Postepy Hig Med Dosw. (online), 2013; 67: 130-142
Review
Full Text PDF  

Bakteryjne topoizomerazy typu I - rola biologiczna i zastosowanie jako potencjalnych celów dla antybiotyków
Bacterial type I topoisomerases - biological function and potential use as targets for antibiotic treatments
Marcin Szafran1  , Jolanta Zakrzewska-Czerwińska1,2  , Dagmara Jakimowicz1,2  
1Uniwersytet Wrocławski, Wydział Biotechnologii
2Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN, im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu
Adres do korespondencji
Marcin Szafran, Uniwersytet Wrocławski, Wydział Biotechnologii, ul. Tamka 2, 50-137 Wrocław; e-mail: marcin.szafran@uni.wroc.pl

Źródło finansowania
Praca finansowana przez Fundację na Rzecz Nauki Polskiej, program POMOST (POMOST/2010-2/5), ze środków PO IG Unii Europejskiej.

Otrzymano:  2012.06.22
Zaakceptowano:  2012.12.19
Opublikowano:  2013.03.04

Streszczenie
W komórce bakteryjnej chromosom występuje w postaci niezależnych topologicznie domen, których przestrzenna organizacja kontrolowana jest przez białka zwane topoizomerazami. Pra­widłowa topologia chromosomu jest jednym z elementów warunkujących zachodzenie podsta­wowych procesów, takich jak replikacja, transkrypcja oraz rekombinacja materiału genetycznego. Dodatkowo, najnowsze badania wskazują na istotną rolę topologii chromosomu w przystosowaniu bakterii do zmieniających się warunków środowiskowych, a w przypadku szczepów patogennych jej związku z wirulencją. W ostatnich latach obserwuje się wzrost doniesień o pojawianiu się pa­togennych gatunków bakterii opornych na stosowane antybiotyki. Z tego względu poszukiwanie nowych leków wydaje się sprawą priorytetową w walce z patogenami. W pracy omówiono aktualny stan wiedzy na temat bakteryjnych topoizomeraz typu IA oraz ich potencjalne zastosowanie jako celów dla nowych związków antybakteryjnych.
Słowa kluczowe: topoizomerazy IA • antybiotyki • topologia chromosomu • regulacja ekspresji genów


Summary
The bacterial chromosome is composed of topologically independent domains, whose spatial organization is controlled by enzymes called topoisomerases. Topology maintenance is crucial in many important cellular processes such as replication, transcription and recombination. Mo­reover, the role of chromosome topology in adaptation of bacteria to environmental changes and, in the case of pathogenic strains, in their virulence was described. In recent years higher numbers of pathogenic strains resistant to antibiotic treatment have been noticed. In this paper we present the current state of knowledge about the structure and cellular functions of bacterial topoisomerases IA. In particular, we discuss the potential use of these enzymes as new targets for antibacterial compounds.
Key words: topoisomerases IA • antibiotics • chromosome topology • regulation of gene expression




Wstęp
Znaczny rozwój technik mikroskopowych i analitycznych w ostatnich latach pozwolił na śledzenie dynamiki chro­mosomów u wielu bakterii w trakcie ich cyklu życiowego. Wykazano, że chromosom bakteryjny nie jest strukturą bezwładnie zawieszoną w cytoplazmie, lecz jego organiza­cja podlega precyzyjnej kontroli na różnych etapach roz­woju komórki. W organizację struktury chromosomu bak­teryjnego zaangażowanych jest wiele białek począwszy od małych, zasadowych białek podobnych do eukariotycz­nych histonów, a kończąc na grupie enzymów, zwanych topoizomerazami, kontrolujących topologię chromosomu. Topologia chromosomu jest niezwykle istotna dla prawi­dłowego funkcjonowania komórki i wpływa na ekspresję wielu genów zależnych od stopnia superskręcenia DNA. Intensywne badania nad bakteryjnymi topoizomerazami, począwszy od lat 70 ub.w., kiedy po raz pierwszy ziden­tyfikowano te enzymy [86], dostarczyły wielu informacji na temat ich roli komórkowej. Ze względu na mnogość opisanych funkcji, pełnionych przez topoizomerazy w ko­mórce bakteryjnej oraz brak podobieństwa względem ich eukariotycznych homologów, enzymy te wydają się dosko­nałym celem w terapiach przeciwbakteryjnych.
