Postepy Hig Med Dosw. (online), 2013; 67: 1119-1127
Review
Full Text PDF  

Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe w raku płuca - znaczenie w diagnostyce i ocenie odpowiedzi układu odpornościowego
Bronchoalveolar lavage in lung cancer - diagnostic value and assessment of the anti-cancer immune response
Iwona Osińska, Joanna Domagała-Kulawik
Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii. Warszawski Uniwersytet Medyczny
Adres do korespondencji
prof. Joanna Domagała-Kulawik, Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii. Warszawski Uniwersytet Medyczny, 02-097 Warszawa, ul. Banacha 1a; e-mail: domagalakulawik@gmail.com

Otrzymano:  2013.02.21
Zaakceptowano:  2013.08.13
Opublikowano:  2013.11.26

Streszczenie
Rak płuca należy do najgroźniejszych nowotworów na świecie. Mimo postępu w leczeniu i prowadzeniu licznych badań nowotwór ten pozostaje pierwszą przyczyną zgonów na nowo­twory złośliwe u obu płci, a całkowite wyleczenie nie przekracza 15%. Zalicza się go do nowo­tworów litych, w swoim rozwoju uruchamia mechanizmy wymykania się spod nadzoru immu­nologicznego. Obserwowane są np.: osłabiona i zmieniona antygenowość, osłabienie funkcji komórek prezentujących antygen, wzmożona apoptoza komórek cytotoksycznych naciekają­cych guz, hamowanie odpowiedzi immunologicznej przez komórki regulatorowe. Rozpozna­nie tych mechanizmów wydaje się podstawowe w walce z rakiem płuca. Mały odsetek guzów kwalifikujących się do resekcji sprawia, że badanie odpowiedzi immunologicznej w środowisku raka płuca jest bardzo ograniczone. Rolę tę może spełnić badanie płynu oskrzelowo-pęche­rzykowego (BALF) w zakresie składu komórkowego, subpopulacji limfocytów i składu cytokin dzięki swoim właściwościom i możliwościom pobrania podczas diagnostycznego badania bron­choskopowego. BALF kwalifikuje się do badania nowoczesną metodą cytometrii przepływo­wej, co umożliwia precyzyjną ocenę fenotypu komórek limfoidalnych i ekspresję czynników regulatorowych na komórkach w otoczeniu guza. Dotychczasowe wyniki badań wykazały, że skład płynu z BAL zmienia się istotnie u chorych na raka płuca, ale także pod wpływem pale­nia papierosów, co jest z tym nowotworem nieodłącznie związane. Poza znaczeniem w ocenie zmian immunologicznych w środowisku nowotworu, BAL spełnia kryteria badania diagno­stycznego w guzach rozsianych i położonych obwodowo. W artykule omówiono możliwości wykorzystania tej wystandaryzowanej metody w diagnostyce raka płuca i ocenie środowiska jego rozwoju przed podjęciem systemowego leczenia.
Słowa kluczowe: rak płuca • BAL • limfocyty • komórki regulatorowe


Summary
Lung cancer is the most serious neoplasm worldwide. Despite significant progress in the tre­atment regimens and ongoing research development, lung cancer remains the first cause of cancer death in both sexes, and 5-year survival does not exceed 15%. The failure of host defense against this solid tumor is well known. The mechanisms of escaping from immune surveillance include, among others, changing of cancer cells' antigenicity, impaired function of antigen-presenting cells, enhancing apoptosis of tumor-infiltrating cytotoxic cells, and immune response inhibition by regulatory cells. To recognize these mechanisms well is very important in anti-cancer therapy. The small number of resectable cases of lung cancer causes very low availability of tumor environment examination. The cellular pattern and cytokine concentration in bronchoalveolar fluid (BALF), which can be performed during diagnostic bronchofiberoscopy, reflects the changes in tumor milieu. The character of BAL fluid qualifies this material for analysis by flow cytometry with precise evaluation of lymphoid cell pheno­type and measurement of the surface and cytoplasmic molecules' regulatory properties. The results of previous studies have shown that the BAL fluid composition well characterized the local immune response in patients with lung cancer. However, many of the cases resulted from the influence of tobacco smoke, which is inextricably connected with cancer. Furthermore, BAL fulfills the diagnostic criteria in peripheral tumors and in disseminated malignant chan­ges in the lung. We discuss the usefulness of this well-standardized method in the diagnosis of lung cancer and in the assessment of the local immune response prior to systemic treatment.
