Postepy Hig Med Dosw. (online), 2013; 67: 1128-1143
Review
Full Text PDF  

Szczepionki podjednostkowe - antygeny, nośniki, metody koniugacji i rola adiuwantów
Subunit vaccines - antigens, carriers, conjugation methods and the role of adjuvants
Anna Jarząb1*  , Michał Skowicki1,2**  , Danuta Witkowska1  
1Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN im. L. Hirszfelda we Wrocławiu
2Wrocławskie Centrum Badań EIT+
Adres do korespondencji
dr hab. Danuta Witkowska, Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN im. L. Hirszfelda, ul. R. Weigla 12, 53-114 Wrocław; email: witkows@iitd.pan.wroc.pl

Źródło finansowania
* Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego.
** Publikacja współfinansowana ze środków Wrocławskiego Centrum Badań EIT+ w ramach realizacji projektu NanoMat - „Wykorzystanie nanotechnologii w nowoczesnych materiałach" (POIG.01.01.02-02-002/08) współ­finansowanego ze środków Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego (Program Operacyjny Innowacyjna Gospodarka, Poddziałanie 1.1.2).

Otrzymano:  2013.07.30
Zaakceptowano:  2013.09.13
Opublikowano:  2013.11.27

Streszczenie
Szczepionki chroniące przed rozwojem chorób zakaźnych są skutecznym narzędziem w walce z mi­kroorganizmami chorobotwórczymi. Obecnie dysponujemy preparatami chroniącymi przed zaka­żeniami, których standardowe leczenie jest nie tylko trudne, lecz często niemożliwe ze względu na ciągle postępujący wzrost oporności drobnoustrojów na wiele dostępnych antybiotyków. Wśród preparatów, które znalazły zastosowanie w profilaktyce zakażeń są szczepionki tradycyjne zawiera­jące żywe, zabite lub osłabione szczepy drobnoustrojów. Niemniej jednak należy zauważyć, że takie szczepionki nie zawsze są skuteczne, szczególnie wtedy, gdy oczekujemy wzbudzenia specyficznej odpowiedzi odpornościowej skierowanej przeciwko określonym antygenom. W ostatnim czasie coraz większe zainteresowanie zyskują szczepionki podjednostkowe, należące do szczepionek nowej gene­racji. Szczepionki te zawierają wysoce oczyszczone, immunogenne antygeny stanowiące fragmenty patogennych mikroorganizmów. Zastosowanie tego typu antygenów wyklucza przede wszystkim ryzyko rozwoju zakażenia poszczepiennego, a także gwarantuje posługiwanie się preparatem o do­brze zbadanym i zdefiniowanym składzie. Zastosowanie antygenu o znanym składzie chemicznym w szczepionce podjednostkowej będzie przebiegało w sposób ściśle kontrolowany i będzie mini­malizowało występowanie działań niepożądanych, związanych z zastosowaniem całych komórek. W pracy omówiono najbardziej obiecujące i najczęściej testowane antygeny i nośniki szczepionek, które są brane pod uwagę przy konstrukcji szczepionek podjednostkowych. Przedstawiono także metody ich koniugacji i dostarczania do komórek układu immunologicznego. Ponadto opisano wady i zalety adiuwantów, stanowiących substancje wspomagające odpowiedź odpornościową, które zna­lazły zastosowanie w preparatach przeznaczonych dla ludzi. Podkreślono także zależność między skutecznością a mechanizmem ich działania, co ma kluczowe znaczenie we wzbudzeniu odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko konkretnym patogenom.
Słowa kluczowe: odporność • szczepionka • koniugat • szczepionki podjednostkowe • adiuwanty


Summary
Vaccines are effective tools protecting against the development of infectious diseases caused by pathogenic microorganisms. Currently, we have vaccines protecting against many infections, where standard therapy is not only difficult but often impossible due to the ever-progressive in­crease in bacterial resistance to many available antibiotics. Among vaccines which have been used in the prevention of infection are the traditional vaccines containing live, killed or attenuated strains of microorganisms. However, it should be noted that such vaccines are not always effective, espe­cially when the expected immune response is directed against specific antigens. Subunit vaccines belong to new generation vaccines and have gained more and more interest in recent years. These vaccines contain fragments of pathogenic microorganisms, which are highly purified and immu­nogenic antigens. Using these purified antigens excludes the risk of post-vaccination infection. In addition, subunit vaccines minimize side-effects associated with the use of whole bacterial cells. The paper discusses the most promising and the most tested antigens, vaccine carriers, conjuga­tion methods and vaccine delivery systems which are being used in the design of subunit vaccines. This paper also highlights the advantages and disadvantages of adjuvants, which are substances to support the immune response in humans, and the relationship between adjuvants' efficacy and their mechanism of action.
Key words: immunity • vaccine • conjugate • subunit vaccines • adjuvants




Wykaz skrótów:
APC - komórki prezentujące antygeny (antigen presenting cells); AS - system nazewnictwa adiu-wantów (adjuvant system); BCG - Bacillus Calmette-Guérin; BSA - albumina surowicy bydlęcej (bovine serum albumin); BSCOES - bis [2-(sukcynimidooksykarbonylooksy)etylo]sulfon (bis[2­-(succinimidooxycarbonyloxy)ethyl]-sulfone); CCL - ligand dla chemokin zawierający motyw C-C (chemokine (C-C motif) ligand); CD - antygen różnicowania komórkowego (cluster of diffe­rentiation); CDAP - tetrafluoroboran 1-cyjano-4-dimetyloaminopirydyny (1-cyano-4-dimethy­laminopyridinium tetrafluoroborate); CMC - N-cykloheksylo-N'-(2-morfolinoetylo) karbodiimid (l-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl) carbodiimide); CNBR - bromocyjan (cyanogen bromide); CpG - niemetylowane CpG (non-methylated CpG); CPPs - peptydy penetrujące błony (cell-pe­netrating peptides); CSF - czynnik stymulujący tworzenie kolonii (colony-stimulating factor); CXCL - ligand chemokin zawierający motyw C-X-C (chemokine (C-X-C motif) ligand); DCC - N,N'­-dicykloheksylokarbodiimid (N,N'-dicyclohexyl carbodiimide); DDA - dimetyl bromku dioctade­cyloamonowego (dimethyl dioctadecylammonium bromide); DIC - N,N'-diizopropylokarbodiimid (N,N'-diisopropyl carbodiimide); DSG - glutaran di(N-sukcynimidylu) (di(N-succinimidyl) glutarate); DSP - ditiobis[propionian sukcynimidylu] (dithiobis[succinimidyl propionate]); DSS - suberynian disukcynimidylu (disuccinimidyl suberate); DST - winian disukcynimidylu (disuccinimidyl tartarate); DTSSP - 3,3'-ditiobis(propionian sulfosukcynimidylu) (3,3'-dithiobis (sulfosuccinimidylpropiona­te)); DTT - ditiotreitol (dithiothreitol); EDC - N-(3-dimetyloaminopropylo)-N'-etylokarbodiimid (N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide); EGS - bis(sukcynimidylobursztynian) glikolu etylenowego (ethylene glycol bis[succinimidylsuccinate]); HBV - wirus zapalenia wątroby typu B (hepatitis B virus); HIV - ludzki wirus niedoboru odporności (human immunodeficiency virus); HPV - ludzki wirus brodawczaka (human papilloma virus); IFN - interferon (interferon); IgG - prze­ciwciało klasy IgG (immunoglobulin G); IL - interleukina (interleukin); KLH - hemocyjanina (keyhole limpet hemocyanin); LPS - lipopolisacharyd (lipopolysaccharide); MBS - ester m-maleimidoben­zoilo-N-hydroksysukcynimidu (m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester); MCP - białko chemotaktyczne monocytów (monocyte chemotactic protein); MHC - główny układ zgodności tkankowej (major histocompatibility complex); MIP-1ß - białko zapalne makrofagów 1ß (macro­phage inflammatory protein 1ß); MPL - monofosforylowany lipid A (monophosphoryl lipid A); NF-κß - czynnik jądrowy NF-κß (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells); NHS - N-hydroksysukcynimid (N-hydroxysuccinimide); OMPs - białka błony zewnętrznej (outer membrane proteins); OVA - owoalbumina (ovalbumin); PAMP - molekularne wzorce patogenów (patogen associated molecular patterns); PEG - glikol polietylenowy (polyethylene glycol); PEI - polietylenoimina (polyethyleneimine); PLGA - poli(laktydo-koglikolid) (poly(lactide-coglycolide)); SMPB - N-sukcynimidylo-4-(p-maleimidofenylo)-maślan (N-succinimidyl-4-(p-maleimidopheny­l)-butyrate); SPDP - ester N-hydroksysukcynimidowy kwasu 3-(2-pirydyloditio)propionowego (3-(2-pyridyldithio)propionic acid N-hydroxysuccinimide ester); SucPG - bursztynianowany poli­(glicydol) (succinylated poly(glycidol)); Sulfo-DSS - suberynian disulfosukcynimidylu (disulfosucci­nimidyl suberate); Sulfo-EGS - bis(sulfosukcynimidylobursztynian) glikolu etylenowego (ethylene glycol bis[sulfosuccinimidylsuccinate]); Sulfo-EGS - bis(sulfosukcynimidylobursztynian) glikolu etylenowego (ethylene glycol bis[sulfosuccinimidylsuccinate]); Sulfo-NHS - N-hydroksysulfosuk­cynimid N-hydroxysulfosuccinimide; sulfo-SMCC - sulfo-sukcynimidylo-4-(N-meleimidometylo) cykloheksylokarboksylan (sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate); Th - limfocyt pomocniczy (T helper cell); TNF - czynnik martwicy guza (tumor necrosis factor); TT - toksoid tężcowy (tetanus toxoid); WNV - wirus Nilu Zachodniego (West Nil Virus); WZWB - wirusowe zapalenie wątroby typu B (hepatitis B).
Wstęp
Zastosowanie szczepionek i wprowadzenie obowiązkowych szczepień ochronnych w ciągu ostatnich 200 lat pozwoliło na opanowanie, a w większości regionów na świecie na zu­pełną eliminację dziewięciu groźnych chorób zakaźnych. Poczynając od pierwszej szczepionki przeciwko ospie praw­dziwej, opracowanej w 1798 r. przez Edwarda Jennera, która przyczyniła się do eradykacji ospy prawdziwej, za równie skuteczne można uznać te chroniące przed błonicą, krztu­ścem, tężcem, żółtą febrą, polio, odrą, świnką i różyczką [20]. Częstotliwość występowania chorób zakaźnych, a także odsetek śmiertelności spowodowany rozwojem większości tych chorób w Stanach Zjednoczonych i Euro­pie Zachodniej, zmniejszyły się o 95-99% w porównaniu z okresem przed wprowadzeniem obowiązkowych szcze­pień ochronnych [52].
Szczepienia, oprócz higieny są najskuteczniejszym sposobem działania w profilaktyce zakażeń. Działanie aktualnie stosowa­nych szczepionek oparte jest na bazie dwóch głównych mecha­nizmów, odpowiedzialnych za wzbudzenie biernej lub czynnej odpowiedzi odpornościowej. Szczepionki wzbudzające ochronę bierną zawierają gotowe przeciwciała skierowane przeciwko konkretnym patogenom lub czynnikom chorobotwórczym i są podawane przed lub po okresie potencjalnego narażenia na zakażenie. Szczepionki chroniące przed rozwojem zakażenia w sposób czynny, zawierają antygeny stymulujące układ immu­nologiczny do wytwarzania swoistych przeciwciał ochronnych (odpowiedź humoralna), pobudzają odpowiedź komórkową (zależną od limfocytów T cytotoksycznych) lub wzbudzają oba te typy odpowiedzi jednocześnie. Do najczęściej używanych i najskuteczniejszych oraz warunkujących długotrwałą ochro­nę przed zakażeniem, należą szczepionki wzbudzające aktyw­ną odpowiedź na antygen. W dziedzinie wakcynologii jednym z najstarszych, tradycyjnych rozwiązań jest stosowanie szcze­pionek zawierających żywe, często atenuowane szczepy bak­teryjne lub składających się z martwych komórek patogenu. Charakteryzuje je duża skuteczność związana z tym, że składa­ją się z wielu różnych komponentów stanowiących elementy komórek bakteryjnych, które wzbudzają odpowiedź układu odpornościowego na wiele antygenów. Mimo skuteczności szczepionki te wzbudzają wiele kontrowersji przede wszyst­kim dlatego, że potencjalnie niosą ryzyko zakażenia [tabela 1]. Dziać się tak może wskutek rewersji atenuowanego szczepu i powrotu do jego patogennej postaci, a także wskutek przy­padkowego zakażenia osób trzecich w wyniku niekontrolowa­nego przeniesienia wirulentnego szczepu. Szczepionki takie nie są także w żadnym stopniu standaryzowane, a w ich skład wchodzi szeroki panel antygenów pochodzących z żywych, osłabionych lub zabitych drobnoustrojów.
Tabela 1. Zestawienie zalet i wad szczepionek różnego typu [1,19,25]