Struktura bakteryjnego chromosomu
Typowy chromosom bakteryjny jest pojedynczą, kowalen­cyjnie zamkniętą cząsteczką dwuniciowego DNA. Oprócz bakterii mających pojedynczy chromosom w postaci koli­stej, istnieją również mikroorganizmy, u których chromo­som występuje w postaci liniowej cząsteczki (Streptomy­ces coelicolor [42], Borrelia burgdorferii [26]) lub może być więcej niż jeden chromosom (Vibrio cholerae [82], Agro­bacterium [2]). Chromosom(y) w komórce bakteryjnej wy­stępuje/ją w postaci nukleoidu, czyli DNA związanego z białkami oraz RNA, zanurzonego w cytoplazmie komórki bakteryjnej i nieoddzielonego żadną barierą od jej pozosta­łych składników. Nukleoid zajmuje około 10-15% objętości komórki i stanowi u bakterii odpowiednik jądra komór­kowego. Chromosom bakteryjny, niezależnie od postaci w jakiej występuje, musi przyjąć strukturę umożliwiającą jego upakowanie wewnątrz komórki. DNA modelowego szczepu Escherichia coli K12 MG1655, o długości w przy­ bliżeniu wynoszącej 1600 µm, zbudowany jest z 4,6 Mpz i musi ulec przynajmniej 1000-krotnemu skondensowaniu [54,95], aby móc się zmieścić w komórce bakteryjnej, któ­rej długość wynosi ~2,0-3,0 µm, a szerokość ~0,5-1,0 µm. Jednocześnie, pomimo znacznego upakowania, nukleoid musi być dostępny dla licznych białek zaangażowanych w takie procesy, jak replikacja, transkrypcja, rekombinacja oraz segregacja materiału genetycznego, które obejmując rozległe obszary chromosomu, również wpływają na jego topologię. U bakterii, zwłaszcza tych szybko się dzielących, procesy te zachodzą często jednocześnie, przez co chromo­som staje się cząsteczką niezwykle dynamiczną i podlega­jącą ciągłym, przestrzennym rearanżacjom. Wiele analiz mikroskopowych przeprowadzonych w ostatnich latach wykazało, że chromosom bakteryjny jest strukturą wysoce zorganizowaną. Uważa się, że na organizację DNA w ko­mórce wpływa już sama sekwencja nukleotydowa, promu­jąca tworzenie się określonych struktur przestrzennych, takich jak zgięcia i pętle [52,74]. Dodatkowo upakowanie chromosomu wewnątrz komórki wspomagane jest przez liczne, zasadowe białka, tzw. NAPs (nucleoid associated proteins) oraz RNA [95]. Ekspresja tych makrocząste­czek podlega precyzyjnej kontroli i zmienia się na różnych etapach wzrostu komórki bakteryjnej [6]. Ich rolę opisa­no w wielu pracach przeglądowych dotyczących struktury i dynamiki chromosomu [15,43,48,49]. Wykazano, że dużą rolę w upakowaniu cząsteczki DNA pełni wprowadzanie negatywnych superskrętów w jej obrębie. Negatywnie su­perskręcony DNA w komórce E. coli występuje w postaci kilkuset domen, z których każda ma wielkość około 10 kpz. Poszczególne domeny są topologicznie niezależne od siebie, stąd uszkodzenie nici DNA prowadzi tylko do lokalnej relaksacji chromosomu, nie obejmując swoim dzia­łaniem całej cząsteczki [63,75]. Uzyskane przez Deliusa i Worcela [17] techniką mikroskopii elektronowej zdję­cia chromosomu E. coli sugerowały początkowo model, w którym chromosom byłby spięty przez zasadowe białka strukturalne, tworzące rdzeń i nadające DNA kształt rozety. Obecnie uważa się, że poszczególne domeny są kotwiczo­ne po wewnętrznej stronie błony komórkowej [23,39,72]. Gwałtowna liza ściany komórkowej prowadzi do asocjacji białek kotwiczących DNA, nadając mu charakterystyczny kształt rozety obserwowany in vitro przez Deliusa i Wor­cela [17]. Przypuszcza się, że lokalizacja domen jest dy­namiczna i podlega czasowym zmianom przestrzennym. Jednak rozmieszczenie poszczególnych domen na konkret­nych etapach cyklu komórkowego wydaje się stałe i pre­cyzyjnie kontrolowane przez komórkę bakteryjną [25].
