedynie w formie monomeru i dlatego może wiązać tylko dwie cząsteczki glikanu, podczas gdy dimer EBA-175 wiąże aż sześć O-gli­kanów GPA. Przypuszczalnie ma to bezpośredni wpływ na powinowactwo obu ligandów odpowiednio do GPC i GPA.
Otrzymywanie rekombinowanego regionu wiążącego liganda EBA-140
Głównym ograniczeniem w badaniach nad ligandami P. falciparum z rodziny EBL są problemy z otrzymaniem rozpuszczalnych, poprawnie sfałdowanych i funkcjonal­nych rekombinowanych białek w większych ilościach [5]. Spowodowane jest to ich znacznym rozmiarem oraz zawartością licznych mostków disiarczkowych. Doświad­czenia, mające na celu wyjaśnienie molekularnych pod­staw oddziaływania ligandów EBL z receptorami na erytrocytach były prowadzone głównie z użyciem bia­łek uzyskanym bezpośrednio z nadsącza hodowlanego merozoitów. Niestety tylko niektóre z białek mogą być otrzymywane z wystarczającą wydajnością bezpośred­nio z hodowli komórek naturalnego gospodarza. Ko­nieczne jest więc stosowanie heterologicznych syste­mów ekspresji.
Białka merozoitów z rodziny EBL są zbyt duże, by mo­gły być poddane ekspresji w całości. Otrzymano jedynie regiony wiążące białek EBA-175 oraz EBA-140. Rekombi­nowany, pełny Region II, a także pojedyncze domeny F1 i F2, liganda EBA-140, zostały poddane ekspresji w ko­mórkach CHO-K1 [18], COS7 [29,33] oraz HEK - 293T [23]. Zaletą tych eukariotycznych systemów ekspresji było uzyskanie rekombinowanych białek mających natywną konformację, jednak poważnym ograniczeniem była ich nierozpuszczalna, związana z powierzchnią błony komór­kowej forma.
Rekombinowany Region II antygenu EBA-140 otrzymano w komórkach E. coli w postaci ciałek inkluzyjnych [23]. Otrzymanie rozpuszczalnego RII wymagało wstępnego rozpuszczenia ciałek inkluzyjnych w warunkach dena­turujących, a następnie renaturacji rekombinowanego białka poprzez gwałtowne rozcieńczenie w obecności zre­dukowanego i utlenionego glutationu. Tak otrzymane białko zostało poddane krystalizacji.
Poprawne fałdowanie rekombinowanego Regionu II ligan­da EBA-140 oraz prostotę oczyszczania zapewniło nato­miast użycie systemu bakulowirusowego [19]. Wydzielane do pożywki hodowlanej komórek owadzich rekombino­wane białko zostało bezpośrednio oczyszczone z medium metodą chromatografii powinowactwa [21]. System eks­presji w komórkach owadzich zwiększa szansę na otrzy­manie poprawnie sfałdowanych i rozpuszczalnych, re­kombinowanych białek z dużą wydajnością, nawet takich, których otrzymanie w innych systemach jest niemożliwe. Umożliwia również potranslacyjną modyfikację białek, w tym glikozylację, fosforylację oraz tworzenie mostków disiarczkowych.
Rekombinowany Region IIliganda EBA-140 wiąże się do glikoforyny C
W celu sprawdzenia, czy rekombinowany Region II EBA- 140 otrzymany w systemie bakulowirusowym (Gene­script) jest funkcjonalny posłużyliśmy się metodą im­munoblottingu.
Region II wiązano do membran ludzkich erytrocytów oraz do oczyszczonej glikoforyny C, immobilizowanych na błonie nitrocelulozowej (ryc. 5). W przypadku mem­bran erytrocytów zaobserwowano dwa prążki, z których dolny odpowiadał monomerowi glikoforyny C, a górny tworzonym przez nią agregatom. Wiązanie Regionu II do oczyszczonej GPC było widoczne w postaci dwóch, nie­znacznie oddalonych od siebie prążków, które migrowa­ły niżej niż prążek odpowiadający GPC w membranach. Wynika to przypuszczalnie z częściowej degradacji GPC podczas oczyszczania.