Key words: rak płuca • BAL • limfocyty • komórki regulatorowe




Wykaz skrótów:
APC - komórka prezentująca antygen (antygen presenting cells); B - B limfocyt (B lymphocyte); BAL - płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (bronchoalveolar lavage); BALF - płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (bronchoalveolar lavage fluid); CEA - antygen karcynoembrionalny (carcino-embryonic antygen); CD - kompleks różnicowania (cluster of differentiation); CTLA-4 - cytotoksyczny antygen limfocytów T (cytotoxic T-lymphocyte antygen 4); Fas - receptor śmierci (death receptor); FasL - ligand dla receptora Fas (Fas ligand); IDO - 2,3-dioksygenaza indoloaminy (indoleamine 2,3-dioxygenase); IL - interleukina (interleukin); M1, M2 - makrofagi typu M1, M2 (macrophages); MHC - główny układ zgodności tkankowej (major histocompatibility complex); NK - naturalny zabójca (natural killer); PB - krew obwodowa (peripheal blood); Tc - T cytotoksycz­ny limfocyt (T cytotoxic lymphocyte); TGF-β - transformujący czynnik wzrostu β (transforming growth factor); Th - T pomocniczy limfocyt (T helper lymphocyte); Treg - T regulatorowy limfocyt (T regulatory lymphocyte)
Znaczenie badania płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego w ocenie raka płuca
Rak płuca - zarys problemu
Powszechne występowanie raka płuca (rocznie ponad 1 milion 300 tysięcy zachorowań na świecie) oraz złe ro­kowanie skłania do ciągłego podejmowania badań nad tym nowotworem. Rak płuca zajmuje pierwsze miejsce wśród przyczyn zgonów z powodu nowotworów złośli­wych w Polsce i na świecie [12], jest najczęstszym typem nowotworu u mężczyzn w Polsce i przyczyną aż 1/3 zgo­nów z powodu nowotworów złośliwych. W 2008 r. liczba zgonów z powodu raka płuca wynosiła w Polsce prawie 17 000 mężczyzn i 5 600 kobiet. Od początku lat 90 ub.w. obserwuje się jednak zahamowanie rosnącego zagroże­nia tym nowotworem i powolny systematyczny spadek u mężczyzn [13]. W populacji kobiet w Polsce w 2007 r. po raz pierwszy częstość zgonów z powodu nowotworu płuca wyprzedziła częstość zgonów związanych z rakiem piersi [14,31]. Podobnie w większości krajów europejskich notuje się bardzo szybki wzrost częstości raka płuca u ko­biet [51]. Zachorowalność i umieralność z powodu raka płuca jest skorelowana z wiekiem - największe zagrożenie w grupie pacjentów w najstarszym wieku obu płci. Udoku­mentowano istotny związek przyczynowy występowania raka płuca z paleniem papierosów [15].
Ze względu na różnice w biologii, przebiegu klinicznym i sposobie leczenia wyodrębnia się niedrobnokomórko­wego (NDRP) oraz drobnokomórkowego (DRP) raka płu­ca. W związku z nowymi sposobami leczenia, zwłaszcza w terapii celowanej znaczenie kliniczne ma precyzyjne rozpoznanie podtypu NDRP: raka płaskonabłonkowego i gruczołowego [32]. W ostatnich latach pojawiła się nowa siódma edycja klasyfikacji TMN oceny zaawansowania raka płuca [56]. W raku płuca nadal dużym problemem pozostaje zbyt późne rozpoznanie. W większości przypad­ków nowotwór płuca rozpoznaje się w zaawansowanym stadium. Całkowite wyleczenie osiąga się ogółem u około 15% chorych. Prawie 70% chorych nie kwalifikuje się do leczenia operacyjnego w chwili rozpoznania. To również sprawia, że w dużym odsetku chorych guz niedostępny jest do pełnej diagnostyki histopatologicznej, ale także utrudnia znacznie badania poznawcze. Rozpoznawanie raka płuca opiera się na badaniu wycinka tkankowego lub materiału cytologicznego pobranego z guza podczas badania en­doskopowego-bronchofiberoskopii. W pewnym odsetku przypadków guzy położone są obwodowo i pozostają poza zasięgiem bronchoskopu.
W badaniach poznawczych dotyczących patomechanizmu nowotworzenia, ekspansji nowotworu oraz odpowiedzi go­spodarza na jego rozwój wykorzystuje się materiał opera­cyjny, drobne wycinki lub krew obwodową. W pierwszym przypadku dane dotyczące zmian w obrębie nacieku wo­kół guza usuniętego operacyjnie ograniczają zakres wiedzy do mało zaawansowanych stadiów operacyjnego raka nie­drobnokomórkowego. Badania prowadzone z wykorzysta­niem krwi obwodowej nie pozwalają na wykazanie zmian miejscowych, krew służy jako materiał do oceny zmian ogólnoustrojowych. Tymczasem wiadomo, że środowisko płuc wykazuje pewną odrębność pod względem charakteru odpowiedzi immunologicznej zarówno u osób zdrowych jak i u osób z chorobami płuc. Badaniem, które umożliwia uzyskanie bogatego materiału komórkowego i substancji pozakomórkowych ze znacznego obszaru obwodowych dróg oddechowych jest płukanie oskrzelowo-pęcherzyko­we (BAL) [6].
BAL - metoda oceny stanu immunologicznego płuc
Płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF) po­bierany jest w czasie badania bronchofiberoskopowego. Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL) jest to bada­nie umożliwiające pozyskanie materiału komórkowego i niekomórkowego z przestrzeni oskrzelowo- pęcherzy­kowej (z powierzchni nabłonka obwodowego dróg od­dechowych) [45]. BAL jest to metoda stosunkowo mało inwazyjna, opracowano standardy wykonania i oceny uzyskanego materiału [6]. W praktyce badanie polega na wprowadzeniu w porcjach około 100-250 ml płynu (soli fizjologicznej) ogrzanego do temperatury 37°C i odessa­niu go, przy czym zwykle odzyskuje się ok. 50-70% pier­wotnej objętości. W wyniku „przepłukania" powierzchni pęcherzyków płucnych solą fizjologiczną otrzymuje się kilka milionów komórek o żywotności ponad 90%. Skład komórkowy od osób zdrowych niepalących jest stały i różni się od składu komórkowego palaczy papierosów [6,26] (tabela 1).