Obecnie coraz większą uwagę, a także zaangażowanie bada­czy skupia się na szczepionkach podjednostkowych [tabela 1]. Szczepionki te zawierają oczyszczone, immunogenne an­tygeny wchodzące w skład komórek patogennych mikroor­ganizmów. Zastosowanie tego typu antygenów nie tylko wy­klucza ryzyko zakażenia poszczepiennego, ale pozwala także na posługiwanie się dobrze zbadanym i zdefiniowanym pre­paratem. Zastosowanie go w szczepionce będzie przebiegało w sposób ściśle kontrolowany, minimalizując występowanie działań niepożądanych, które mogą być dużo bardziej nie­bezpieczne w przypadku użycia całych komórek. Odpowiedź odpornościowa, skierowana przeciwko wyselekcjonowanym antygenom, wchodzącym w skład szczepionki podjednostko­wej jest bardzo swoista. Należy jednak zauważyć, że wskutek wykorzystania jedynie jednego z wielu antygenów spada efek­tywność jego działania [1,19,25].
Wzbudzenie długotrwałej ochrony wymaga zatem zastoso­wania kilku dawek przypominających, a także użycia adiu­wantów i nośników wspomagających ich transport, ekspo­zycję i trwałość w warunkach in vivo [tabela 1]. Szczepionki podjednostkowe są najczęściej oparte na białkach, peptydach lub polisacharydach, zawierających immunogenne epitopy wzbudzające odpowiedź układu odpornościowego. Znalezie­nie efektywnego antygenu do szczepionki koniugatowej nie jest proste. Jednym z największych problemów w tej kwestii jest identyfikacja antygenu, który będzie rozpoznawany przez przeciwciała neutralizujące i receptory obecne na powierzch­ni limfocytów B, a jednocześnie stanowiącego epitop, który w kompleksie z cząsteczkami MHC (Major Histocompatibility Complex) będzie prezentowany limfocytom T. Ponadto duże znaczenie ma także dobranie odpowiedniego nośnika, nie tyl­ko umożliwiającego optymalną prezentację antygenu, lecz także przedłużającego czas jego ekspozycji [20]. Zastosowanie metod biologii molekularnej, technologii rekombinacji DNA, biochemii białek, a także mikrobiologii i immunologii daje coraz lepsze rezultaty w konstrukcji swoistych szczepionek podjednostkowych. Rozwój nowoczesnych technologii spra­wił, że poszukiwania antygenów i badania związane z rozwo­jem wielu chorób zakaźnych zaczęto rozpatrywać na poziomie genomowym i proteomicznym. Tak wyselekcjonowane skład­niki szczepionek umożliwiają identyfikację czynników zaan­gażowanych w indukcję odpowiedzi odpornościowej w sposób bezpośredni. Chemiczna synteza antygenów stanowiących se­kwencje epitopów peptydowych lub polisacharydowych, izola­cja konkretnych frakcji komórkowych drobnoustrojów, a także ekspresja białek wirulentnych szczepów w innych systemach (np. bakteryjnych, wirusowych, zwierzęcych, roślinnych) sta­nowią podstawę w rozwoju szczepionek podjednostkowych.
Antygeny stosowane w szczepionkach podjednostkowych
W celu uniknięcia immunizacji organizmu całymi drobno­ustrojami stosuje się szczepionki podjednostkowe, które za­wierają jedynie wybrane antygeny, specyficznie stymulujące układ immunologiczny. Zastosowanie szczepionek podjed­nostkowych, zawierających jedynie krótki fragment białka, pozwala otrzymać przeciwciała, zdolne do oddziaływania z na­tywnym białkiem stanowiącym element strukturalny patogen­nego mikroorganizmu. Niekiedy stosuje się krótkie peptydy, zawierające jedynie miejsce wiązania przeciwciała (epitop) lub receptora, które również mogą wzbudzać odpowiedź im­munologiczną na konkretny patogen.
Dzięki temu, że szczepionki podjednostkowe zawierają jedy­nie wybrane antygeny, skutki niepożądane podawania takiej szczepionki są ograniczone. Szczepionki podjednostkowe mogą zawierać jeden lub więcej antygenów i mogą być pozy­skiwane na różne sposoby. Czasem wymaga to hodowli kon­kretnego szczepu mikroorganizmu oraz izolacji i oczyszczenia wybranego antygenu. Inną metodą jest ekspresja wybranych antygenów w innych niepatogennych i łatwych w hodowli mikroorganizmach. Szczepionki skonstruowane na bazie an­tygenów pozyskanych tą metodą noszą nazwę rekombinowa­nych szczepionek podjednostkowych. Jeśli antygenami będą krótkie peptydy, to można otrzymywać je w wyniku syntezy chemicznej [15,27].
Przykładem rekombinowanej szczepionki podjednostkowej jest opracowana w 2009 r. szczepionka przeciwko gorączce Zachodniego Nilu. Choroba ta należy do grupy gorączek krwo­tocznych, a wywołuje ją jednoniciowy wirus Zachodniego Nilu (WNV - West Nil Virus) zaliczany do rodzaju Flavivirus. Szcze­pionka została opracowana dzięki ekspresji białka E otoczki wirusa WNV w systemie ekspresyjnym muszki owocowej (Dro­sophila melanogaster). Rekombinowane białko oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa z użyciem swoistych przeciwciał monoklonalnych. Oczyszczone białko wraz z adiu­wantem GPI-0100 podano małpom Macaca mulatta. Efektem szczepienia był zauważalny w surowicy zwierząt wzrost miana swoistych dla białka E przeciwciał. Należy także podkreślić, że u małp, którym po podaniu szczepionki podano żywego wiru­sa WNV nie zaobserwowano wiremii. Natomiast u małp nie­szczepionych po podaniu wirusa występowała wiremia. Tak przygotowana szczepionka gwarantowała 100% skuteczności i chroniła zwierzęta przed rozwojem zakażenia wirusem Za­chodniego Nilu [32].
Innym przykładem rekombinowanej szczepionki podjednost­kowej jest szczepionka przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu B (WZWB). Przed jej opracowaniem stosowana była szczepionka zawierająca cząsteczki wirusa pochodzące z surowicy ludzi zakażonych. Wirus był inaktywowany za pomocą wyso­kiej temperatury oraz formaldehydu. Pierwszą komercyjnie dostępną szczepionką tego typu była szczepionka „Heptavax" produkowana od 1981 r. przez firmę MERCK & CO. INC, która po 9 latach została wycofana ze sprzedaży i zastąpiona szcze­pionką rekombinowaną zawierającą jedynie wybrany antygen wirusa WZWB - HbsAg. Była to pierwsza szczepionka wyko­rzystująca technikę rekombinacji DNA. Geny kodujące anty­gen HBsAg były ekspresjonowane w drożdżach, dzięki czemu nie było ryzyka zakażenia wirusem WZWB. Szczepionka ta została opracowana w 1982 r., a dwa lata później zbadano jej działanie na szympansach. W 1986 r. została wydana licencja na jej sprzedaż i stosowanie u ludzi [60].
Należy pamiętać, że większość krótkich sekwencji peptydo­wych oraz niewielkie antygeny nie są w stanie wywołać odpo­wiedzi immunologicznej. Cząsteczki takie, zwane haptenami, to przeważnie cząsteczki o masie cząsteczkowej mniejszej niż 500 Da [35].
Do wywołania odpowiedzi immunologicznej za pomocą krótkich sekwencji aminokwasowych lub grup cukrowych konieczne jest zatem połączenie ich z większymi cząstecz­kami, pełniącymi funkcję nośników. Dopiero tak przygoto­wane cząsteczki są w stanie wywołać odpowiedź immunolo­giczną i wytwarzać przeciwciała swoiste dla zastosowanych do immunizacji antygenów. Niektóre antygeny chociaż same mogą wywołać odpowiedź immunologiczną, to po połączeniu z białkiem nośnikowym dają odpowiedź immu­nologiczną z wyższym mianem przeciwciał oraz gwarantują doskonalszą pamięć immunologiczną [11]. Do zaprojek­towania skutecznej szczepionki podjednostkowej należy wybrać odpowiedni antygen lub jego fragment tak, aby wytworzone przez organizm swoiste przeciwciała mogły oddziaływać z natywnymi strukturami mikroorganizmów. W przypadku zastosowania krótkich peptydów bardzo waż­ny jest nie tylko dobór metody koniugacji, lecz także dobór rodzaju nośnika tak, aby antygen znajdował się w odpo­wiednim ułożeniu przestrzennym i był dostępny dla od­działywań z receptorami komórkowymi.
Strategie dostarczania antygenów do komórek prezentujących i dobór nośników do konstrukcji szczepionek podjednostkowych
Systemy dostarczania i transportowania specyficznych an­tygenów do komórek prezentujących antygeny oparte są na wielu strategiach. Do najważniejszych funkcji systemu do­starczającego antygen należą: a) ułatwienie transportu im­munogennej cząsteczki, b) jej ekspozycja komórkom pre­zentującym antygeny (APC - antigen presenting cells) oraz c) przedłużenie czasu jej półtrwania w organizmie żywym. W szczepionkach podjednostkowych systemy te oparte są najczęściej na zastosowaniu różnego rodzaju cząsteczek organicznych lub nieorganicznych pełniących funkcję nośników lub na systemach ekspresji genów mikroorganizmów chorobotwórczych w drobnoustrojach niepatogennych (wektorowych), które mogą namnażać się w organizmie ludz­kim bez ryzyka zakażenia i wystąpienia objawów chorobowych (tzw. rekombinowane szczepionki podjednostkowe).
W dostarczaniu antygenów podjednostkowych do wnętrza komórek zastosowanie znalazły różnego rodzaju systemy bak­teryjne i wirusowe. Stan wiedzy w dziedzinie biologii mole­kularnej i inżynierii genetycznej pozwolił na rozwój nowych atenuowanych szczepów, które są wykorzystywane jako no­śniki antygenów pochodzących z drobnoustrojów chorobo­twórczych. Odpowiednia manipulacja materiałem genetycz­nym mikroorganizmów niepatogennych lub atenuowanych pozwala na stworzenie organizmów modyfikowanych (np. bakterie Gram-dodatnie, Gram-ujemne, wirusy, drożdże), któ­re będą zdolne do ekspresji odpowiednich białek pełniących funkcję antygenów na powierzchni swoich komórek. Rekombi­nacyjna technologia DNA umożliwia także ekspresję materiału genetycznego antygenów pochodzących z drobnoustrojów chorobotwórczych z wykorzystaniem komórek organizmów wektorowych. W ten sposób wytwarzane są antygeny wy­dzielane na zewnątrz ich komórek, w postaci czystych białek, a także białek fuzyjnych, które oprócz fragmentów antygeno­wych mają np. sekwencje ułatwiające ich oczyszczanie. Jedną z obiecujących szczepionek tego typu jest szczepionka zawie­rająca antygeny Gag ludzkiego wirusa niedoborów immunolo­gicznych HIV-1 ekspresjonowanego w atenuowanym szczepie Salmonella enterica Typhimurium. W badaniach modelowych na myszach wykazano, że doustna immunizacja zwierząt wy­wołuje odpowiedź limfocytów CD4+, wzbudzając oba typy od­powiedzi komórkowej typu Th1 (wytwarzanie IFN-γ i TNF-α) i Th2 (wytwarzanie IL-4 i IL-5), a także odpowiedź humoralną poprzez indukcję wytwarzania przeciwciał klasy IgG1 i IgG2a skierowanych na antygen Gag, wchodzący w skład wirusa HIV- 1 [9]. Weinrich i wsp. opracowali szczepionkę fuzyjną prze­ciwko gruźlicy, która składała się z dwóch antygenów: ESAT- 6 i 85B oraz adiuwantu MPL - DDA (monophosphoryl lipid A - dimethyl dioctadecylammonium bromide) i wykazywała bardzo dobre właściwości ochronne na modelu mysim. Szcze­pionka ta mogłaby być nową, zdefiniowaną i tańszą w pro­dukcji w porównaniu z używaną szczepionką BCG (Bacillus Calmette-Guérin) [58].
Szczególnym przypadkiem rekombinowanych szczepionek podjednostkowych są szczepionki DNA, którymi są wektory złożone z DNA plazmidowego pochodzącego z systemu bak­teryjnego (np. E. coli), kodujące interesujące nas antygeny pod kontrolą silnego promotora wirusowego rozpoznawa­nego przez organizm gospodarza. Po wstrzyknięciu takiego DNA do organizmu wyższego, dochodzi do natychmiastowej ekspresji antygenu in situ oraz wzbudzenia specyficznej odpo­wiedzi immunologicznej. Shariati Mehr i wsp. skonstruowali szczepionkę DNA, będącą szczepionką fuzyjną trzech antyge­nów ekspresjonowanych w E. coli O157:H7. Stworzyli oni syn­tetyczny gen eit, który był genem fuzyjnym kodującym trzy ważne białka pochodzące z tego mikroorganizmu: espA (ko­dujący białko EspA 120 pozbawione 36 aminokwasów z końca N), eae (kodujący konstrukt białka intiminy zawierający 282 aminokwasy z końca C oraz tir (kodujący fragment białka Tir 103, między resztami 258-361, oddziałujący z intyminą). Trans­fekcja komórek E. coli BL21DE3 wektorem pCI-neo zawierają­cym gen eit pozwoliła na uzyskanie rekombinowanego białka fuzyjnego (rEIT). Wykazano, że domięśniowa immunizacja myszy BALB/c czystym białkiem rEIT, wektorem PCI-neo-EIT, kombinacją wektora i białka bez użycia adiuwantów wzbu­dza humoralną odpowiedź immunologiczną, przejawiającą się wytwarzaniem przeciwciał anty-rEIT. Wykazano także, że myszy immunizowane tak przygotowanymi szczepionkami wykazywały zdolność do zwalczania patogennych komórek E. coli O157:H7. Porównanie obu typów szczepionek pozwoliło stwierdzić, że czyste białko rEIT jest lepszym immunogenem niż szczepionka zawierająca gen eit (PCI-neo-EIT). Zauważono, że myszy immunizowane białkiem mają większe stężenie prze­ciwciał klasy IgG skierowanych przeciwko rEIT oraz szybciej zwalczają patogenne bakterie [51].
Najbardziej obiecującymi cząsteczkami nośnikowymi, w szcze­gólności dla cząsteczek, takich jak polisacharydy i krótkie fragmenty peptydowe, wydają się białka bakteryjne (głów­nie OMPs - Outer Membrane Proteins) i egzotoksyny (np. TT - Tetanus Toxoid), a także białka eukariotyczne, takie jak albumina bydlęca (BSA - Bovine Serum Albumin), owalbu­mina (OVA - Ovalbumin), czy hemocyjanina (KLH - Keyho­le Limpet Hemocyanin). Stwierdzono, że koniugaty, w skład których wchodzą te białka wzbudzają odpowiedź przeciwko prezentowanym na ich powierzchni antygenom. Jedną z wad tego typu szczepionek koniugatowych jest możliwość wy­twarzania przez organizm gospodarza przeciwciał skierowa­nych przeciwko białkom nośnikowym, zwłaszcza przeciwko sekwencjom homologicznym do sekwencji białek obecnych w organizmie człowieka [30]. W ostatniej dekadzie opraco­wano prototyp szczepionki przeciwko chłoniakowi limfocy­tów B. Stwierdzono, że CD20 ma zewnątrzcytoplazmatyczne epitopy, które mogą stanowić cel, zarówno w immunoterapii, jak i produkcji szczepionek przeciwko chłoniakowi typu B [46]. Szczepionkę stanowił koniugat białka KLH i peptydów anty­genu CD20. Wykazano, że surowice myszy BALB/c immunizo­wane tym koniugatem z adiuwantem QS21 wykazują wysoki poziom przeciwciał skierowanych przeciwko swoistym epito­pom peptydowym oraz słabsze wiązanie się tych przeciwciał do całego białka CD20. Wykazano także zdolność dopełniacza do zabijania limfocytów B CD20+ zależną od przeciwciał oraz sekrecję IL-4 i IFN-γ przez mysie splenocyty.
W ostatnich latach ukazało się także wiele prac na temat za­stosowania rozgałęzionych nośników tworzących struktury dendrymerów, do których z łatwością można przyłączyć po kilka cząsteczek antygenu. Stwarza to szansę na dostarcze­nie do miejsca działania maksymalnej liczby immunogen­nych cząsteczek. Przykładem takich cząsteczek są dendrymery polilizynowe, do których antygeny wiązane są przez grupy α- i ε-aminowe lizyn. Nośniki te znalazły największe zastoso­wanie w przypadku konstrukcji szczepionek peptydowych. Wykazano, że peptydy zsyntetyzowane na tych nośnikach są bardziej odporne na proteolizę niż peptydy podane w ich wolnej postaci. Ponadto zwiększa się stopień ich rozpoznania przez komórki immunologiczne biorące udział w odpowiedzi odpornościowej. Należy także podkreślić, że cząsteczki roz­gałęzionych polilizyn nie wykazują znaczących właściwości immunogennych, wskutek czego nie są wytwarzane wysokie miana niepożądanych przeciwciał skierowanych na nośnik szczepionki [47].
Systemem ułatwiającym dostarczanie immunogenów do komó­rek prezentujących antygen jest ich koniugacja z przeciwciała­mi, wykazującymi powinowactwo do specyficznych markerów obecnych na powierzchni APC (Antigen Presenting Cell), takich jak np. Clec9A. Cząsteczka ta odpowiedzialna jest za aktywację i silną proliferację limfocytów B oraz wytwarzanie przeciwciał. Zastosowanie techniki koniugacji przeciwciał anty-Clec9A z od­powiednimi antygenami, potencjalnie stwarza wielkie możliwo­ści w produkcji szczepionek. Wykazano bowiem, że aktywacja Clec9A wzbudza jednocześnie oba typy odpowiedzi immuno­logicznej: humoralną (wytwarzanie przeciwciał) i komórkową (aktywacja limfocytów T cytotoksycznych) [6].
Innym systemem ułatwiającym przenoszenie antygenów do wnętrza APC jest ich koniugacja z peptydami wykazującymi zdolność do penetracji błon komórkowych (CPPs - cell-pene­trating peptides). Przeprowadzono wiele badań nad pepty­dami zdolnymi do transportowania przez błony komórkowe innych peptydów, białek, oligonukleotydów, DNA, RNA, a także dużo większych cząsteczek, takich jak liposomy. Zaletą tego typu systemów jest to, że peptydy penetrujące błony cytopla­zmatyczne są na tyle małe, że nie powodują indukcji przeciw­ciał skierowanych przeciwko swoim sekwencjom [4].
Jako odpowiednie nośniki dla małych cząsteczek, wchodzą­cych w skład szczepionek podjednostkowych, rozważane są także cząsteczki samoorganizujące się, najczęściej zbudo­wane z epitopów peptydowych. Peptydy wykazujące dru­gorzędową strukturę opartą na α-helisach lub β-kartkach wykorzystują oddziaływania niekowalencyjne do tworzenia struktur samoorganizujących się w kształt rurek, włókien i sfer, mogących stanowić podstawę szczepionki. Peptydy samoorganizujące się, poza tym że pełnią funkcję nośników epitopów peptydowych, pełnią także funkcję adiuwantów. Dlatego też użycie ich w szczepionkach nie wymaga stoso­wania dodatkowych substancji wspomagających odpowiedź immunologiczną [48].
Liposomy, dwuwarstwowe pęcherzyki, złożone z amfipa­tycznych fosfolipidów są często używane jako cząsteczki transportujące dla wielu różnorodnych substancji aktyw­nych biologicznie. Wykazują one zdolność transportu anty­genów w kierunku specyficznych tkanek, pełniąc przy tym funkcję dobrych adiuwantów wspomagając odpowiedź im­munologiczną na różne antygeny bakteryjne i wirusowe. W szczególności są one ciekawymi cząsteczkami transpor­tującymi antygeny w szczepionkach podawanych doustnie lub donosowo, dla których drogą wchłaniania są błony śluzo­we. Główną zaletą liposomów jest to, że wydłużają one czas uwalniania antygenu z ich wnętrza, a jednocześnie chronią go przed nadmierną proteolizą i ułatwiają jego wchłanianie przez komórki dendrytyczne. Pęcherzyki liposomowe znala­zły szerokie zastosowanie w dostarczaniu białek i peptydów do cytoplazmy komórek dendrytycznych w procesie endocy­tozy. Antygeny opłaszczone w endosomach i/lub lizosomach są z nich uwalniane do cytoplazmy komórek dendrytycznych poprzez destabilizację błony dzięki oddziaływaniom hydrofo­bowym i elektrostatycznym. Watarai i wsp. opracowali spe­cjalny rodzaj lizosomów, które pod wpływem zmian pH na lekko kwaśne wykazują większe zdolności do fuzji z błonami komórkowymi, a tym samym zapewniają lepszy transport antygenów. Za właściwość tę odpowiedzialny jest specjalny polimer wbudowany w ścianę liposomu - bursztynianowany poli(glicydol) (SucPG - succinylated poly(glycidol)). Badacze ci wykazali dużą efektywność liposomów modyfikowanych SucPG zawierających owoalbuminę (OVA) jako antygen. Tak przygotowana szczepionka wykazywała silne właściwości immunogenne, wzbudzając oba typy odpowiedzi immuno­logicznej humoralną (Th2, wytwarzanie IgG1 oraz IL-4) oraz komórkową (Th1, wytwarzanie IgG2a, IgG3 oraz IFN-γ) [57].
Alternatywą dla organicznych nośników szczepionek mogą być nieorganiczne nanocząsteczki metali szlachetnych, takich jak np. złoto, srebro, kobalt, platyna, a także struktury oparte na tlenku krzemu IV (SiO2) [37]. Cząsteczki te przedostają się do wnętrza komórek w procesie endocytozy, transportując specyficzne antygeny, które dodatkowo są chronione przed proteolizą enzymatyczną i endosomalną. Jedną z największych zalet tego typu nośników jest to, że nie wykazują one właści­wości immunogennych, a tym samym nie powodują ryzyka indukcji przeciwciał antynośnikowych. Niestety, wyniki uzy­skane przez niektóre grupy badawcze dowodzą toksyczności tego typu nośników. Jedną z metod redukcji ich właściwości cytotoksycznych jest manipulacja ich rozmiarem, a także stop­niem wysycenia ich powierzchni [10]. Najbardziej obiecujący­mi z wyżej wymienionych wydają się te, zbudowane z cząste­czek koloidalnego złota. Nanocząsteczki złota są obojętne dla ustroju, nietoksyczne oraz łatwo mogą być wchłaniane przez komórki dendrytyczne i inne fagocytarne monocyty.
W badaniach in vitro limfocytów T wykazano, że pojedyncza komórka może wchłonąć nawet 104 cząsteczek koloidalne­go złota, co znacznie ułatwia dostarczanie oraz manipulo­wanie ilością antygenu związanego z takim nośnikiem. Na­nocząsteczki te mogą być wykorzystywane jako kompleksy z peptydami, połączonymi w wyniku pośredniej koniugacji przez tiole, które mogą być łączone z wykorzystaniem łańcu­chów bocznych cystein lub poprzez elektrostatyczne wiąza­nie peptydów do powierzchni złota. Pozwala to na pokrycie powierzchni koloidalnego złota pojedynczą warstwą pepty­dów. Metodą zwiększenia pojemności pojedynczej cząsteczki złota jest zastosowanie dodatkowych łączników, takich jak np. 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo) karbodiimidu (EDC) i sulfo-N-hydroksysukcynimidu (sulfo-NHS). Jest to strategia oparta na tzw. koniugacji „bottom-up" i polega na modyfi­kacji powierzchni złota z użyciem łącznika, takiego jak glikol polietylenowy (PEG). Stwierdzono także, że zastosowanie PEG daje dużo lepsze rezultaty w stymulacji limfocytów T niż za­stosowanie łącznika zbudowanego z DNA [33].
Metody koniugacji
a) bezpośrednie łączenie antygenu z cząsteczkami nośnika
Znanych jest wiele metod koniugacji antygenów z cząstecz­kami nośnikowymi, które różnią się od siebie w zależności od antygenu oraz od grup funkcyjnych dostępnych na po­wierzchni cząsteczki nośnika. Istotną rolę przy wyborze me­tody koniugacji pełni także orientacja przestrzenna antyge­nu, będąca rezultatem procesu koniugacji, co ma wpływ na swoistość wytwarzanych przez organizm przeciwciał. Należy pamiętać, że cząsteczka łącząca antygen z nośnikiem może powodować powstawanie przeciwciał skierowanych przeciw­ko łącznikowi, co może zmniejszyć wydajność szczepienia. Im krótsza jest cząsteczka łącząca, tym mniejsze jest praw­dopodobieństwo powstania specyficznych dla niej przeciw­ciał. Stwierdzono także, że cząsteczki antygenu połączone bezpośrednio z cząsteczkami nośnikowymi wykazują więk­szą immunogenność, niż antygeny połączone z nośnikiem za pomocą linkera [23].
Zastosowanie koniugacji za pomocą imidu pozwala na bezpo­średnie połączenie haptenu z cząsteczką nośnika. Mechanizm tego procesu opiera się na reakcji karbodiimidu z grupami kar­boksylowymi cząsteczek nośnika lub haptenu tworzącymi zwią­zek pośredni w postaci O-acyloizomocznika. Tak aktywowana grupa karboksylowa łatwo reaguje z grupami amin pierwszo­rzędowych tworząc wiązanie amidowe z uwolnieniem rozpusz­czalnego związku w postaci pochodnej izomocznika (ryc.1) [17].
Ryc. 1. Wytworzenie stabilnego wiązania amidowego między grupą karboksylową i pierwszorzędową grupą aminową za pomocą karbodiimidu na przykładzie ED