W kontrolowanie superskręcenia DNA zaangażowane są białka zwane topoizomerazami. Enzymy te katalizują re­akcję nacięcia, przemieszczenia nici DNA oraz religacji wiązania fosfodiestrowego. Różny mechanizm działania to­poizomeraz stał się podstawowym kryterium ich podziału na dwa typy - I oraz II, które nacinają odpowiednio jedną lub dwie nici DNA (ryc. 1). Obie grupy topoizomeraz wy­kazują brak podobieństwa zarówno na poziomie sekwen­cji aminokwasowej, jak również struktury przestrzennej, sugerując tym samym ich odmienne pochodzenie ewolu­cyjne. Bakteryjne topoizomerazy typu I są monomerami, natomiast topoizomerazy typu II działają w komórce jako heterotetramery. W obrębie każdej z grup, na podstawie różnic w mechanizmie działania oraz homologii białek względem siebie wyróżnia się dodatkowe podtypy.
Ryc. 1. Mechanizm działania topoizomeraz typu IA. Topoizomeraza IA rozpoznaje i wiąże DNA (A). W efekcie nukleofilowego ataku grupy hydroksylowej reszty tyrozyny w cen­trum katalitycznym topoizomerazy na wiązanie fosfodiestrowe dochodzi do jego hydrolizy (wiązania fosfodiestrowego) z jednoczesnym utworzeniem przejściowego kompleksu kowalencyjnego między grupą hydroksylową tyrozyny, a uwolnioną grupą fosforanową na 5'-końcu przeciętej nici (B). Następnie nietknięta nić jest przeciągana przez utworzone pękniecie (C). Pełen cykl katalityczny kończy się religacją wiązania fosfodiestrowego i uwolnieniem cząsteczki kwasu deoksyrybonuklei- nowego (D). Następstwem działania topoizomeraz typu IA jest usunięcie jednego, negatywnego superskrętu z cząsteczki DNA po każdym cyklu katalitycznym

U wszystkich eukariontów zidentyfikowano zarów­no topoizomerazy podtypu IA, jak również IB [28]. W przypadku bakteryjnych topoizomeraz typu I wy­różnia się aż trzy podtypy, odpowiednio IA, IB oraz IC, przy czym jedynie podtyp IA jest obecny u wszystkich opisanych mikroorganizmów, natomiast podtyp IB i IC tylko u nielicznych gatunków. Podtyp IA obejmuje topo­izomerazy I (TopA), III (TopB) oraz odwrotną gyrazę, natomiast IB niewielkie topoizomerazy, podobne struk­turalnie do enzymów identyfikowanych u pokswirusów. Do grupy IC należy nietypowy enzym, odkryty jak dotąd jedynie u Methanopyrus kandleri - topoizomeraza V [77]. Wszystkie zidentyfikowane bakterie mają przynajmniej jedną topoizomerazę typu I, która razem z gyrazą - en­zymem należącym do typu II, stanowią tzw. minimalny zestaw topoizomeraz (tabela 1).
Tabela 1. Obecność topoizomeraz typu I i II u wybranych gatunków bakterii

Główną rolę, poza organizacją chromosomu, topoizo­merazy pełnią w czasie replikacji i transkrypcji. Pod­czas replikacji, przemieszczające się widełki replikacyjne generują pozytywne superskręty przed widełkami oraz negatywne superskręty za nimi [62,90]. Topoizomera­za I oraz gyraza, usuwając z DNA odpowiednio nega­tywne i pozytywne superskręty, zapewniają efektywne przemieszczanie się kompleksu replikacyjnego wzdłuż chromosomu. Natomiast podczas transkrypcji, topoizo­meraza I umożliwia usuwanie negatywnych superskrę­tów i zapobiega powstawaniu tzw. pętli R, tworzonych przez powstające podczas transkrypcji hybrydy DNA­:RNA [13]. Rola topoizomerazy I podczas transkrypcji jest szczególnie widoczna w warunkach stresu. Dochodzi wtedy do ekspresji dużej puli genów związanych z ada­ptacją bakterii do nowych warunków środowiskowych. Towarzysząca temu intensywna transkrypcja, wymaga zaangażowania dodatkowych cząsteczek białka TopA, którego wytwarzanie jest w takich okolicznościach pod­wyższone [46].