Tabela 1. Porównanie składu komórkowego płynu z BAL od osób zdrowych niepalących i osób palących tytoń [6,26]

Poza klasycznym badaniem cytologicznym bardzo cen­ną metodą badania BALF jest cytometria przepływowa. BALF zawiera dużą liczbę żywych komórek, które stano­wią naturalną zawiesinę, przez co może być wykorzysty­wany do oceny fenotypu komórek czy cytokin wewnątrz­komórkowych. Problemem może być domieszka śluzu, pyłów lub ewentualnie krwi przy ocenie płynu z wyko­rzystaniem technik cytometrii przepływowej. Wykazano jednak, że po wyeliminowaniu tego problemu, możliwe jest uzyskanie spójnych i wiarygodnych wyników, kore­lujących z oceną fenotypu komórek metodą immunocy­tochemiczną [49].
Aby wyniki badania materiału z BAL były wiarygodne i spójne konieczne jest opracowanie materiału uzyskane­go z BAL, według ogólnie przyjętych zasad [6]. Próbki powinny spełniać następujące kryteria:
• nie mogą zawierać widocznych domieszek śluzu ani py­łów, które mogą prowadzić do autofluorescencji;
• nie mogą również zawierać wyraźnej domieszki krwi;
• odzysk płynu musi wynosić co najmniej 30%.
Podstawowym zastosowaniem praktycznym badania pły­nu z BAL jest diagnostyka chorób rozsianych płuc, w tym infekcji, chorób śródmiąższowych czy zawodowych. Wła­ściwości materiału pozyskanego podczas tego mało inwa­zyjnego badania warunkują bardzo szerokie zastosowanie BAL jako metody poznawczej. Skład komórkowy i cyto­kinowy płynu z BAL odzwierciedla bowiem rzeczywisty stan układu immunologicznego i jego homeostazę w zdro­wiu oraz podstawowe mechanizmy naruszenia tego stanu w procesach chorobowych. Jako naturalna zawiesina ko­mórkowa płyn z BAL kwalifikuje się do badania z zasto­sowaniem nowoczesnych technik [3,6]. W oparciu o dane literaturowe i doświadczenie własne autorów, znaczenie badania BAL w przypadku rozrostów nowotworowych można ująć w dwóch aspektach:
1) badanie diagnostyczne guzów rozsianych i zlokalizo­wanych obwodowo,
2) badanie stanu miejscowego układu immunologicznego środowiska rozwoju nowotworu.
Badanie BALF pozwala na ocenę zmian w znacznym ob­szarze płuc, stanowiącym miejsce rozwoju nowotworu, u chorych w różnych stadiach zaawansowania guza, także nieoperacyjnych. Korzyści wynikające z wykorzystania tego materiału do badania u chorych na raka płuca zo­stały podsumowane na rycinie 1. Jednym z praktycznych zastosowań BAL może być zbadanie stanu układu odpor­nościowego przed wdrożeniem chemioterapii w tym łatwo dostępnym materiale, co może poprawić odpowiedni dobór środków leczniczych i wpisuje się w aktualne zalecenia terapii personalizowanej.
Ryc. 1. Korzyści płynące z wykorzystania tego materiału do badania u chorych z rakiem płuca

BAL- znaczenie w diagnostyce raka płuca
Pierwsze badania z wykorzystaniem płynu z BAL u cho­rych na raka płuca przeprowadzone były w małych grupach badanych. Jednak już w tych badaniach pró­bowano wyjaśnić znaczenie zastosowania tej metody w diagnostyce guzów płuc [39] i postawiono tezę, że ocena składników komórkowych i humoralnych w BALF może dostarczyć nowych informacji na temat mecha­nizmów chorobotwórczych zachodzących w raku płuca [47]. Oceniano między innymi stężenia markerów no­wotworowych, takich jak antygen karcinoembrionalny (CEA), co jednak nie znalazło zastosowania praktyczne­go [9]. Badania te wykazały że płukanie oskrzelowo-pę­cherzykowe i ocena płynu jest użytecznym narzędziem w diagnostyce nacieków w płucach. Skuteczność diagno­styczna BAL okazała się porównywalna z przezoskrzelo­wą biopsją aspiracyjną cienkoigłową, a metoda cennym narzędziem diagnostycznym w rozpoznawaniu obwo­dowych pierwotnych nowotworów płuc [11,34,42,44]. Publikacje te powstały w latach 80-90 ubiegłego wieku i mimo że płyn z BAL stanowi bardzo cenny materiał, brakuje aktualnych opracowań dotyczących użyteczno­ści jego badania w diagnostyce raka płuca.
Badanie cytologiczne BAL znajduje zastosowanie w dia­gnostyce różnicowej zmian w płucach o charakterze roz­sianym. Taką postać morfologiczną mogą mieć rozrosty limfoproliferacyjne, które wymagają różnicowania z infek­cjami i chorobami śródmiąższowymi. Możliwa jest zarów­no identyfikacja komórek chłoniaka w badaniu cytologicz­nym popartym badaniem immunocytochemicznym [7,43], jak i ocena fenotypu komórek limfoidalnych w cytometrii przepływowej. W przypadku płynu ze znaczną przewagą limfocytów rozpoznanie fenotypu limfocytów B (CD19 lub CD20+) może wskazywać na rozrost limfoproliferacyj­ny (limfocyty B stanowią nieliczną populację w warunkach zdrowia) i ukierunkować dalszą diagnostykę. Możliwość rozpoznania procesu rozrostowego w BAL i różnicowa­nie z czynnikami infekcyjnymi uzasadnia wykorzystanie badania w transplantologii [36,43].