Ta metoda koniugacji haptenu z nośnikiem jest szybka i sto­sunkowo prosta. W przypadku peptydów miejsce wiązania jest specyficzne. Wchodzące w reakcję grupy karboksylowe hap­tenu to najczęściej C-końcowe grupy karboksylowe, a grupy aminowe to najczęściej ε-aminowe grupy lizyny białka nośniko­wego. Unika się stosowania peptydów bogatych w aminokwa­sy kwasowe, takie jak Asp lub Glu, ponieważ miejsce wiązania w tym przypadku jest niespecyficzne, a uzyskane koniugaty mogą zawierać różne warianty konformacyjne tego samego peptydu [7,54]. Podobne reakcje uboczne mogą występować w przypadku innych antygenów bogatych w grupy karboksy­lowe lub aminowe.
W przypadku antygenów z dużą ilością reszt Lys, Glu lub Asp może dojść do krzyżowego wiązania się haptenów ze sobą. Zjawisko to może okazać się korzystne, ponieważ pewne hap­teny po polimeryzacji stają się bardziej immunogenne [1,42], a niektóre z nich, mając taką postać nie wymagają już białka nośnikowego [34]. Zastosowanie karbodiimidu może również powodować precypitację powstałych kompleksów i aby tego uniknąć należy obniżyć stężenie karbodiimidu lub skrócić czas reakcji. Zastosowanie nierozpuszczalnych koniugatów może się jednak okazać korzystniejsze, ponieważ są one bardziej immu­nogenne niż ich rozpuszczalne odpowiedniki [12,53].
Jednym z najpowszechniej stosowanych karbodiimidów jest EDC (chlorowodorek N-(3-dimetyloaminopropylo)-N›-ety­lokarbodiimidu). Jego głównymi zaletami są dobra rozpusz­czalność w wodzie oraz łatwe usuwanie produktu ubocznego reakcji. Często stosowanym karbodiimidem jest CMC (N-cy­kloheksylo-N›-(2-morfolinoetylo) karbodiimid). Wielu au­torów opisuje przykłady koniugacji antygenów białkowych i cukrowych do cząsteczek nośnika z zastosowaniem EDC [5,19,25,29,61]. Jest on wykorzystywany także do otrzymywania immunogennych koniugatów nośników ze steroidami [61]. Ze względu na stosunkowo dużą zawartość grup karboksylowych, metodę koniugacji za pomocą karbodiimidu wykorzystuje się często do koniugacji poli- i oligosacharydów. Niektóre polisa­charydy można również łączyć z cząsteczkami białka poprzez grupy aminowe cukrów. Stosuje się tę metodę po uprzedniej hydrolizie polisacharydów, w wyniku której powstają wolne grupy aminowe, mogące oddziaływać z aktywowanymi za po­mocą EDC grupami karboksylowymi białka nośnikowego [5]. Do zwiększenia wydajności procesu koniugacji stosuje się N­-hydroksysulfo-sukcynimid. Jest to reakcja dwustopniowa, w której sulfo-NHS dodawany jest po EDC. W wyniku akty­wacji grup karboksylowych za pomocą EDC powstaje związek pośredni, O-acylomocznik, który w środowisku wodnym ulega szybkiej hydrolizie, pozostawiając wolną grupę karboksylową, niereagującą z grupami aminowymi. Natomiast dodanie sulfo­-NHS powoduje wytworzenie stabilnego estru sulfo-NHS, który następnie może oddziaływać z grupami aminowymi. Produkt końcowy reakcji jest więc taki sam jak w przypadku zastoso­wania samego EDC, jednak wydłużony zostaje okres trwania aktywnego związku przejściowego [24].
Ciekawym przykładem zastosowania EDC jest wykorzystanie go do aktywacji grup karboksylowych polimeru PLGA (PLGA - poly(lactide-coglycolide) acid). Tak aktywowane grupy kar­boksylowe wchodzą w reakcje z grupami aminowymi innego, dodatnio naładowanego polimeru - polietylenoiminy (PEI - po­lyethyleneimine), tworząc w ten sposób micele o naładowanej dodatnio powierzchni. Uzyskane cząsteczki stają się bardzo dobrym nośnikiem antygenów, takich jak kwasy nukleinowe czy cytokiny [26,38]. Są również karbodiimidy rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych, które można zastosować wtedy, kiedy synteza w środowisku wodnym jest niemożliwa. Należą do nich DIC (N,N'-diizopropylokarbodiimid) oraz DCC (N,N'-dicykloheksylokarbodiimid), który wykorzystywany jest również do syntez szczepionek [38]. EDC oraz DCC mają szcze­gólne zastosowanie w tworzeniu syntetycznych peptydów [40].
Reduktywna aminacja to powszechnie stosowana technika po­zwalająca na koniugację antygenów zawierających w swojej strukturze wolne grupy karbonylowe (ryc. 2). Nadaje się dobrze do koniugacji oligo- i polisacharydów z białkami nośnikowy­mi, a skutkiem jej jest powstanie stabilnego, kowalencyjnego wiązania między antygenem i nośnikiem. Ponadto, stosując tę technikę można zachować nienaruszoną strukturę rdzenia antygenu cukrowego. Mechanizm reakcji polega na oddziały­waniu grupy karbonylowej cukru oraz grup aminowych białka nośnikowego w środowisku zasadowym, w wyniku czego po­wstaje zasada Schiffa. Może ona zostać zredukowana w obecno­ści borowodorku sodu lub cyjanoborowodorku sodu (NaBH3CN) z wytworzeniem nasyconego wiązania pomiędzy atomem wę­gla cząsteczki cukru i atomem azotu cząsteczki białka (ryc. 2). Celem uzyskania wolnych grup karbonylowych, cząsteczki cukru należy wcześniej poddać oksydacji. Jednym z powszech­nie stosowanych czynników utleniających jest nadjodan sodu. Zaletą tej metody jest to, że reakcja zachodzi w roztworze wod­nym w łagodnych warunkach, dzięki czemu struktura rdzenia polisacharydu oraz białka pozostaje nienaruszona. Utlenianie za pomocą nadjodanu sodu otwiera pierścienie cukrowe oli­go- i polisacharydów z wytworzeniem wolnych grup karbo­nylowych, co może spowodować zwiększenie ruchliwości cu­krów oraz zmiany w ekspozycji epitopów. Co więcej, otwarte pierścienie cukrowe mogą się zamknąć po procesie reduktyw­nej aminacji, a skutkiem może być zmiana konformacji cukru i powstanie nowych epitopów [45]. Technika ta, mimo wad, znajduje obecnie zastosowanie w otrzymywaniu szczepionek podjednostkowych zawierających polisacharydy [18,59].
Ryc. 2. Reduktywna aminacja - technika koniugacji cukrowych antygenów z białkowym nośnikiem