Bakteryjne topoizomerazy typu IA
U wielu gatunków bakterii występują dwie topoizome­razy podtypu IA - topoizomeraza I (TopA) oraz III (TopB). Uważa się, że kluczową dla przeżycia jest to­poizomeraza I, a topoizomeraza III pełni bliżej niewy­jaśnione funkcje w komórce i nie jest obecna u wszyst­kich mikroorganizmów. Topoizomerazy IA, z wyjątkiem odwrotnej gyrazy, to stosunkowo duże, monomeryczne białka o masie około 80-110 kDa. Enzymy te przeci­nają tylko jedną nić DNA. Katalizują one reakcję trans-estryfikacji, tworząc przejściowy kompleks kowalencyj­ny między grupą hydroksylową tyrozyny, a 5'-końcem przeciętej nici DNA. Następnie dochodzi do przesu­nięcia nietkniętej nici przez powstałe pęknięcie. Cykl katalityczny kończy się ligacją pękniętej nici, przy jed­noczesnym usunięciu pojedynczego superskrętu z czą­steczki DNA [16]. Do swojej aktywności topoizomera­zy typu IA wymagają obecności kofaktorów w postaci jonów dwuwartościowych, którymi w warunkach fizjo­logicznych są jony magnezu. Magnez jest niezbędny do religacji wiązania fosfodiestrowego, lecz nie samego oddziaływania topoizomerazy z DNA i tworzenia ko­walencyjnego kompleksu przejściowego [94]. Topoizo­merazy podtypu IA nie wymagają również dostarczenia energii w postaci trifosforanów nukleozydów, wykorzy­stując do katalizowania reakcji przeniesienia i religacji nici DNA energię zakumulowaną w superskręconej czą­steczce DNA (tabela 2).
Tabela 2. Wybrane właściwości bakteryjnych topoizomeraz typu I i II

Topoizomerazy typu IA zbudowane są z dwóch do­men - większej, tworzącej rdzeń białka, obejmującej około 600 początkowych aminokwasów oraz mniejszej, C-końcowej. W obrębie domeny N-końcowej umiej­scowione jest centrum katalityczne z główną resztą tyrozyny oraz region TOPRIM (topoisomerase-pri­mase domain) z miejscem wiązania jonów magnezu [4] (ryc. 2).
Ryc. 2. Schematyczne porównanie budowy topoizomerazy I (TopA) u wybranych gatunków bakterii, zaznaczono umiejscowienie domeny TOPRIM, katalityczną resztę tyrozyny oraz palce cynkowe (opis w tekście)

W porównaniu z domeną N-końcową, funkcja dome­ny C-końcowej jest znacznie słabiej poznana. W przy­padku białek z E. coli oraz Mycobacterium tuberculosis pozbawienie ich domeny C-końcowej hamuje aktyw­ność topoizomerazową samego rdzenia [1,11]. Podob­nie u bakterii Helicobacter pylori usunięcie całej domeny C-końcowej, a także 28-końcowych reszt aminokwaso­wych prowadzi do całkowitego zahamowania aktywności białka [80]. Rdzeń topoizomerazy I z Thermatoga ma­ritima oraz Streptomyces coelicolor pozbawiony domeny C-końcowej, mimo że jego aktywność jest nieznacznie obniżona, nadal zdolny jest do przeprowadzenia pełne­go cyklu katalitycznego [7,80]. Region C-końcowy jest wysoce zmienny, zarówno pod względem długości, jak również sekwencji aminokwasowej. Co ciekawe, wiele topoizomeraz typu IA, z wyjątkiem tych występują­cych u promieniowców, zawiera w domenie C-końco­wej struktury zaangażowane w oddziaływanie z DNA - palce cynkowe. Liczba powtórzeń palców cynkowych jest zmienna u różnych gatunków bakterii i waha się od jednego (Thermatoga maritima) do czterech (H. pylori) (ryc. 2). U promieniowców, u których topoizomerazy IA pozbawione są palców cynkowych, niewyjaśniony jest nadal mechanizm wiązania się tych białek z DNA. Natomiast u pozostałych mikroorganizmów struktury te są na tyle istotne, że ich usunięcie prowadzi do za­hamowania aktywności enzymu i w wielu przypadkach jest dla komórek letalne.