Rak gruczołowy jest tym typem histologicznym pierwotne­go raka płuca, który może być rozpoznawany z największą czułością z wykorzystaniem płukania oskrzelowo-pęche­rzykowego [43]. W poprzedniej klasyfikacji histologicz­nej znajdował się typ oskrzelikowo-pęcherzykowy, któ­ry objawiał się drobnoguzkowymi zmianami rozsianymi. Typ ten został wykreślony z obecnej klasyfikacji raka gru­czołowego [32]. Biorąc pod uwagę charakter rozrostów gruczołowych wymienionych w nowej klasyfikacji wy­daje się, że BAL może znajdować największe znaczenie w diagnostyce w typie z tapetowaniem przegród lub zmian o charakterze przednowotworowego rozrostu gruczołowe­go. W związku z potencjalną możliwością rozpoznania procesu nowotworowego zaleca się każdorazowe wyko­nywanie preparatów utrwalonych w alkoholu i barwio­nych hematoksyliną-eozyną, jak w badaniach histopato­logicznych oraz konsultowanie preparatów z obecnością komórek atypowych przez patomorfologa [6]. Niekiedy zmiany odczynowe komórek nabłonka pęcherzykowego (AEC II), jak również nietypowe obrazy komórek układu immunologicznego, takie jak makrofagi, mogą stwarzać trudności diagnostyczne i budzić podejrzenie procesu zło­śliwego [19].
Zaburzenia mechanizmów immunologicznych w raku płuca
W środowisku toczącego się nowotworu dochodzi do znacznych zmian i zaburzeń immunologicznych. Kli­niczne ujawnienie się nowotworu litego, jakim jest rak płuca wiąże się z wymknięciem spod nadzoru immuno­logicznego, w którym udział biorą liczne mechanizmy, przedstawione schematycznie na rycinie 2. Głównymi komórkami zdolnymi do efektu cytotoksycznego, który jest hamowany w przebiegu nowotworu, są limfocyty T cytotoksyczne (Tc, CD8+), które „rozpoznają" obcą tkankę guza m.in. za pomocą komórek prezentujących antygen (APC-antigen presenting cells) [52]. Do pełnej aktywacji limfocytów cytotoksycznych niezbędne jest przekazanie sygnału kostymulującego m.in. poprzez czą­steczki B7 na powierzchni komórki prezentującej anty­gen i ich receptorów (CD28) na powierzchni limfocytu. Wykazano, że jedną z przyczyn upośledzenia rozpozna­wania komórek nowotworowych są zaburzenia lub brak cząsteczek kostymulujących na komórkach guza oraz na komórkach prezentujących antygen w środowisku nowotworu. Cząsteczki B7 mogą również przekazywać sygnał supresyjny przez oddziaływanie z cząsteczkami CTLA-4, które hamują przekaz sygnału przez receptor TCR limfocytów T [1,20]. Badania innych autorów wy­kazują, że wraz ze wzrostem liczby komórek T-regula­torowych wzrasta ekspresja czynnika CTLA4, i ma to również związek z zaawansowaniem choroby i gorszym rokowaniem [22]. Dlatego istotne wydaje się - podczas analizowania zaburzeń mechanizmów immunologicznych - uwzględnienie ekspresji cząsteczek CTLA-4 na komór­kach limfoidalnych w środowisku raka płuca. Wykazano również, że antygeny krążące, które zostały uwolnione z komórki nowotworowej lub też fragmenty komórki no­wotworowej mogą działać jak czynniki blokujące i po­wodować blokowanie limfocytów efektorowych. Innym mechanizmem powodującym „wymknięcie" się komórki nowotworowej spod nadzoru układu immunologicznego jest maskowanie antygenów na powierzchni komórki nowotworowej przez przeciwciała, co blokuję dostęp właściwych komórek efektorowych. Ponadto komórki nowotworowe mają bardzo często obniżoną ekspresję lub brak cząsteczek MHC, a antygeny nowotworowe są heterogenne [1].
Ryc. 2. Ucieczka komórki nowotworowej spod nadzoru układu immunologicznego

Komórki nowotworowe niszczone są m.in. w procesie apoptozy. Jednym z najbardziej aktywnych układów w me­chanizmie apoptozy jest układ Fas/FasL (ligand). Apopto­zie ulegają komórki, które mają na powierzchni receptor Fas, po połączeniu z FasL [30]. Obroną nowotworu przed niszczeniem jest znaczący ubytek Fas na powierzchni ko­mórek raka, a także wpływ na ubytek limfocytów cyto­toksycznych w jego otoczeniu. Zaobserwowano wzrost ekspresji liganda dla białka Fas na komórce nowotworo­wej, co doprowadza do niszczenia limfocytów cytotok­sycznych naciekających guz [33]. Dodatkowo obserwuje się zwiększoną ekspresję receptora Fas na limfocytach w środowisku raka.
Komórki nowotworowe zdolne są do wydzielania substan­cji działających hamująco na układ odpornościowy. Jed­nym z najlepiej poznanych czynników o takim działaniu jest identyfikowany w zwiększonych stężeniach w guzach i w hodowlach komórek nowotworowych, transformujący czynnik wzrostu TGF-β [4,23]. Podobne działanie przypi­suje się IL-10, IL-2 oraz 2,3-dioksygenazę indoloaminy, indukującej ekspresję CTLA-4.
Najnowsze wyniki badań nad odpowiedzią immunolo­giczną w nowotworach wskazują na udział w tym proce­sie komórek regulatorowych. Stwierdzono, że limfocyty T-regulatorowe (Treg) są zdolne do hamowania aktywności limfocytów T (CD4+, CD8+), komórek dendrytycznych oraz komórek NK (natural killers). Odgrywają istotną rolę w mechanizmach nadzoru i tolerancji immunologicznej. Komórki Treg stanowią nieliczną grupę limfocytów CD4+, a identyfikowane są m.in. poprzez ekspresję na ich po­wierzchni odpowiednich antygenów [46]. Do pełnej funk­cji limfocyty Treg potrzebują czynnika transkrypcyjne­go Foxp3. Dotychczasowe badania wykazały zwiększone stężenie tego białka w nowotworach, niezależnie od typu guza [27]. Ponadto stwierdzono, że Foxp3+ Treg są złym czynnikiem rokowniczym [41].