Wykorzystując metodę reduktywnej aminacji uzyskano obec­nie stosowaną u ludzi szczepionkę przeciwko pneumokokom, zawierającą polisacharydy powierzchniowe obecne na komór­kach pneumokoków połączone z białkiem nośnikowym CRM197 (CRM197 to nietoksyczny wariant toksyny błoniczej wyizolowa­nej z Corynebacterium diphtheriae strain C7 (β197)) [11].
Techniką alternatywną dla reduktywnej aminacji jest cyjano­wanie. Technika ta została szczegółowo opisana w 1996 r. przez Leesa i wsp. [31]. Umożliwia ona otrzymanie immunogennych koniugatów polisacharydów z białkami. Mechanizm reakcji po­lega na aktywacji grup hydroksylowych cząsteczki cukru za pomocą czynnika cyjanującego np. bromocyjanu (CNBr) lub CDAP (CDAP - 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetraflu­oroborate), w wyniku czego cząsteczka cukru uzyskuje grupy nitrylowe związane atomem tlenu. Grupy te reagują z grupami aminowymi i sulfhydrylowymi białek z wytworzeniem stabil­nego wiązania kowalencyjnego [45]. Wykazano, że aktywowane za pomocą cyjanowania polisacharydy reagują preferencyjnie z lizyną, cysteiną i histydyną, natomiast nie reagują z metioni­ną, seryną i tyrozyną [50]. Aktywacja grup hydroksylowych za pomocą CNBr wymaga pH >= 10,5, co może spowodować uszko­dzenie polisacharydów wrażliwych na wysokie pH. Z tego powo­du często do aktywacji grup hydroksylowych stosuje się CDAP, który wymaga pH 8,0. Badania porównujące immunogenność koniugatów białkowych otrzymanych w wyniku zastosowania tych dwóch czynników aktywujących wykazały większą sku­teczność CDAP [25]. Technika ta jest obecnie wykorzystywana do tworzenia szczepionek podjednostkowych zawierających po­lisacharydy jako antygeny [25,29,50]. Główną zaletą tej metody jest to, że pozwala ona aktywować grupy hydroksylowe pier­ścieni cukrowych nie wpływając na ich strukturę, co gwarantuje zachowanie natywnych epitopów oligo- i polisacharydów [45].
b) łączenie antygenu z nośnikiem za pomocą linkera
Znanych jest wiele metod łączenia antygenu z nośnikiem za pomocą linkera. Wiele związków, które zawierają dwie lub wię­cej aktywnych grup funkcyjnych, przez które mogą wiązać się z wybranymi grupami funkcyjnymi cząsteczek nośnika i anty­genu, nazywanych jest linkerami. Takie cząsteczki mogą zwią­zać antygen z nośnikiem za pomocą wiązań kowalencyjnych. Istniejąca duża różnorodność linkerów spowodowana jest po­trzebą łączenia ze sobą różnych grup funkcyjnych. Znany jest podział linkerów na homo- i heterobifunkcyjne. Przykłady lin­kerów homobifunkcyjnych przedstawia tabela 2 [8,22].
Tabela 2. Rodzaje oddziaływań i przykłady linkerów homobifunkcyjnych