Ryc. 5. Wiązanie rekombinowanego Regionu II EBA-140 (Genescript) do membran erytrocytów ludzkich oraz oczyszczonej glikoforyny C metodą immunoblottingu; Mem - membrany erytrocytów; GPC - oczyszczona glikoforyna C

Wykazano zatem, że rekombinowany Region II liganda EBA-140 P. falciparum, otrzymany w systemie bakulowi­rusowym, jest funkcjonalny i wiąże się swoiście do gli­koforyny C.
Podsumowanie
Ligand EBA-140 P. falciparum należący do rodziny białek EBL merozoitów wiąże się do glikoforyny C erytrocytów ludzkich. Dalszych badań wymaga jednak szczegółowe poznanie struktury i lokalizacji miejsca receptorowego dla liganda EBA-140 na glikoforynie C, ze szczególnym uwzględnieniem udziału łańcuchów cukrowych oraz reszt aminokwasowych łańcucha polipeptydowego GPC.
Badania te mogą mieć potencjalne znaczenie dla hamowa­nia drogi inwazji erytrocytów ludzkich przez P. falciparum z udziałem liganda EBA-140 i glikoforyny C.
Badania te mogą mieć potencjalne znaczenie dla hamowa­nia drogi inwazji erytrocytów ludzkich przez P. falciparum z udziałem liganda EBA-140 i glikoforyny C.
PIŚMIENNICTWO
[1] Adams J.H., Blair P.L., Kaneko O., Peterson D.S.: An expanding ebl family of Plasmodium falciparum. Trends Parasitol., 2001; 17: 297-299
[PubMed]  [Full Text HTML]  
[2] Adams J.H., Sim B.K., Dolan S.A., Fang X., Kaslow D.C., Miller L.H.: A family of erythrocyte binding proteins of malaria parasites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992; 89: 7085-7089
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[3] Bannister L.H., Dluzewski A.R.: The ultrastructure of red cell invasion in malaria infections: a review. Blood Cells, 1990; 16: 257-292
[PubMed]  
[4] Batchelor J.D., Zahm J.A., Tolia N.H.: Dimerization of Plasmodium vivax DBP is induced upon receptor binding and drives recognition of DARC. Nat. Struct. Mol. Biol., 2011; 18: 908-914
[PubMed]  
[5] Birkholtz L.M., Blatch G., Coetzer T.L., Hoppe H.C., Human E., Morris E.J., Ngcete Z., Oldfield L., Roth R., Shonhai A., Stephens L., Louw A.I.: Heterologous expression of plasmodial proteins for structural studies and functional annotation. Malar. J., 2008; 7: 197
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[6] Cartron J.P., Le Van Kim C., Colin Y.: Glycophorin C and related glycoproteins: structure, function, and regulation. Semin. Hematol., 1993; 30: 152-168
[PubMed]  
[7] Chasis J.A., Mohandas N.: Red blood cell glycophorins. Blood, 1992; 80: 1869-1879
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[8] Cowman A.F., Berry D., Baum J.: The cellular and molecular basis for malaria parasite invasion of the human red blood cell. J. Cell Biol., 2012; 198: 961-971
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[9] Cowman A.F., Crabb B.S.: Invasion of red blood cells by malaria parasites. Cell, 2006; 124: 755-766
[PubMed]  [Full Text HTML]  
[10] Epidemiological surveillance of malaria in countries of central and eastern Europe and selected newly independent states. Report on a WHO intercountry meeting. 2002, Sofia, Bulgaria (15.07.2013)
http://www.euro.who.int/__data/assets/pdf_file/0006/98781/E77302.pdf
[11] Feachem R.G., Phillips A.A., Hwang J., Cotter C., Wielgosz B., Greenwood B.M., Sabot O., Rodriguez M.H., Abeyasinghe R.R., Ghebreyesus T.A., Snow R.W.: Shrinking the malaria map: progress and prospects. Lancet, 2010; 376: 1566-1578
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[12] Gaur D., Mayer D.C., Miller L.H.: Parasite ligand-host receptor interactions during invasion of erythrocytes by Plasmodium merozoites. Int. J. Parasitol., 2004; 34: 1413-1429
[PubMed]  [Full Text HTML]  
[13] Global Malaria Programme. WHO World Malaria Report 2012 (15.07.2013)