Wielu badaczy podkreśla istotną rolę, jaką pełni w funkcji komórek Treg cząsteczka kostymulująca CTLA4, której działaniem jest negatywna regulacja odpowiedzi immu­nologicznej [2,38]. Pojawiły się również publikacje na te­mat regulacji odpowiedzi immunologicznej w raku płuca [54,55]. Potwierdzono zwiększenie odsetka komórek T­-regulatorowych. Opisane dotychczas badania dotyczyły jednak głównie zmian we krwi obwodowej.
Przydatność BALw ocenie stanu immunologicznego płuc u chorych na raka płuca
Wymienione wyżej zaburzenia w odporności przeciwno­wotworowej znajdują odzwierciedlenie w składzie komór­kowym i cytokinowym płynu z BAL. U chorych na raka płuca znamiennie zwiększa się liczba komórek w BAL, przy czym za zwiększenie cytozy odpowiadają głównie makrofagi. Ich liczba jest większa, ale wykazano upośle­dzoną funkcję tych komórek [10,25].
Badania własne dotyczące oceny subpopulacji limfocytów w BALF u chorych na raka płuca potwierdziły udział limfocy­tów w obronie przeciwnowotworowej i różnice w porówna­niu z osobami zdrowymi. Zaobserwowano zwiększony odse­tek limfocytów T oraz zmniejszony limfocytów B i komórek NK w BALF od chorych. Dodatkowo stosunek limfocytów T CD4+/CD8+ był znacząco niższy w BALF w porównaniu do osób zdrowych. Potwierdzono, że zachodzą istotne zmiany w lokalnej odpowiedzi układu odpornościowego w przebiegu rozwoju nowotworu płuca. Wszystkie badane osoby były pa­laczami [17]. W badaniu zaburzeń immunologicznych w raku płuca udowodniono szkodliwy wpływ palenia papierosów na zmiany immunologiczne [16,24]. Okazało się, że zachodzą istotne różnice w fenotypie limfocytów w BALF między chorymi na raka płuca i osobami zdrowymi, jak i między palaczami i osobami niepalącymi. Całkowita liczba komórek w BALF u palaczy tytoniu była istotnie zwiększona. Zaobser­wowano niski odsetek komórek T-pomocniczych (Th) oraz zwiększony - komórek T-supresorowych/cytotoksycznych (Ts/c) w BALF u palaczy z rakiem płuca. Stosunki limfo­cytów Th do Ts/c i Th do T były znacząco niższe w BALF u zdrowych palaczy w porównaniu do niepalących. Udział limfocytów T-aktywowanych był zmniejszony w grupie cho­rych palaczy na raka płuca w porównaniu do osób zdrowych palących. Wyniki wskazują na konieczność dokładnej oceny historii palenia podczas analizy płynu z BAL [24] (tabela 2). Wpływ dymu tytoniowego na zmiany fenotypu limfocytów w BALF został zaobserwowany przez innych badaczy, którzy podkreślają zwiększony udział limfocytów T i limfocytów T­-cytotoksycznych CD8+, zmniejszony stosunek limfocytów CD4+/CD8+ (Ts/Tc) [8,21,35,53]. Ponadto stwierdzono ha­mujący wpływ dymu papierosowego na liczbę oraz funkcję komórek NK [48,50].
Tabela 2. Porównanie zmian w subpopulacji limfocytów u osób palących i niepalących, zdrowych i z rakiem płuca [24]

Analizując skład cytokinowy BALF stwierdzono istotne zwiększenie stężenia TGF-β u chorych na raka płuca w po­równaniu do zdrowych, które dodatkowo korelowało ze stopniem zaawansowania nowotworu [18].
W niedawnych badaniach, w których wykorzystano płyn z BAL do oceny wskaźników oksydacji i markerów za­palnych u chorych na raka płuca zaobserwowano dodatnią korelację między stężeniami przeciwutleniaczy i cytokin prozapalnych w środowisku lokalnym, czego nie zaob­serwowano w badaniu próbki surowicy krwi obwodowej [29]. W najświeższych badaniach ponownie wykazano, że płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe poprawia dokład­ność diagnostyczną u pacjentów z rozsianymi chorobami płuc. W badaniu uwzględniono nieliczną grupę chorych na raka płuca. Udowodniono przydatność oceny fenotypu limfocytów w diagnostyce różnicowej [5]. Inne badanie ukierunkowane zostało na zastosowanie nowej techniki - proteomiki w poszukiwaniu białkowych biomarkerów [40]. Jak wykazano w wielu badaniach w rozwoju nowo­tworów złośliwych główną role odgrywają komórki ma­cierzyste raka [28,37].
Dzięki poznaniu fenotypu tych komórek ich identyfikacja w BALF jest możliwa i z pewnością znajdzie zastosowa­nie praktyczne [wyniki własne, w druku]. Przedstawione wyniki badań zachęcają do kontynuowania i rozwinięcia zagadnienia dotyczącego przydatności płynu z BAL do oceny stanu immunologicznego u chorych z rakiem płuca.