Mimo że aktywność topoizomeraz jest istotna dla pra­widłowego przebiegu podstawowych procesów komór­kowych, takich jak replikacja i transkrypcja, możliwość ich usunięcia pozostaje kwestią dyskusyjną. Początkowo uważano, że u E. coli usunięciu genu topA towarzyszyć musi delecja co najmniej jednego z genów kodujących podjednostki bakteryjnej gyrazy [19,64]. Wyniki te do­datkowo potwierdzały prace prowadzone przez Ham­monda i Overbye'a [32]. Wykorzystując niskie stężenia nowobiocyny (inhibitor bakteryjnej gyrazy), wyselekcjo­nowane zostały szczepy E. coli niosące mutacje w obrębie genu topA, które powodują zahamowanie aktywności en­zymatycznej topoizomerazy. Jednak możliwość usunięcia genu topA z chromosomu niektórych mikroorganizmów, w tym również E. coli, Salmonella Typhimurium oraz Shigella flexneri pozostaje nadal kwestią sporną. Stosu­jąc technikę insercji transpozonów udało się wyodrębnić szczepy z uszkodzonym genem topA. Wyniki te mogą sugerować, że funkcja topoizomerazy I, nie jest u tych bakterii aż tak istotna dla ich przeżycia, jak pierwotnie sądzono [19,55,78]. Natomiast w przypadku wielu in­nych bakterii patogennych, w tym M. tuberculosis oraz H. pylori, białko TopA jest niezbędne do przetrwania, a pró­by jego usunięcia kończyły się niepowodzeniem [69,80]. Co ciekawe, szczep J99 H. pylori ma dwa geny kodujące dodatkowe warianty białka TopA - TopA2 oraz TopA3. Przewidywane produkty tych genów to białka o mniej­szej masie cząsteczkowej, pozbawione palców cynko­wych oraz wykazujące niską homologię, odpowiednio 34 i 37% identyczności względem białka TopA. Natomiast brak jest doniesień, czy geny topA2 oraz topA3 ulegają w komórce ekspresji. Niewiele również wiadomo na te­mat roli samego białka TopA u Helicobacter. Jak dotąd nie wyjaśniono także, dlaczego bakterie te mają kilka paralogów TopA. Możliwe, że intensywnie zachodzące w komórkach Helicobacter procesy rekombinacji mate­riału genetycznego, wymagają obecności dodatkowych topoizomeraz.
Zdecydowanie słabiej poznana jest bakteryjna topoizome­raza III (TopB). Uważa się, że topoizomeraza III, należą­ca, podobnie jak topoizomeraza I, do typu IA i kodowana u bakterii przez gen topB, odgrywa rolę w procesie deka­tenacji powstałych po replikacji cząsteczek DNA [58]. In vitro topoizomeraza III zdolna jest również do zmiany przestrzennej struktury RNA [85]. U E. coli delecja genu topB nie wpływa znacząco na przeżywalność komórek, ale prowadzi do zwiększenia częstości spontanicznych delecji w chromosomie. Sugeruje to rolę topoizomerazy III w pro­cesach rekombinacji i naprawy materiału genetycznego [71,87]. Całkowicie odrębną grupę stanowią odwrotne gyrazy również należące do podtypu IA topoizomeraz. Enzymy te zidentyfikowane zostały jedynie u archeonów. U termofilnych Archaea odwrotna gyraza odpowiedzialna jest za wprowadzanie dodatnich superskrętów, co jest jed­ną ze strategii, pozwalających na ochronę własnego mate­riału genetycznego przed szkodliwym wpływem wysokiej temperatury [60].
Bakteryjne topoizomerazy IB jako efekt horyzontalnego transferu genów
Geny kodujące topoizomerazy typu IB występują u wszystkich eukariontów, pokswirusów [8] i mimiwi­rusów [66], lecz nie u Archeae. Natomiast w przypadku bakterii zidentyfikowane zostały jedynie u nielicznych gatunków (tab. 2). W porównaniu z pozostałymi przed­stawicielami topoizomeraz typu I, wirusowe i bakteryj­ne topoizomerazy IB są najmniejszymi enzymami tego typu. Są to białka o masie około 33 kDa, zbudowane z 330-350 reszt aminokwasowych. Topoizomerazy typu IB katalizują proces relaksacji DNA według mechani­zmu polegającego na nacięciu pojedynczej nici DNA i utworzeniu przejściowego kompleksu, kowalencyjnie związanego z uwolnionym 3'-końcem [44]. Następnie dochodzi do kontrolowanej rotacji uwolnionego końca DNA, usuwania kolejnych superskrętów i religacji wią­zania fosfodiestrowego. Dzięki takiemu mechanizmowi enzymy te zdolne są do relaksacji zarówno negatywnie, jak i pozytywnie superskręconego DNA. Bakteryjne topoizomerazy IB cechuje podobieństwo do topoizo­meraz wirusowych i eukariotycznych przejawiające się w zbliżonym rozmiarze, sekwencji aminokwasowej oraz podobnej strukturze centrum katalitycznego, zachowu­jącego układ 5 konserwatywnych reszt aminokwasowych - RKKRH [91]. Wirusowe topoizomerazy IB wykazują swoistość względem wiązanej sekwencji (5'-CCCTT) [36,37,51]. Natomiast nie wykazano żadnej swoistości w przypadku scharakteryzowanych do tej pory bakte­ryjnych topoizomeraz IB z Deinococcus radiodurans [44] oraz Pseudomonas aeruginosa [38]. Nie do końca znane jest pochodzenie bakteryjnych topoizomeraz IB. Ho­mologia między tymi enzymami pochodzącymi z róż­nych gatunków oraz ich odmienny od topoizomeraz IA mechanizm działania sugerują, że topoizomerazy IB tworzą niezależną rodzinę białek, ewolucyjnie wywodzą­cych się od innego przodka niż topoizomerazy IA [44]. Ze względu na duże podobieństwo topoizomeraz IB u organizmów niespokrewnionych ze sobą sugeruje się udział transferu horyzontalnego w procesie propagacji genu między poszczególnymi domenami życia, a nie jak wcześniej sugerowano, eliminacji genu w toku ewolucji [10,44]. Warto również zauważyć, że jeśli w genomie bakterii obecny jest gen kodujący topoizomerazę typu IB, to brak jest wtedy często genu topB kodującego to­poizomerazę III (należącą do typu IA). Niektóre gatunki bakterii nie mają jednak ani topoizomerazy IB, ani to­poizomerazy III (H. pylori, M. tuberculosis).