http://www.who.int/malaria/publications/world_malaria_report_2012/wmr2012_no_profiles.pdf
[14] Goljan J., Felczak-Korzybska I., Nahorski W.L., Myjak P.: Malaria relapse and recrudescence among travellers to the tropics. Int. Marit. Health, 2003; 54: 92-100
[PubMed]  
[15] Greenwood B.M., Fidock D.A., Kyle D.E., Kappe S.H., Alonso P.L., Collins F.H., Duffy P.E.: Malaria: progress, perils, and prospects for eradication. J. Clin. Invest., 2008; 118: 1266-1276
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[16] Grobusch M.P., Kremsner P.G.: Uncomplicated malaria. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 2005; 295: 83-104
[PubMed]  
[17] Jaśkiewicz E.: Glikoforyny ludzkich erytrocytów jako receptory dla zarodźca sierpowego malarii (Plasmodium falciparum). Postępy Hig. Med. Dośw., 2007; 61: 718-724
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[18] Jiang L., Duriseti S., Sun P., Miller L.H.: Molecular basis of binding of the Plasmodium falciparum receptor BAEBL to erythrocyte receptor glycophorin C. Mol. Biochem. Parasitol., 2009; 168: 49-54
[PubMed]  [Full Text HTML]  
[19] Kelly B.J., King L.A, Possee R.D.: Baculovirus and insect cell expression protocols. Humana Press, Totowa, New Jersey, USA, 2007
http://www.springer.com/life+sciences/biochemistry+%26+biophysics/book/978-1-58829-537-8
[20] Knap J.P., Myjak P.: Malaria w Polsce i na świecie. Alfa Medica Press, 2009
[21] Kobayashi K., Kato K., Sugi T., Takemae H., Pandey K., Gong H., Tohya Y., Akashi H.: Plasmodium falciparum BAEBL binds to heparan sulfate proteoglycans on the human erythrocyte surface. J. Biol. Chem., 2010; 285: 1716-1725
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[22] Li X., Chen H., Khan A.A., Lauterbach S.B., Lanzillotti R., Rai P.R., Kane R.S., Coetzer T.L., Chishti A.H.: Receptor-based identification of an inhibitory peptide against blood stage malaria. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2008; 376: 489-493
[PubMed]  [Full Text HTML]  
[23] Lin D.H., Malpede B.M., Batchelor J.D., Tolia N.H.: Crystal and solution structures of Plasmodium falciparum erythrocyte-binding antigen 140 reveal determinants of receptor specificity during erythrocyte invasion. J. Biol. Chem., 2012; 287: 36830-36836
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[24] Lisowska E.: Antigenic properties of human erythrocyte glycophorins. Adv. Exp. Med. Biol., 1988; 228: 265-315
[PubMed]  
[25] Lobo C.A., Rodriguez M., Reid M., Lustigman S.: Glycophorin C is the receptor for the Plasmodium falciparum erythrocyte binding ligand PfEBP-2 (baebl). Blood, 2003; 101: 4628-4631
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[26] Maier A.G., Baum J., Smith B., Conway D.J., Cowman A.F.: Polymorphisms in erythrocyte binding antigens 140 and 181 affect function and binding but not receptor specificity in Plasmodium falciparum. Infect. Immun., 2009; 77: 1689-1699
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[27] Maier A.G., Duraisingh M.T., Reeder J.C., Patel S.S., Kazura J.W., Zimmerman P.A., Cowman A.F.: Plasmodium falciparum erythrocyte invasion through glycophorin C and selection for Gerbich negativity in human populations. Nat. Med., 2003; 9: 87-92
[PubMed]  
[28] Malpede B.M., Lin D.H., Tolia N.H.: Molecular basis for sialic acid-dependent receptor recognition by the Plasmodium falciparum invasion protein erythrocyte-binding antigen-140/BAEBL. J. Biol. Chem., 2013; 288: 12406-12415
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[29] Martin M.J., Rayner J.C., Gagneux P., Barnwell J.W., Varki A.: Evolution of human-chimpanzee differences in malaria susceptibility: relationship to human genetic loss of N-glycolylneuraminic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005; 102: 12819-12824