Podsumowanie
Wykonując badanie BAL zgodnie z przyjętymi zasadami i rozszerzając je o technikę cytometrii przepływowej, która jest coraz bardziej dostępna i uznana jako metoda diagno­styczna, można uzyskać obraz stanu układu odpornościo­wego w środowisku płuc chorych we wszystkich stadiach zaawansowania raka płuca. Badanie bronchofiberoskopowe wykonywane jest prawie w każdym przypadku przed podję­ciem leczenia, a rozszerzenie procedury o płukanie i włącze­nie oceny BALF w toku rutynowej diagnostyki guza płuca jest możliwe. Zastosowanie klasycznego, powszechnie do­stępnego panelu przeciwciał identyfikujących subpopulacje limfocytów, jak przedstawiono w tabeli 3, pozwala na dość dokładną ocenę stanu środowiska płuc przed podjęciem le­czenia. W analizie wyników badania płynu z BAL należy brać pod uwagę wpływ palenia papierosów, który w poważnym stopniu zaburza równowagę immunologiczną płuc. Niemniej i w tym zakresie obserwuje się zmiany, bowiem wzrasta licz­ba chorych na raka płuca, którzy nigdy nie palili papierosów.
Tabela 3. Przykłady przeciwciał służących do oceny fenotypu subpopulacji w płynie z BAL

Nieocenione jest znaczenie poznawcze badania płynu z BAL, które pozwala na szczegółową ocenę licznych me­chanizmów ucieczki komórki nowotworowej spod nadzoru układu immunologicznego. Wyniki kolejnych badań do­kumentują możliwości rozpoznania nowych szlaków ko­mórkowych i cytokinowych biorących udział w procesie patologicznym oraz czynników o znaczeniu regulatoro­wym. Wykorzystanie tej metody u chorych na raka płuca może wpłynąć na ugruntowanie jej znaczenia w ocenie biologii tego groźnego nowotworu.
PIŚMIENNICTWO
[1] Aerts J.G., Hegmans J.P.: Tumor-specific cytotoxic T cells are crucial for efficacy of immunomodulatory antibodies in patients with lung cancer. Cancer Res., 2013; 73: 2381-2388
[PubMed]  
[2] Baecher-Allan C., Viglietta V., Hafler D.A.: Human CD4+CD25+ regulatory T cells. Semin. Immunol., 2004; 16: 89-98
[PubMed]  [Full Text HTML]  
[3] Baughman R.P.: Technical aspects of bronchoalveolar lavage: recommendations for a standard procedure. Semin. Respir. Crit. Care Med., 2007; 28: 475-485
[PubMed]  
[4] Bennett W.P., el-Deiry W.S., Rush W.L., Guinee D.G., Jr., Freedman A.N., Caporaso N.E., Welsh J.A., Jones R.T., Borkowski A., Travis W.D., Fleming M.V., Trastek V., Pairolero P.C., Tazelaar H.D., Midthun D., Jett J.R., Liotta L.A., Harris C.C.: p21waf1/cip1 and transforming growth factor beta 1 protein expression correlate with survival in non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res., 1998; 4: 1499-1506
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[5] Capelozzi V.L., Faludi E.P., Balthazar A.B., Fernezlian Sde M., Filho J.V., Parra E.R.: Bronchoalveolar lavage improves diagnostic accuracy in patients with diffuse lung disease. Diagn. Cytopathol., 2013; 41: 1-8
[PubMed]  [Full Text HTML]  
[6] Chciałowski A., Chorostowska-Wynimko J., Fal A., Pawłowicz R., Domagała-Kulawik J.: Recommendation of the Polish Respiratory Society for bronchoalveolar lavage (BAL) sampling, processing and analysis methods. Pneumonol. Alergol. Pol., 2011; 79: 75-89
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[7] Costabel U.: Atlas of bronchoalveolar lavage. Chapman & Hall Medical, London, New York 1999
[8] Costabel U., Bross K.J., Reuter C., Rühle K.H., Matthys H.: Alterations in immunoregulatory T-cell subsets in cigarette smokers. A phenotypic analysis of bronchoalveolar and blood lymphocytes. Chest, 1986; 90: 39-44
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[9] Dabrowska M., Grubek-Jaworska H., Domagała-Kulawik J., Bartoszewicz Z., Kondracka A., Krenke R., Nejman P., Chazan R.: Diagnostic usefulness of selected tumor markers (CA125, CEA, CYFRA 21-1) in bronchoalveolar lavage fluid in patients with non-small cell lung cancer. Pol. Arch. Med. Wewn., 2004; 111: 659-665
[PubMed]  
[10] Dabrowska M., Grubek-Jaworska H., Hoser G., Domagała-Kulawik J., Krenke R., Chazan R.: Effect of IFN-gamma stimulation on expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) on alveolar macrophages in patients with non-small cell lung cancer. J. Interferon Cytokine Res., 2006; 26: 190-195
[PubMed]  
[11] de Gracia J., Bravo C., Miravitlles M., Tallada N., Orriols R., Bellmunt J., Vendrell M., Morell F.: Diagnostic value of bronchoalveolar lavage in peripheral lung cancer. Am. Rev. Respir. Dis., 1993; 147: 649-652
[PubMed]  
[12] Dela Cruz C.S., Tanoue L.T., Matthay R.A.: Lung cancer: epidemiology, etiology, and prevention. Clin. Chest Med., 2011; 32: 605-644
[PubMed]  [Full Text HTML]  
[13] Didkowska J.: Epidemiologia nowotworów złośliwych w Polsce. CMKP, Warszawa 2011
[14] Didkowska J., Wojciechowska U., Zatoński W.: Trendy umieralności na nowotwory złośliwe. Polska na tle Europy. W: Nowotwory złośliwe w Polsce w 2007 roku, red.: Didkowska J., Wojciechowska U., Zatoński W., KRN, Warszawa 2009, 31-38