Linkery homobifunkcyjne mają na swoich końcach identyczne grupy, które wiążą cząsteczkę antygenu z nośnikiem poprzez związanie do tych samych grup funkcyjnych. Celem zminima­lizowania wystąpienia wiązań krzyżowych między cząstecz­kami antygenu lub nośnika, linkery homobifunkcyjne muszą być stosowane w jednoetapowej reakcji antygenu z nośnikiem.
Linkery heterobifunkcyjne łączą dwie cząsteczki poprzez zwią­zanie dwóch różnych grup funkcyjnych. Wybór linkera zależy od rodzaju i liczby grup funkcyjnych dostępnych na cząsteczce antygenu oraz nośnika. Należy również pamiętać, że zasto­sowana technika koniugacji może mieć wpływ na orientację przestrzenną antygenu oraz ekspozycję miejsca wiążącego.
Koniugacja z wykorzystaniem estrów N-hydroksy-sukcynimidu (NHS) jest reakcją, w której uczestniczą grupy aminowe nośni­ka oraz antygenu. W przypadku linkerów homobifunkcyjnych opiera się na zastosowaniu związku zawierającego grupy NHS przyłączone wiązaniem estrowym na obydwu końcach. Linkery mające na swoich końcach grupy sulfo-NHS są lepiej rozpusz­czalne w wodzie od tych mających grupy NHS. Grupy estrowe wysoce reaktywnie wiążą się z aminami obecnymi w białku lub w innych cząsteczkach, wytwarzając stabilne wiązanie. Cząsteczka zawierająca grupy NHS pełni rolę łącznika pomię­dzy grupami aminowymi nośnika i grupami aminowymi an­tygenu (ryc. 3). Długość cząsteczki będącej łącznikiem może być zmienna.
Ryc. 3. Metoda koniugacji antygenu z nośnikiem poprzez grupy aminowe obu cząsteczek za pomocą homobifunkcyjnego linkera

W przypadku występowania w antygenie większej liczby grup aminowych nie można przewidzieć w jakiej orientacji w sto­sunku do nośnika znajdzie się antygen, co może skutkować za­kryciem miejsca wiążącego. Przykładami obecnie stosowanych homobifunkcyjnych estrów NHS są DSG (disuccinimidyl glu­tarate) [8] oraz DSS (disuccinimidyl suberate) [22]. Cząsteczka łącząca może zamiast grup NHS na końcach zawierać grupy sul­fo-NHS, co nadaje jej większą rozpuszczalność w wodzie. Przy­kładem takiego linkera jest: sulfo-DSS (bis(sulfosuccinimidyl) suberate) [28] i sulfo-EGS (ethylene glycolbis (sulfosuccinimi­dylsuccinate)) [39]. Niektóre homobifunkcyjne linkery zawie­rają w swojej strukturze miejsca, które mogą zostać przecięte uwalniając uprzednio połączone cząsteczki oraz odsłaniając nowe grupy funkcyjne. Przykładami takich linkerów, stoso­wanych w tworzeniu szczepionek są: BSOCOES, DSP, DTSSP, DST, EGS i Sulfo-EGS.
Innym użytym sposobem koniugacji jest metoda z wykorzy­staniem glutaraldehydu, zawierającego na obydwu końcach grupy aldehydowe, które w środowisku alkalicznym wykazu­ją dużą reaktywność z grupami amin pierwszorzędowych (ε- i α-aminy) tworząc z nimi związek o strukturze zasady Schif­fa (wiązanie podwójne między węglem grupy aldehydowej i azotem grupy aminowej). Wiązanie to jest nietrwałe, dlatego przeprowadza się jego redukcję za pomocą borowodorku sodu (NaBH4) lub cyjanoborowodorku sodu (NaBH3CN) w wyniku czego powstaje stabilne wiązanie amidowe.
Glutaraldehyd może również reagować z grupami aminowymi nie wytwarzając zasady Schiffa, lecz produkty addycji Micha­ela. W miarę upływu czasu glutaraldehyd w roztworze prze­chodzi w postać α,b-nienasyconego polimeru i w takiej postaci reaguje z grupami nukleofilowymi, zwłaszcza z grupami amin pierwszorzędowych, tworząc stabilne wiązanie bez konieczno­ści stosowania czynnika redukującego. Ma on również zdolność do reagowania z grupami hydrazydowymi, dzięki czemu może połączyć dwie cząsteczki mające takie grupy poprzez stabilne wiązania hydrazonowe, które nie wymagają redukcji. Można również otrzymać koniugaty połączone grupą hydrazonową i aminową. Koniugacja cząsteczek za pomocą glutaraldehydu jest bardzo wydajna. Jednak dokładna struktura powstałych koniugatów jest trudna do określenia. Również proces koniu­gacji jest trudny do odtworzenia ze względu na różne możliwo­ści łączenia się ze sobą cząsteczek oraz zróżnicowanie stopnia polimeryzacji glutaraldehydu.
Linkery heterobifunkcyjne zawierają na swoich końcach róż­ne grupy funkcyjne. Związki te umożliwiają przeprowadzanie jedno- lub dwustopniowej koniugacji dwóch cząsteczek. Dzięki możliwości przeprowadzenia dwustopniowych reakcji można uniknąć zjawiska polimeryzacji oraz wiązania się ze sobą czą­steczek antygenu lub nośnika. Przykłady linkerów heterobi­funkcyjnych przedstawiają tabele 3A i 3B.
Tabela 3A. Rodzaje oddziaływań i przykłady heterobifunkcyjnych linkerów