Z powodu niepełnej wiedzy dotyczącej topoizomeraz IB u bakterii, a także braku doniesień na temat ich komórko­wej funkcji, obecnie białka te nie wydają się dobrym celem dla nowych antybiotyków. Dodatkowo, ich obecność tylko u wybranych gatunków bakterii sprawia, że topoizomerazy IB wydają się lepszym celem terapii przeciwwirusowych, niż przeciwbakteryjnych.
Topoizomeraza V z Methanopyrus kandleri - wyjątkowy enzym z wyjątkowego mikroorganizmu
Jedynym, zidentyfikowanym przedstawicielem topoizo­meraz typu IC jest topoizomeraza V (TopoV) z Metha­nopyrus kandleri [77]. Mikroorganizm ten bytuje w eks­tremalnie wysokiej temperaturze, sięgającej aż 110°C oraz w środowisku o wysokim zasoleniu [35]. Począt­kowo topoizomeraza V klasyfikowana była jako enzym należący do podtypu IB, ze względu na tworzenie cha­rakterystycznego dla tej grupy kompleksu przejściowego z 3'-końcem DNA oraz zdolność do relaksacji zarówno pozytywnie, jak również negatywnie superskręconego DNA w sposób niezależny od obecności jonów dwu­wartościowych oraz ATP [81]. Poznanie sekwencji nu­kleotydowej genomu M. kandleri [76] ujawniło, że rdzeń białka, odpowiedzialny za aktywność topoizomerazową, nie wykazuje homologii z żadnymi znanymi bakteryjny­mi topoizomerazami, co zdecydowało o wyodrębnieniu nowej klasy tych enzymów. Nowo odkryte białko wy­kazywało natomiast podobieństwo do eukariotycznych topoizomeraz IB. Przeciwciała skierowane przeciwko ludzkiej topoizomerazie I rozpoznawały enzym z M. kandleri. Nie wykazano jednak charakterystycznego dla eukariotycznych topoizomeraz IB hamowania ich ak­tywności przez kamptotecynę [77].
Podobnie jak w przypadku pozostałych topoizomeraz, topoizomeraza V zbudowana jest z dwóch domen - od­powiednio domeny N- i C-końcowej, jednak struktura trzeciorzędowa jest inna w porównaniu z topoizomera­zami IA oraz IB. Domena C-końcowa o masie około 68 kDa nie jest niezbędna do pełnej aktywności topoizome­razowej, lecz jej usunięcie znacząco zwiększa wrażliwość enzymu na wysokie stężenie soli. W przeciwieństwie do innych, znanych topoizomeraz, TopoV wykazuje zdol­ność naprawy DNA, za którą odpowiedzialna jest właśnie domena C-końcowa [9]. Domena N-końcowa, o masie około 44 kDa, tworząca rdzeń białka, zawiera katalitycz­ną resztę tyrozyny w pozycji 226 i odpowiedzialna jest za wiązanie i relaksację DNA. Jednak rozmieszczenie głównych dla procesu katalizy aminokwasów jest od­mienne w porównaniu z pozostałymi topoizomeraza­mi typu I. Domena C-końcowa tworzona jest natomiast przez powtórzenia motywu HhH (helix-hinge-helix), otaczające rdzeń białka [59]. Co ciekawe, topoizomera­za V relaksuje DNA według mechanizmu kontrolowa­nej rotacji, typowego dla topoizomeraz typu IB. Jednak w przeciwieństwie do nich nie ma w swojej strukturze charakterystycznego zagłębienia, odpowiedzialnego za wiązanie i przemieszczanie nici DNA. Sam proces wią­zania się topoizomerazy IC do DNA wymaga zmian strukturalnych w obrębie białka. Obserwacje wskazujące, że białko wykazuje małą aktywność poniżej temperatury 65°C sugerują, że do zmian strukturalnych dochodzi pod wpływem podwyższonej temperatury, która jest natural­nym środowiskiem bytowania bakterii M. kandleri. Wy­daje się zatem, że wyodrębnienie w toku ewolucji nowej grupy topoizomeraz typu IA jest efektem przystosowa­nia maszynerii kontrolującej topologię chromosomu do skrajnych warunków środowiskowych, w których bytuje M. kandleri. Jednak zidentyfikowanie tak nietypowej to­poizomerazy jedynie u M. kandleri może sugerować wiru­sowe pochodzenie tego enzymu. Wirusowy gen, kodujący topoizomerazę V, w wyniku transferu horyzontalnego mógł zostać wbudowany w genom mikroorganizmu da­jącego początek linii ewolucyjnej, z której wywodzi się M. kandleri. Charakterystyka kolejnych termofilnych organi­zmów może potencjalnie poszerzyć listę przedstawicieli topoizomeraz typu IC oraz dać jednoznaczną odpowiedź, dotyczącą pochodzenia tej grupy enzymów.