http://onkologia.org.pl/wp-content/uploads/Nowotwory_2007.pdf
[15] Doll R., Peto R.: The causes of cancer: quantitative estimates of avoidable risks of cancer in the United States today. J. Natl. Cancer Inst., 1981; 66: 1191-1308
[PubMed]  
[16] Domagała-Kulawik J., Guzman J., Costabel U.: Immune cells in bronchoalveolar lavage in peripheral lung cancer - analysis of 140 cases. Respiration, 2003; 70: 43-48
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[17] Domagała-Kulawik J., Hoser G., Droszcz P., Kawiak J., Droszcz W., Chazan R.: T-cell subtypes in bronchoalveolar lavage fluid and in peripheral blood from patients with primary lung cancer. Diagn. Cytopathol., 2001; 25: 208-213
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[18] Domagała-Kulawik J., Hoser G., Safianowska A., Grubek-Jaworska H., Chazan R.: Elevated TGF-β1 concentration in bronchoalveolar lavage fluid from patients with primary lung cancer. Arch. Immunol. Ther. Exp., 2006; 54: 143-147
[PubMed]  
[19] Domagała-Kulawik J., Olszewski W.T.: Atlas Cytopatologii Układu Oddechowego. Alfa-medica press, Bielsko-Biała 2009
[20] Egen J.G., Kuhns M.S., Allison J.P.: CTLA-4: new insights into its biological function and use in tumor immunotherapy. Nat. Immunol., 2002; 3: 611-618
[PubMed]  
[21] Ekberg-Jansson A., Andersson B., Avra E., Nilsson O., Löfdahl C.G.: The expression of lymphocyte surface antigens in bronchial biopsies, bronchoalveolar lavage cells and blood cells in healthy smoking and never-smoking men, 60 years old. Respir. Med., 2000; 94: 264-272
[PubMed]  
[22] Erfani N., Mehrabadi S.M., Ghayumi M.A., Haghshenas M.R., Mojtahedi Z., Ghaderi A., Amani D.: Increase of regulatory T cells in metastatic stage and CTLA-4 over expression in lymphocytes of patients with non-small cell lung cancer (NSCLC). Lung Cancer, 2012; 77: 306-311
[PubMed]  [Full Text HTML]  
[23] Fischer J.R., Darjes H., Lahm H., Schindel M., Drings P., Krammer P.H.: Constitutive secretion of bioactive transforming growth factor beta 1 by small cell lung cancer cell lines. Eur. J. Cancer, 1994; 30A: 2125-2129
[PubMed]  
[24] Hoser G., Domagala-Kulawik J., Droszcz P., Droszcz W., Kawiak J.: Lymphocyte subsets differences in smokers and nonsmokers with primary lung cancer: a flow cytometry analysis of bronchoalveolar lavage fluid cells. Med. Sci. Monit., 2003; 9: 310-315
[PubMed]  
[25] Hoser G., Grubek-Jaworska H., Droszcz P., Domagala-Kulawik J., Dabrowska M., Chazan R.: Reactivity of alveolar macrophages in lung cancer patients and healthy subjects: surface ICAM-1 after INF-gamma stimulation in vitro. Folia Histochem. Cytobiol., 2002; 40: 103-104
[PubMed]  
[26] Hoser G., Kawiak J., Domagała-Kulawik J., Kopiński P., Droszcz W.: Flow cytometric evaluation of lymphocyte subpopulations in BALF of healthy smokers and nonsmokers. Folia Histochem. Cytobiol., 1999; 37: 25-30
[PubMed]  
[27] Karanikas V., Speletas M., Zamanakou M., Kalala F., Loules G., Kerenidi T., Barda A.K., Gourgoulianis K.I., Germenis A.E.: Foxp3 expression in human cancer cells. J. Transl. Med., 2008; 6: 19
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[28] Kim C.F.: Paving the road for lung stem cell biology: bronchioalveolar stem cells and other putative distal lung stem cells. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol., 2007; 293: L1092-L1098
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[29] Kontakiotis T., Katsoulis K., Hagizisi O., Kougioulis M., Gerou S., Papakosta D.: Bronchoalveolar lavage fluid alteration in antioxidant and inflammatory status in lung cancer patients. Eur. J. Intern. Med., 2011; 22: 522-526
[PubMed]  [Full Text HTML]  
[30] Krammer P.H., Dhein J., Walczak H., Behrmann I., Mariani S., Matiba B., Fath M., Daniel P.T., Knipping E., Westendorp M.O., Kirstin Stricker1, Bäumler C., Hellbardt S., Germer M., Peter M.E., Debativ K.M.: The role of APO-1-mediated apoptosis in the immune system. Immunol. Rev., 1994; 142: 175-191
[PubMed]  [Abstract]  
[31] Krzakowski M.: Recommendations on systemic treatment of non-small cell lung cancer and malignant pleural mesothelioma. Pneumonol. Alergol. Pol., 2010; 78: 384-385
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[32] Langfort R., Szołkowska M., Szczepulska-Wójcik E., Maksymiuk B.: Small biopsies and cytologic specimens management in microscopic diagnosis and subtyping of non-small cell lung cancer, as recommended by IASLC/ATS/ERS. Pneumonol. Alergol. Pol., 2012; 80: 172-177
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[33] Lin Y., Liu L., Zhang T., Liu J.: Functional investigation of Fas ligand expressions in human non-small cell lung cancer cells and its clinical implications. Ann. Thorac. Surg., 2013; 95: 412-418
[PubMed]  [Full Text HTML]  