Tabela 3B. Rodzaje oddziaływania i przykłady heterobifunkcyjnych linkerów

Interesującym sposobem koniugacji jest metoda z wykorzysta­niem heterobifunkcyjnego linkera z grupą NHS i maleimidem. Bardzo cenne w tworzeniu szczepionek podjednostkowych są związki pozwalające połączyć grupy sulfhydrylowe haptenów z grupami aminowymi cząsteczek nośnika. Grupy sulfhydry­lowe w peptydach znajdują się najczęściej w cysteinie, która występuje w białkach w niewielkich ilościach, dlatego więk­szość krótkich peptydów ma najwyżej jedną cysteinę. Dzięki temu mogą być one łączone z nośnikiem za pomocą linkera w jednakowej orientacji przestrzennej.
W przypadku stosowania jako antygenów krótkich peptydów niezawierających grup sulfhydrylowych, można podczas ich syntezy dodać na jednym z końców cysteinę, dzięki której peptyd będzie mógł związać się z linkerem. Zaletą takiej me­tody jest to, że peptyd będzie eksponowany na powierzchni nośnika w całości, zawsze w ten sam sposób. Związkami, któ­re umożliwiają połączenie grup sulfhydrylowych z grupami aminowymi są linkery będące estrami NHS i mające w swojej strukturze grupę maleimidową lub tiopirydylową. Reakcja składa się z 2 etapów, co podwyższa wydajność koniugacji oraz pozwala na dobrą kontrolę specyfiki wiązania.
Jednym z najczęściej używanych związków stosowanych do koniugacji grup aminowych i sulfhydrylowych jest sul­fo-SMCC (4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxy­lic acid 3-sulfo-N-hydroxysuccinimide ester sodium salt). W pierwszym etapie grupa sulfo-NHS na końcu sulfo-SMCC reaguje z grupami amin pierwszorzędowych na białku nośni­kowym. Wynikiem tego jest powstanie wiązania amidowego pomiędzy nośnikiem i cząsteczką łączącą. Produkt reakcji po­winien zostać oczyszczony np. przez filtrację żelową w celu usunięcia nieprzereagowanego sulfo-SMCC. Tak powstały związek ma w swojej strukturze grupy maleimidowe, które wykazują dużą reaktywność z grupami sulfhydrylowymi. W wyniku reakcji z grupami sulhydrylowymi antygenów powstaje stabilne wiązanie tioeterowe łączące antygen z lin­kerem. Innymi stosowanymi linkerami są MBS (3-maleimido­benzoic acid N-hydroxysuccinimide ester) i SMPB (4-(4-ma­leimidophenyl)butyric acid N-hydroxysuccinimide ester).
Niemniej jednak zastosowanie sulfo-SMCC jest najkorzyst­niejsze ze względu na jego dobrą rozpuszczalność oraz stabil­ność grupy maleimidowej. W przypadku innych MBS i SMPB grupa maleimidowa, w procesie poprzedzającym reakcję z antygenem może ulec hydrolizie do kwasu maleaminowe­go, który nie reaguje już z grupami sulfhydrylowmi, przez co zmniejsza się wydajność koniugacji. Problemem związanym z wykorzystaniem sulfo-SMCC jest jego duża immunogen­ność, co skutkuje otrzymaniem przeciwciał specyficznych dla linkera. Można to rozwiązać stosując jako linker PEG, który zawiera na swoich końcach grupy NHS lub sulfo-NHS oraz grupy maleimidowe [21]. Zaletą zastosowania grup sulfo-NHS (N-hydroxy-sulfosuccinimide) jest zwiększona stabilność aktywnych produktów pośrednich [2].
Jako linkery grup aminowych i sulfhydrylowych wykorzy­stuje się również estry-NHS zawierające na drugim końcu grupę tiopirydylową. Ciekawym przykładem takiego linkera jest ester 3-(2-pirydyloditio)propionowy kwasu N-hydrok­sybursztynowego (SPDP - 3-(2-pyridyldithio)propionic acid N-hydroxysuccinimide ester). W standardowej procedurze koniugacji za pomocą SPDP inkubowany jest najpierw z czą­steczką nośnika, z którą łączy się poprzez oddziaływanie grupy aminowej z końcem NHS. Następnie w drugim etapie koniugat linkera z nośnikiem inkubowany jest z cząsteczkami antygenu zawierającymi grupy sulfhydrylowe. Do koniugacji dochodzi poprzez oddziaływanie grupy tiopirydylowej lin­kera z grupą sulfhydrylową antygenu (ryc.4).
Ryc. 4. Metoda koniugacji grupy sulfhydrylowej i aminowej za pomocą heterobifunkcyjnego linkera - SPDP

Wykorzystując ten sam linker w inny sposób można otrzy­mać koniugaty połączone ze sobą grupami poprzez grupy aminowe. SPDP jest inkubowany oddzielnie z nośnikiem oraz z antygenem, z którymi łączy się przez ich grupy ami­nowe. Związek powstały z reakcji antygenu i SPDP poddaje się działaniu ditiotreitolu (DTT) w celu pozbycia się grupy tiopirydylowej z rozerwaniem wiązania pomiędzy dwiema siarkami. Następnie do mieszaniny dodaje się nośnik połą­czony z SPDP, który łatwo wiąże się z wolną siarką linkera po­łączonego z antygenem uwalniając grupę tiopirydylową [19]. Zaletą tej metody jest ograniczenie występowania połączeń nośnika z nośnikiem oraz haptenu z haptenem. Technika ta jest stosowana w produkcji szczepionek podjednostkowych (ryc. 5) [39].
Ryc. 5. Wykorzystanie heterobifunkcyjnego linkera - SPDP - do koniugacji 2 grup aminowych