W przeciwieństwie do topoizomeraz należących do pod­typu IB oraz IC, topoizomerazy IA są szeroko rozpo­wszechnione i występują u wszystkich znanych gatun­ków bakterii. Dodatkowo, rola biologiczna topoizomeraz IA jest zdecydowanie lepiej poznana w porównaniu z pozostałymi przedstawicielami typu I. Z tego wzglę­du wydają się lepszym celem terapii przeciwbakteryj­nych i pod tym kątem będą omówione w dalszej części artykułu.
Rola topologii chromosomu w ekspresji genów
Replikacja i transkrypcja są podstawowymi procesami wa­runkującymi prawidłowe funkcjonowanie każdej żywej ko­mórki. Jednocześnie zachodzenie obu procesów jest zależne od przestrzennej organizacji chromosomu. Prawidłowa to­pologia chromosomu, czyli tzw. homeostaza topologiczna, jest efektem antagonistycznego działanie dwóch topoizo­meraz - topoizomerazy I oraz gyrazy (ryc. 3). Aktywność obu białek zmienia się w czasie cyklu komórkowego i/lub w odpowiedzi na sygnały docierające do komórki ze środo­wiska (szok termiczny, wyczerpanie substancji odżywczych i inne), prowadząc do zmian w ekspresji całych grup ge­nów. Dodatkowo stwierdzono, że u E. coli na homeostazę przestrzennej aranżacji chromosomu wpływa wiele białek strukturalnych (NAPs), w tym przede wszystkim białko Fis (factor for inversion stimulation).
Ryc. 3. Model homeostazy topologicznej u bakterii E. coli. Antagonistyczne działanie topoizomerazy I (TopA) oraz gyrazy (GyrAB) prowadzi do kontroli dynamiki topologii chromosomu i swobodnego przechodzenia poszczególnych domen między stanami o niskiej i wysokiej gęstości superhelikalnej. Topologia poszczególnych domen chromosomu jest jednym z mechanizmów kontroli ekspresji genów bakteryjnych. Jednym z genów zależnych od topologii jest gen fis, kodujący strukturalne białko Fis. Białko Fis w wysokim stężeniu hamuje ekspresję genów gyrAB. Natomiast wpływ na ekspresję genu topA jest dwojaki. Przy wysokim stężeniu białko Fis hamuje ekspresję genu topoizomerazy, przy niskim jest jego aktywatorem. Dodatkowo, na topologię chromosomu wpływa stan energetyczny komórki. Ze względu na to, że gyraza do swojej aktywności wymaga dostarczenia energii w postaci ATP, wszelkie zmiany stosunku ATP/ADP w komórce wpływają na strukturę chromosomu. Spadek poziomu ATP obserwowany jest w sytuacjach stresu środowiskowego; w efekcie aktywność gyrazy jest zahamowana, a topologia chromosomu zmieniona. Prowadzi to do ekspresji wielu genów zależnych od topologii DNA i związanych z adaptacją bakterii do nowych warunków bytowania

Poprzez lokalne działanie białko Fis prowadzi do powsta­wania mikrodomen, których topologia jest niezależna od globalnej topologii chromosomu [65]. W ten sposób białko Fis moduluje precyzyjnie aktywność transkrypcyjną okre­ślonych grup genów umiejscowionych w obrębie tworzonej mikrodomeny. U E. coli aktywność genów fis, gyrAB oraz topA jest wzajemnie powiązana i regulowana stopniem su­perskręcenia chromosomu (ryc. 3) [40,70,89]. Oprócz ge­nów kodujących wspomniane wyżej białka, zidentyfikowa­no ponad 300 innych genów (czyli 7% wszystkich genów E. coli), których ekspresja jest zależna od stopnia super­skręcenia chromosomu. Wśród nich znajdują się geny, któ­rych produkty zaangażowane są w procesy replikacji (dnaA, dnaN), kondensacji chromosomów (mukBEF), tworzenie przegród poprzecznych (minCD), a także rekombinację