[34] Linder J., Radio S.J., Robbins R.A., Ghafouri M., Rennard S.I.: Bronchoalveolar lavage in the cytologic diagnosis of carcinoma of the lung. Acta Cytol., 1987; 31: 796-801
[PubMed]  
[35] Mancini N.M., Béné M.C., Gérard H., Chabot F., Faure G., Polu J.M., Lesur O.: Early effects of short-time cigarette smoking on the human lung: a study of bronchoalveolar lavage fluids. Lung, 1993; 171: 277-291
[PubMed]  
[36] Meyer K.C.: Bronchoalveolar lavage as a diagnostic tool. Semin. Respir. Crit. Care Med., 2007; 28: 546-560
[PubMed]  
[37] Morrison B.J., Morris J.C., Steel J.C.: Lung cancer-initiating cells: a novel target for cancer therapy. Target. Oncol., 2013; 8: 159-172
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[38] Nielsen J., Holm T.L., Claesson M.H.: CD4+CD25+ regulatory T cells: II. Origin, disease models and clinical aspects. APMIS, 2004; 112: 642-650
[PubMed]  [Full Text HTML]  
[39] Olsen G.N., Gangemi J.D.: Bronchoalveolar lavage and the immunology of primary lung cancer. Chest, 1985; 87: 677-683
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[40] Oumeraci T., Schmidt B., Wolf T., Zapatka M., Pich A., Brors B., Eils R., Fleischhacker M., Schlegelberger B., von Neuhoff N.: Bronchoalveolar lavage fluid of lung cancer patients: mapping the uncharted waters using proteomics technology. Lung Cancer, 2011; 72: 136-138
[PubMed]  [Full Text HTML]  
[41] Petersen R.P., Campa M.J., Sperlazza J., Conlon D., Joshi M.B., Harpole D.H. Jr., Patz E.F. Jr.: Tumor infiltrating Foxp3+ regulatory T-cells are associated with recurrence in pathologic stage I NSCLC patients. Cancer, 2006; 107: 2866-2872
[PubMed]  [Full Text HTML]  
[42] Pirozynski M.: Bronchoalveolar lavage in the diagnosis of peripheral, primary lung cancer. Chest, 1992; 102: 372-374
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[43] Poletti V., Poletti G., Murer B., Saragoni L., Chilosi M.: Bronchoalveolar lavage in malignancy. Semin. Respir. Crit. Care Med., 2007; 28: 534-545
[PubMed]  
[44] Rennard S.I.: Bronchoalveolar lavage in the diagnosis of cancer. Lung, 1990; 168 (Suppl. 1): 1035-1040
[PubMed]  
[45] Reynolds H.Y.: Use of bronchoalveolar lavage in humans - past necessity and future imperative. Lung, 2000; 178: 271-293
[PubMed]  
[46] Sakaguchi S., Wing K., Yamaguchi T.: Dynamics of peripheral tolerance and immune regulation mediated by Treg. Eur. J. Immunol., 2009; 39: 2331-2336
[PubMed]  [Full Text HTML]  
[47] Semenzato G., Spatafora M., Feruglio C., Pace E., Dipietro V.: Bronchoalveolar lavage and the immunology of lung cancer. Lung, 1990; 168 (Suppl. 1): 1041-1049
[PubMed]  
[48] Takeuchi M., Nagai S., Nakajima A., Shinya M., Tsukano C., Asada H., Yoshikawa K., Yoshimura M., Izumi T.: Inhibition of lung natural killer cell activity by smoking: the role of alveolar macrophages. Respiration, 2001; 68: 262-267
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[49] Thomas M., von Eiff M., Brandt B., Heinecke A., van de Loo J.: Immunophenotyping of lymphocytes in bronchoalveolar lavage fluid. A new flow cytometric method vs standard immunoperoxidase technique. Chest, 1995; 108: 464-469
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[50] Tollerud D.J., Clark J.W., Brown L.M., Neuland C.Y., Mann D.L., Pankiw-Trost L.K., Blattner W.A., Hoover R.N.: Association of cigarette smoking with decreased numbers of circulating natural killer cells. Am. Rev. Respir. Dis., 1989; 139: 194-198
[PubMed]  
[51] Tyczynski J.E., Bray F., Aareleid T., Dalmas M., Kurtinaitis J., Plesko I., Pompe-Kirn V., Stengrevics A., Parkin D.M.: Lung cancer mortality patterns in selected Central, Eastern and Southern European countries. Int. J. Cancer, 2004; 109: 598-610
[PubMed]  [Full Text HTML]  
[52] Vermaelen K., Pauwels R.: Pulmonary dendritic cells. Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2005; 172: 530-551
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[53] Wallace J.M., Oishi J.S., Barbers R.G., Simmons M.S., Tashkin D.P.: Lymphocytic subpopulation profiles in bronchoalveolar lavage fluid and peripheral blood from tobacco and marijuana smokers. Chest, 1994; 105: 847-852
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[54] Wolf A.M., Wolf D., Steurer M., Gastl G., Gunsilius E., Grubeck-Loebenstein B.: Increase of regulatory T cells in the peripheral blood of cancer patients. Clin. Cancer Res., 2003; 9: 606-612
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[55] Woo E.Y., Chu C.S., Goletz T.J., Schlienger K., Yeh H., Coukos G., Rubin S.C., Kaiser L.R., June C.H.: Regulatory CD4+CD25+ T cells in tumors from patients with early-stage non-small cell lung cancer and late-stage ovarian cancer. Cancer Res., 2001; 61: 4766-4772
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[56] Wrona A., Jassem J.: The new TNM classification in lung cancer. Pneumonol. Alergol. Pol., 2010; 78: 407-417
[PubMed]  [Full Text PDF]  
Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.