Jako linkery bifunkcyjne używane są związki polietylenogli­kolu. Glikol polietylenowy (PEG) jest polieterem, którego mo­nomerem są cząsteczki tlenku etylenu. Komercyjnie dostęp­ne są glikole polietylenowe o różnym stopniu polimeryzacji, co warunkuje ich masę cząsteczkową. Szczególnym zaintere­sowaniem badaczy pracujących nad tworzeniem szczepionek podjednostkowych cieszą się obecnie bifunkcyjne glikole polietylenowe. W procesie koniugacji antygenów z nośni­kami dochodzi często do sterycznego osłaniania epitopów przez cząsteczkę nośnika. Obniża to skuteczność szczepionki.
Zastosowanie bifunkcyjnych glikoli polietylenowych jako linkerów pozwala na eliminację tego problemu. Antygen połączony jest z nośnikiem za pomocą długiego linkera - glikolu polietylenowego, przez co nie dochodzi do sterycz­nego osłaniania antygenu przez nośnik. Zjawisko to zostało opisane w przypadku szczepionki składającej się z polisa­charydu pochodzącego z otoczki Neisseria meningitidis. Za­stosowanie bifunkcyjnego PEGu jako linkera trzykrotnie zwiększyło miano otrzymanych przeciwciał specyficznych dla wchodzącego w skład szczepionki polisacharydu. Do­wiedziono również, że PEG zastosowany jako linker obniża immunogenność cząsteczki nośnika, co z kolei ma wpływ na niskie miano wytwarzanych przez organizm przeciwciał antynośnikowych [21]. Dostępnych jest wiele komercyjnych bifunkcyjnych glikoli polietylenowych. Przykładami mogą być oferowane przez firmę Pierce homobifunkcyjne glikole polietylenowe: BM(PEG)2 i BM(PEG)3, różniące się długością łańcucha z grupami maleimidowymi na obu końcach. Na­tomiast SM(PEG)n, również produkowany przez tę firmę, to heterobifunkcyjny PEG o zmiennej długości łańcucha z grupą NHS na jednym końcu oraz grupą maleimidową na drugim. Do heterobifunkcyjnych związków PEG należą także PEG12­-SPDP oraz PEG4-SPDP, zawierające na jednym końcu grupę tiopirydylową, a na drugim imid kwasu N-hydroksyburszty­nowego (NHS). Te grupy funkcyjne umożliwiają połączenie między grupą sulfhydrylową i grupą aminową lub między dwiema grupami aminowymi.
Adiuwanty
Szczepionki podjednostkowe zawierają w swoim składzie jedynie wyselekcjonowany zestaw antygenów, co sprawia, że są one wysoce specyficzne, ale także słabiej rozpoznawa­ne przez układ immunologiczny, czyli mniej immunogenne. Mimo że dysponujemy wieloma obiecującymi „kandydata­mi" na antygeny do szczepionki, takimi jak choćby antygeny zarodźca malarii, to zastosowanie ich w szczepionkach wciąż nie przynosi zadowalających efektów. Jest to głównie związa­ne z tym, że wzbudzana przez nie odpowiedź odpornościowa jest krótkotrwała i skierowana przeciwko wąskiemu spek­trum antygenów, co nie może się równać z efektywnością szczepionek składających się z żywych czy atenuowanych drobnoustrojów [3]. W przypadku podawania szczepionek niezwykle ważną rolę odgrywają adiuwanty, czynniki im­munostymulujące wspomagające ich transport, ekspozycję i czas półtrwania w warunkach in vivo. Dlatego też, wraz z roz­wojem nowych technologii związanych z konstruowaniem szczepionek podjednostkowych, obserwuje się ciągły wzrost liczby dostępnych na rynku adiuwantów.
Adiuwanty działają na zasadzie wielu różnych mechanizmów, które w większości przypadków nie zostały w pełni poznane. Pierwszy z nich polega na wspomaganiu transportu aktyw­nej cząsteczki, będącej składnikiem szczepionki do komórek prezentujących antygeny, takich jak makrofagi i komórki dendrytyczne. Do systemów ułatwiających prezentację anty­genów zaliczamy żele, emulsje, mikrocząsteczki, pęcherzyki i liposomy. Innym mechanizmem działania adiuwantów jest wzbudzanie niespecyficznej odpowiedzi immunologicznej, która pośrednio wspomaga uruchomienie mechanizmów odpowiedzi nabytej. Adiuwanty te zawierają najczęściej czą­steczki będące fragmentami różnego rodzaju mikroorgani­zmów, zwanymi molekularnymi wzorcami rozpoznania pa­togenów (PAMP - patogen associated molecular patterns). Zaliczamy do nich substancje, takie jak np. LPS (lipopolisa­charyd), MPL (monofosforylowy lipid A), czy niemetylowa­ne CpG, wchodzące w skład bakteryjnego DNA [1,14,19,41].
Poznanie mechanizmów działania adiuwantów jest bardzo ważnym problemem w rozwoju współczesnej wakcynolo­gii, a badania nad nowoczesnymi i skutecznymi adiuwan­tami prowadzone są wielokierunkowo. Ze względu na to, że większość z adiuwantów charakteryzuje wysoki stopień toksyczności, niewiele z nich znalazło zastosowanie i zostało dopuszczonych do stosowania u ludzi. Pierwszym, a zara­zem najczęściej stosowanym adiuwantem jest Alum, który w swoim składzie zawiera wodorotlenek lub fosforan glinu. Po raz pierwszy zastosował go w 1926 r. Alexander Glenny w szczepionce opartej o toksoid błonicy. Od tego czasu Alum był długo jedynym adiuwantem stosowanym w szczepion­kach przeznaczonych dla ludzi w Stanach Zjednoczonych [16]. Pomimo to, że przez wiele lat mechanizm działania tego adiuwantu nie był znany, był on szeroko stosowany w szcze­pionkach ze względu na wysoki stopień bezpieczeństwa oraz zdolność do wzbudzania odporności humoralnej.
Niedawno wykazano, że Alum oddziałuje pośrednio z lipida­mi na powierzchni komórek dendrytycznych, uruchamiając kaskadę sygnałową, która aktywuje limfocyty T CD4+ oraz wzbudza humoralną odpowiedź immunologiczną zależną od limfocytów B [16]. Poznanie mechanizmu jego działania nie tylko ułatwi dalsze zastosowanie w nowych szczepionkach, ale także umożliwi jego bardziej racjonalne użycie. Flach i wsp. wykazali, że Alum nie jest uniwersalnym adiuwantem i nie nadaje się do stosowania w szczepionkach, w których niezbędna jest aktywacja limfocytów T pomocniczych i cy­totoksycznych. Tym samym powstaje konieczność poszuki­wania innych, nowych adiutantów, które będą spełniać swoją funkcję w szczepionkach przeciwnowotworowych i chronią­cych przed rozwojem przewlekłych infekcji [16].
W krajach europejskich od 1997 r. zastosowanie znalazł także wodno-oleisty adiuwant MF59, zawierający skwalen. Mecha­nizm działania MF59 związany jest z jego zdolnością do sty­mulacji APC oraz zwiększeniem stopnia ekspozycji antygenu w tych komórkach. Stwierdzono, że adiuwant ten stymuluje wytwarzanie chemokin, takich jak CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP- 1α), CCL4 (MIB-1β) i CXCL8 (IL-8), które wspomagają napływ komórek z krwi do tkanek obwodowych [49]. Adiuwant ten wchodził w skład podjednostkowej szczepionki przeciwko grypie (Fluad -produkowanej przez firmę Chiron) i która za­wiera 10 mg skwalenu w pojedynczej dawce [44]. Szczepionka ta, podana w wielu milionach dawek wykazała, że zastoso­wany w niej adiuwant po wprowadzeniu do organizmu czło­wieka jest bezpieczny i bardzo skuteczny we wzbudzaniu mechanizmów pomocniczych. Co więcej, nie powoduje on nieswoistej indukcji przeciwciał skierowanych przeciwko skwalenowi. Ma to ogromne znaczenie ze względu na to, że skwalen występuje naturalnie w organizmie człowieka. Bez­pieczeństwo tego adiuwantu potwierdziły także badania kli­niczne z wykorzystaniem innych antygenów pochodzących np. z wirusów wywołujących wirusowe zapalenie wątroby typu B i C, cytomegalii, HIV [13].
Adiuwantem, który również znalazł zastosowanie u ludzi był AS03, który podobnie jak MF59 zawierał w swoim składzie skwalen. Po raz pierwszy użyto go w szczepionce przeciw­ko wirusowi grypy H5N1, produkowanej przez firmę Glaxo Smith Kline (GSK). W skład adiuwantu MF59 wchodzą skwa­len (10,68 mg), DL-α-tokoferol (11,86 mg) oraz polisorbinian 80 (4,85 mg) [55]. Mechanizm działania tego adiuwantu był badany in vivo z zastosowaniem modelu mysiego oraz ex vivo na ludzkich liniach komórkowych. Morel i wsp. wykazali, że wspomaga on aktywność antygenu dzięki indukcji wytwarza­nia cytokin w miejscu jego wstrzyknięcia oraz w drenujących węzłach chłonnych. Wytwarzanie swoistych cytokin było z kolei związane z napływem do węzłów chłonnych granu­locytów oraz monocytów pobudzonych działaniem antyge­nów. Pobudzanie wytwarzania przeciwciał i cytokin, takich jak CCL2, CCL3, IL-6, CSF3 i CXCL1 było dodatkowo wspoma­gane dzięki zastosowaniu w jego składzie α-tokoferolu [41].
W publikacjach z 2009 r. pojawiają się informacje o zastoso­waniu adiuwantu AS04, będącego kombinacją wodorotlen­ku glinu i MPL. Został on użyty w szczepionkach przeciw­ko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B (HBV - human hepatitis B virus) oraz ludzkiemu wirusowi brodawczaka (HPV - human papilloma virus) [43,56]. Badania przeprowa­dzone na myszach i ludzkich liniach komórkowych wykaza­ły, że dodanie MPL do soli glinu powoduje natychmiastową aktywację komórek prezentujących antygeny oraz induk­cję wytwarzania cytokin w odpowiedzi na podany antygen. Adiuwant ten pobudza czynnik jądrowy NF-κb oraz wytwa­rzanie cytokin, a w następnej kolejności nagromadzenie się komórek dendrytycznych, monocytów i innych APC w wę­złach chłonnych oraz ich transport do miejsca wstrzyknięcia i swoistą odpowiedź limfocytów T. Nie wykazano stymulacji limfocytów T CD4+ ani limfocytów B po podaniu AS04. Wyka­zano zatem, że AS04 stymuluje mechanizmy odpowiedzi wro­dzonej, dzięki zawartości MPL, którego działanie jest wspo­magane i przedłużane dzięki zastosowaniu soli glinu [14].
W przypadku szczepionek podjednostkowych użycie adiu­wantów ma szczególne znaczenie. Substancje te wspomagając odpowiedź immunologiczną, umożliwiają zmniejszenie dawki antygenu, a także ich skuteczną aplikację przez błony śluzo­we oraz poprawienie ich aktywności u dzieci, osób starszych i osób obarczonych defektami lub niedoborami immunolo­gicznymi. Droga od substancji znajdujących się w fazie badań laboratoryjnych do aktywnych i bezpiecznych adiuwantów, które mogą stanowić patentowane produkty farmakologicz­ne, jest niezwykle długa, trudna i kosztowna. Niemniej jednak w piśmiennictwie naukowym ostatnich lat można znaleźć wie­le informacji dotyczących substancji, które mogą pełnić rolę potencjalnych adiuwantów. Najwięcej uwagi poświęca się na zbadanie molekularnych mechanizmów działania adiuwan­tów, umożliwiających ich właściwe zastosowanie i uzyskanie pożądanej odpowiedzi immunologicznej.
Adiuwanty o optymalnej skuteczności wzbudzają odpowiedź odpornościową dzięki aktywacji limfocytów B, zależną od limfocytów T, a także pobudzają mechanizmy odpowiedzi wrodzonej oraz komórki dendrytyczne i monocyty, które przekształcają się w immunostymulujące komórki prezen­tujące antygeny. Adiuwanty opisane wyżej nie wykazują zbyt dużej toksyczności i działań niepożądanych, a tym samym zostały dopuszczone do użytku w konstrukcji szczepionek dla ludzi. Ich liczba nie jest imponująca, jednocześnie nie są one adiuwantami uniwersalnymi, mogącymi tworzyć kom­patybilne mieszaniny ze wszystkimi antygenami. Niemniej jednak prowadzone są prace nad wieloma różnymi adiuwan­tami, które znajdują się na etapie badań laboratoryjnych, a niektóre w fazie badań klinicznych.
PIŚMIENNICTWO
[1] Anderson P.W., Pichichero M.E., Stein E.C., Porcelli S., Betts R.F., Connuck D.M., Korones D., Insel R.A., Zahradnik J.M., Eby R.: Effect of oligosaccharide chain length, exposed terminal group, and hapten loading on the antibody response of human adults and infants to vaccines consisting of Haemophilus influenzae type b capsular antigen unitermally coupled to the diphtheria protein CRM197. J. Immunol., 1989; 142: 2464-2468
[PubMed]  
[2] Bartczak D., Kanaras A.G.: Preparation of peptide-functionalized gold nanoparticles using one pot EDC/sulfo-NHS coupling. Langmuir, 2011; 27: 10119-10123
[PubMed]  
[3] Bell B.A., Wood J.F., Bansal R., Ragab H., Cargo J.3rd, Washington M.A., Wood C.L., Ware L.A., Ockenhouse C.F., Yadava A.: Process development for the production of an E. coli produced clinical grade recombinant malaria vaccine for Plasmodium vivax. Vaccine, 2009; 27: 1448-1453
[PubMed]  
[4] Brooks N.A., Pouniotis D.S., Tang C.K., Apostolopoulos V., Pietersz G.A.: Cellpenetrating peptides: application in vaccine delivery. Biochim. Biophys. Acta, 2010; 1805: 25-34
[PubMed]  
[5] Cabrera O., Cuello M., Soto, C.R., Martínez M.E., Del Campo J.M., Pérez O., Infante J.F., Sierra G.: New method for obtaining conjugated vaccines. Vaccine, 2006; 24, Suppl. 2: 76-78
[PubMed]  
[6] Caminschi I., Shortman K.: Boosting antibody responses by targeting antigens to dendritic cells. Trends Immunol., 2012; 33: 71-77
[PubMed]  
[7] Carter J.M.: Conjugation of peptides to carrier protein via carbodiimide. W: The Protein Protocols Handbook, red.: J.M. Walker. Humana Press, Totowa, New Jersey 1996, 693-694
[8] Chiang T.R., Fanget L., Gregory R., Tang Y., Ardiet D.L., Gao L., Meschter C., Kozikowski A.P., Buelow R., Vuist W.M.: Anti-Gal antibodies in humans and 1,3 α-galactosyl-transferase knockout mice. Transplantation, 2000; 69: 2593-2600
[PubMed]  
[9] Chin'ombe N., Bourn W.R., Williamson A.L., Shephard E.G.: Oral vaccination with a recombinant Salmonella vaccine vector provokes systemic HIV-1 subtype C Gag-specific CD4+ Th1 and Th2 cell immune responses in mice. Virol. J., 2009; 6: 87
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[10] Cho W.S., Dart K., Nowakowska D.J., Zheng X., Donaldson K., Howie S.E.: Adjuvanticity and toxicity of cobalt oxide nanoparticles as an alternative vaccine adjuvant. Nanomedicine, 2012; 7: 1495-1505
[PubMed]  