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[30] Mayer D.C., Cofie J., Jiang L., Hartl D.L., Tracy E., Kabat J., Mendoza L.H., Miller L.H.: Glycophorin B is the erythrocyte receptor of Plasmodium falciparum erythrocyte-binding ligand, EBL-1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2009; 106: 5348-5352
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[31] Mayer D.C., Jiang L., Achur R.N., Kakizaki I., Gowda D.C., Miller L.H.: The glycophorin C N-linked glycan is a critical component of the ligand for the Plasmodium falciparum erythrocyte receptor BAEBL. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006; 103: 2358-2362
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[32] Mayer D.C., Kaneko O., Hudson-Taylor D.E., Reid M.E., Miller L.H.: Characterization of a Plasmodium falciparum erythrocyte-binding protein paralogous to EBA-175. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001; 98: 5222-5227
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[33] Mayer D.C., Mu J.B., Feng X., Su X.Z., Miller L.H.: Polymorphism in a Plasmodium falciparum erythrocyte-binding ligand changes its receptor specificity. J. Exp. Med., 2002; 196: 1523-1528
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[34] Miller L.H., Ackerman H.C., Su X.Z., Wellems T.E.: Malaria biology and disease pathogenesis: insights for new treatments. Nat. Med., 2013; 19: 156-167
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[35] Miller L.H., Baruch D.I., Marsh K., Doumbo O.K.: The pathogenic basis of malaria. Nature, 2002; 415: 673-679
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[36] Narum D.L., Fuhrmann S.R., Luu T., Sim B.K.: A novel Plasmodium falciparum erythrocyte binding protein-2 (EBP2/BAEBL) involved in erythrocyte receptor binding. Mol. Biochem. Parasitol., 2002; 119: 159-168
[PubMed]  [Full Text HTML]  
[37] Orlandi P.A., Klotz F.W., Haynes J.D.: A malaria invasion receptor, the 175-kilodalton erythrocyte binding antigen of Plasmodium falciparum recognizes the terminal Neu5Ac(α2-3)Gal- sequences of glycophorin A. J. Cell Biol., 1992; 116: 901-909
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[38] Riglar D.T., Richard D., Wilson D.W., Boyle M.J., Dekiwadia C., Turnbull L., Angrisano F., Marapana D.S., Rogers K.L., Whitchurch C.B., Beeson J.G., Cowman A.F., Ralph S.A., Baum J.: Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte. Cell Host Microbe, 2011; 9: 9-20
[PubMed]  [Full Text HTML]  
[39] Sherman I.W.: Molecular Approaches to Malaria. ASM Press, Washington, DC, 2005
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1860520/pdf/1228.pdf
[40] Sim B.K.: EBA-175: an erythrocyte-binding ligand of Plasmodium falciparum. Parasitol. Today, 1995; 11: 213-217
[PubMed]  [Full Text HTML]  
[41] Sim B.K., Chitnis C.E., Wasniowska K., Hadley T.J., Miller L.H.: Receptor and ligand domains for invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum. Science, 1994; 264: 1941-1944
[PubMed]  
[42] Tham W.H., Healer J., Cowman A.F.: Erythrocyte and reticulocyte binding-like proteins of Plasmodium falciparum. Trends Parasitol., 2012; 28: 23-30
[PubMed]  [Full Text HTML]  
[43] Thompson J.K., Triglia T., Reed M.B., Cowman A.F.: A novel ligand from Plasmodium falciparum that binds to a sialic acid-containing receptor on the surface of human erythrocytes. Mol. Microbiol., 2001; 41: 47-58
[PubMed]  [Full Text HTML]  
[44] Tolia N.H., Enemark E.J., Sim B.K., Joshua-Tor L.: Structural basis for the EBA-175 erythrocyte invasion pathway of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Cell, 2005; 122: 183-193
[PubMed]  [Full Text HTML]  
Autorki deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.