[11] De Roux A., Schmoele-Thoma B., Siber G.R., Hackell J.G., Kuhnke A., Ahlers N., Baker S.A., Razmpour A., Emini E.A., Fernsten P.D., Gruber W.C., Lockhart S., Burkhardt O., Welte T., Lode H.M.: Comparison of pneumococcal conjugate polysaccharide and free polysaccharide vaccines in elderly adults: conjugate vaccine elicits improved antibacterial immune responses and immunological memory. Clin. Infect. Dis., 2008; 46: 1015-1023
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[12] De Veer M., Kemp J., Chatelier J., Elhay M.J., Meeusen E.N.: The kinetics of soluble and particulate antigen trafficking in the afferent lymph, and its modulation by aluminum-based adjuvant. Vaccine, 2010; 28: 6597-6602
[PubMed]  
[13] Del Giudice G., Fragapane E., Bugarini R., Hora M., Henriksson T., Palla E., O'hagan D., Donnelly J., Rappuoli R., Podda A.: Vaccines with the MF59 adjuvant do not stimulate antibody responses against squalene. Clin. Vaccine Immunol., 2006; 13:1010-1013
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[14] Didierlaurent A.M., Morel S., Lockman L., Giannini S.L., Bisteau M., Carlsen H., Kielland A., Vosters O., Vanderheyde N., Schiavetti F., Larocque D., Van Mechelen M., Garçon N.: AS04, an aluminum salt- and TLR4 agonist-based adjuvant system, induces a transient localized innate immune response leading to enhanced adaptive immunity. J. Immunol., 2009; 183: 6186-6197
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[15] El-Faham A., Subirós Funosas R., Prohens R., Albericio F.: COMU: a safer and more effective replacement for benzotriazole-based uronium coupling reagents. Chemistry, 2009; 15: 9404-9416
[PubMed]  
[16] Flach T.L., Ng G., Hari A., Desrosiers M.D., Zhang P., Ward S.M., Seamone M.E., Vilaysane A., Mucsi A.D., Fong Y., Prenner E., Ling C.C., Tschopp J., Muruve D.A., Amrein M.W., Shi Y.: Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity. Nat. Med., 2011; 17: 479-487
[PubMed]  
[17] Grabarek Z., Gergely J.: Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Anal. Biochem., 1990; 185: 131-135
[PubMed]  
[18] Gudlavalleti S.K., Lee C.H., Norris S.E., Paul-Satyaseela M., Vann W.F., Frasch C.E.: Comparison of Neisseria meningitidis serogroup W135 polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccines made by periodate activation of O-acetylated, non-O-acetylated and chemically de-O-acetylated polysaccharide. Vaccine, 2007; 25: 7972-7980
[PubMed]  
[19] Gupta R.K., Egan W., Bryla D.A., Robbins J. B., Szu S.C.: Comparative immunogenicity of conjugates composed of Escherichia coli O111 O-specific polysaccharide, prepared by treatment with acetic acid or hydrazine, bound to tetanus toxoid by two synthetic schemes. Infect. Immun., 1995; 63: 2805-2810
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[20] Hansson M., Nygren P.A., Stahl S.: Design and production of recombinant subunit vaccines. Biotechnol. Appl. Biochem., 2000; 32: 95-107
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[21] Huang Q., Li D., Kang A., An W., Fan B., Ma X., Ma G., Su Z., Hu T.: PEG as a spacer arm markedly increases the immunogenicity of meningococcal group Y polysaccharide conjugate vaccine. J. Control. Release, 2013; 172: 382-389
[PubMed]  
[22] Ichihashi T., Yoshida R., Sugimoto C., Takada A., Kajino K.: Cross-protective peptide vaccine against influenza A viruses developed in HLA-A*2402 human immunity model. PLoS One, 2011; 6: e24626
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[23] Jacques I., Dubray G.: Escherichia hermannii (ATCC 33651) polysaccharide-protein conjugates: comparison of two conjugation methods for the induction of humoral responses in mice. Vaccine, 1991; 9: 559-563
[PubMed]  
[24] Jennings G.T., Bachmann M.F.: The coming of age of virus-like particle vaccines. Biol. Chem., 2008; 389: 521-536
[PubMed]  
[25] Jin Z., Chu C., Robbins J.B., Schneerson R.: Preparation and characterization of group a meningococcal capsular polysaccharide conjugates and evaluation of their immunogenicity in mice. Infect. Immun., 2003; 71: 5115-5120
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[26] Kasturi S.P., Sachaphibulkij K., Roy K.: Covalent conjugation of polyethyleneimine on biodegradable microparticles for delivery of plasmid DNA vaccines. Biomaterials, 2005; 26: 6375-6385
[PubMed]  
[27] Kiso Y., Yajima H.: Amide formation, deprotonation, and disulfide formation in peptide synthesis. W: Peptides: Synthesis, Structure and Applications, red.: Gutte B. Academic Press, San Diego, California 1995, 46-47
[28] Koller D., Ittner L.M., Muff R., Husmann K., Fischer J.A., Born W.: Selective inactivation of adrenomedullin over calcitonin gene-related peptide receptor function by the deletion of amino acids 14-20 of the mouse calcitonin-like receptor. J. Biol. Chem., 2004; 279: 20387-20391
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[29] Kossaczka Z., Shiloach J., Johnson V., Taylor D.N., Finkelstein A.R., Robbins J.B., Szu S.C.: Vibrio cholerae O139 conjugate vaccines: synthesis and immunogenicity of V. cholera O139 capsular polysaccharide conjugates with recombinant diphtheria toxin mutant in mice. Infect. Immun., 2000; 68: 5037-5043
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[30] Kubler-Kielb J., Majadly F., Biesova Z., Mocca C.P., Guo C., Nussenzweig R., Nussenzweig V., Mishra S., Wu Y., Miller L.H., Keith J.M., Liu T.Y., Robbins J.B., Schneerson R.: A bicomponent Plasmodium falciparum investigational vaccine composed of protein-peptide conjugates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010; 107: 1172-1177
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[31] Lees A., Nelson, Mond J.J.: Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4- dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. Vaccine, 1996; 14: 190-198
[PubMed]  
[32] Lieberman M.M., Nerurkar V.R., Luo H., Cropp B., Carrion R., De la Garza M., Coller B.A., Clements D., Ogata S., Wong T., Martyak T., Weeks-Levy C.: Immunogenicity and protective efficacy of a recombinant subunit West Nile virus vaccine in rhesus monkeys. Clin. Vaccine Immunol., 2009; 16: 1332-1337
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[33] Lin A.Y., Lunsford J., Bear A.S., Young J.K., Eckels P., Luo L., Foster A.E., Drezek R.A.: High-density sub-100-nm peptide-gold nanoparticle complexes improve vaccine presentation by dendritic cells in vitro. Nanoscale Res. Lett., 2013; 8: 72
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[34] Lise D., Dubeaux C., Tello D., Mazier D., Jolivet M., Schlesinger D.H., Audibert F., Chedid L.: Construction of immunogens for synthetic malaria vaccines. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1988; 153: 31-38
[PubMed]  
[35] Liu Z.Q.,Yang P.C.: Hapten may play an important role in food allergen-related intestinal immune inflammation. N. Am. J. Med. Sci., 2011; 3: 103-106
[PubMed]  [Full Text HTML]  
[36] Luciani F., Bull R.A., Lloyd A.R.: Next generation deep sequencing and vaccine design: today and tomorrow. Trends Biotechnol., 2012; 30: 443-452
[PubMed]  
[37] Mahapatro A., Singh D.K.: Biodegradable nanoparticles are excellent vehicle for site directed in-vivo delivery of drugs and vaccines. J. Nanobiotechnology, 2011; 9: 55
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[38] Mishraa D., Kangb H.C., Baeb Y.H.: Reconstitutable charged polymeric (PLGA)2-b-PEI micelles for gene therapeutics delivery. Biomaterials, 2011; 32: 3845-3854
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[39] Miyata T., Harakuni T., Tsuboi T., Sattabongkot J., Ikehara A., Tachibana M., Torii M., Matsuzaki G., Arakawa T.: Tricomponent immunopotentiating system as a novel molecular design strategy for malaria vaccine development. Infect. Immun., 2011; 79: 4260-4275
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[40] Montalbetti C.A., Falque V.: Amide bond formation and peptide coupling. Tetrahedron Lett., 2005; 61: 10827-10852
[41] Morel S., Didierlaurent A., Bourguignon P., Delhaye S., Baras B., Jacob V., Planty C., Elouahabi A., Harvengt P., Carlsen H., Kielland A., Chomez P., Garçon N., Van Mechelen M.: Adjuvant system AS03 containing α-tocopherol modulates innate immune response and leads to improved adaptive immunity. Vaccine, 2011; 29: 2461-2473
[PubMed]  
[42] Peeters C.C., Tenbergen-Meekes A.M., Evenberg D.E., Poolman J.T., Zegers B.J., Rijkers G.T.: A comparative study of the immunogenicity of pneumococcal type 4 polysaccharide and oligosaccharide tetanus toxoid conjugates in adult mice. J. Immunol., 1991; 146: 4308-4314
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[43] Petäjä T., Keränen H., Karppa T., Kawa A., Lantela S., Siitari-Mattila M., Levänen H., Tocklin T., Godeaux O., Lehtinen M., Dubin G.: Immunogenicity and safety of human papillomavirus (HPV)-16/18 AS04-adjuvanted vaccine in healthy boys aged 10-18 years. J. Adolesc. Health., 2009; 44: 33-40
[PubMed]  
[44] Podda A.: The adjuvanted influenza vaccines with novel adjuvants: experience with the MF59-adjuvanted vaccine. Vaccine, 2001; 19: 2673-2680
[PubMed]  
[45] Poolman J., Frasch C., Nurkka A., Kayhty H., Biemans R., Schuerman L.: Impact of the conjugation method on the immunogenicity of Streptococcus pneumoniae serotype 19F polysaccharide in conjugate vaccines. Clin. Vaccine Immunol., 2011; 18: 327-336
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[46] Roberts W.K., Livingston P.O., Agus D.B., Pinilla-Ibarz J., Zelenetz A., Scheinberg D.A.: Vaccination with CD20 peptides induces a biologically active, specific immune response in mice. Blood, 2002; 99: 3748-3755
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[47] Romestand B., Rolland J.L., Commeyras A., Coussot G., Desvignes I., Pascal R., Vandenabeele-Trambouze O.: Dendrigraft poly-L-lysine: a non-immunogenic synthetic carrier for antibody production. Biomacromolecules, 2010; 11: 1169-1173
[PubMed]  
[48] Rudra J.S., Tian Y.F., Jung J.P., Collier J.H.: A self-assembling peptide acting as an immune adjuvant. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010; 107: 622-627
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[49] Seubert A., Monaci E., Pizza M., O'Hagan D.T., Wack A.: The adjuvants aluminum hydroxide and MF59 induce monocyte and granulocyte chemoattractants and enhance monocyte differentiation toward dendritic cells. J. Immunol., 2008; 180: 5402-5412
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[50] Shafer D.E., Toll B., Schuman R.F., Nelson B.L., Mond J.J., Lees A.: Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. II. Selective crosslinking of proteins to CDAP-activated polysaccharides. Vaccine, 2000; 18: 1273-1281
[PubMed]  
[51] Shariati Mehr K., Mousavi S.L., Rasooli I., Amani J., Rajabi M.: A DNA vaccine against Escherichia coli O157:H7. Iran Biomed. J.,. 2012; 16: 133-139
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[52] Sow S.O., Tapia M.D., Diallo S., Keita M.M., Sylla M., Onwuchekwa U.,, Pasetti M.F., Kotloff K.L., Levine M.M.: Haemophilus influenzae type B conjugate vaccine introduction in Mali: impact on disease burden and serologic correlate of protection. Am. J. Trop. Med. Hyg., 2009; 80: 1033-1038
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[53] Storni T., Kündig T.M., Senti G., Johansen P.: Immunity in response to particulate antigen-delivery systems. Adv. Drug Deliv. Rev., 2005; 57: 333-355
[PubMed]  
[54] Timkovich R.: Detection of the stable addition of carbodiimide to proteins. Anal. Biochem., 1977; 79: 135-143
[PubMed]  
[55] Treanor J.J., Campbell J.D., Zangwill K.M., Rowe T., Wolff M.: Safety and immunogenicity of an inactivated subvirion influenza A (H5N1) vaccine. N. Engl. J. Med., 2006; 354: 1343-1351
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[56] Vanacker A., Vandewiele I., Verbanck J., Schepkens H., De Schoenmakere G., De Laere E., Maes B.: Transiently positive hepatitis B surface antigen after vaccination with the new hepatitis B vaccine HBV-AS04. Am. J. Kidney Dis., 2008; 52: 1028-1029
[PubMed]  
[57] Watarai S., Iwase T., Tajima T., Yuba E., Kono K.: Efficiency of pH-sensitive fusogenic polymer-modified liposomes as a vaccine carrier. Scientific World Journal, 2013; 2013: 903234
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[58] Weinrich Olsen A., van Pinxteren L.A., Meng Okkels L., Birk Rasmussen P., Andersen P.: Protection of mice with a tuberculosis subunit vaccine based on a fusion protein of antigen 85b and esat-6. Infect. Immun., 2001; 69: 2773-2778
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[59] Wessels M.R., Paoletti L.C., Guttormsen H.K., Michon F., D'Ambra A.J., Kasper D.L.: Structural properties of group B Streptococcal type III polysaccharide conjugate vaccines that influence immunogenicity and efficacy. Infect. Immun., 1998; 66: 2186-2192
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[60] Zanetti A.R.,Van Damme P., Shouval D.: Vaccination against hepatitis B: a historical overview. Hot Topics Viral Hepatitis, 2007; 5: 7-12
[Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[61] Zhang Y., He F., Wan Y., Meng M., Xu J., Yi J., Wang Y., Feng C., Wang S., Xi R.: Generation of anti-trenbolone monoclonal antibody and establishment of an indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay for detection of trenbolone in animal tissues, feed and urine. Talanta, 2011; 83: 732-737
[PubMed]  
Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.