materiału genetycznego (xerC). Ekspresja tych genów jest zahamowana, gdy chromosom znajduje się w stanie zre­laksowanym (relaxation-repressed genes) [61]. Topologia chromosomu jest zatem niezwykle ważna dla prawidłowe­go funkcjonowania komórki i odgrywa istotną rolę w regu­lacji ekspresji wielu genów w sposób niezależny od białek regulatorowych. Cozzarelli i wsp. [61] zaproponowali hi­potezę, według której odpowiednia topologia chromoso­mów u E. coli jest punktem kontrolnym poprzedzającym ich segregację. Po osiągnięciu odpowiedniego stanu topo­logicznego dochodzi do ekspresji wielu genów związanych z dystrybucją DNA do komórek potomnych. W tym ujęciu zmiana topologii chromosomu może być rozpatrywana jako nadrzędny mechanizm regulujący ekspresję genów zależnie od etapu cyklu komórkowego.
W ostatnich latach pojawiło się wiele doniesień dotyczą­cych roli przestrzennej organizacji chromosomu w regulacji ekspresji genów u bakterii. A zatem, białka zaangażowane w modyfikowanie topologii czy organizację chromosomu, w tym przede wszystkim topoizomerazy, mogą pośrednio pełnić funkcję regulatorów transkrypcji. Geny zależne od topologii kodują często białka związane z podstawowy­mi procesami komórkowymi (replikacja, transkrypcja, se­gregacja chromosomów) oraz z adaptacją do warunków środowiskowych, a u gatunków patogennych z wirulencją.
Topologia chromosomu a wirulencja
Zaobserwowano, że zmiany w topologii chromosomu na­stępują w odpowiedzi na wiele czynników środowisko­wych, takich jak stres osmotyczny i temperaturowy, odpo­wiedź na zmianę warunków tlenowych oraz ograniczenie substancji odżywczych [68]. Do zmian takich dochodzi m.in. podczas inwazji chorobotwórczych mikroorgani­zmów na organizm gospodarza. Wykazano, że sam proces inwazji oraz późniejszej adaptacji do nowych warunków bytowania związany jest z ekspresją wielu genów kodują­cych tzw. czynniki wirulencji. Co ciekawe, u wielu pato­gennych bakterii aktywność tych genów skorelowana jest ze stopniem superskręcenia chromosomu [21,29,67,92]. U uropatogennych szczepów E. coli zaobserwowano, że ekspresja genów kodujących białka budujące fimbrie (struktury komórkowe umożliwiające adhezję do komó­rek gospodarza) jest zależna od aktywności topoizomeraz oraz białka Lrp modulującego topologię chromosomu [41]. Podobnie bakterie Salmonella Typhimurium wykorzystu­ją fimbrie w celu adhezji do komórek gospodarza, jednak w przeciwieństwie do chorobotwórczych E. coli, są w stanie również przenikać do wnętrza komórek nabłonka i dalej do makrofagów [14,50]. Zależnie od bytowania bakterii S. Typhimurium, w komórkach nabłonkowych lub makrofa­gach dochodzi do aktywacji różnych grup genów wirulen­cji, umiejscowionych odpowiednio w regionach SPI1 oraz SPI2 - tzw. „wyspy patogenności". Ekspresja genów z re­gionu SPI1 jest aktywowana, gdy gęstość superhelikalna chromosomu wzrasta (komórki epitelialne), podczas gdy geny SPI2 ulegają ekspresji w odpowiedzi na zmniejszenie gęstości superhelikalnej DNA (makrofagi) [30]. Innym przykładem chorobotwórczych bakterii, u których zaob­serwowano, że topologia jest ściśle powiązania z cyklem komórkowym jest H. pylori. Wykazano, że odpowiedni stan superskręcenia DNA u tych bakterii jest niezbędny do ini­cjacji replikacji [20]. Takiej zależności nie zaobserwowano natomiast w przypadku E. coli. Uważa się, że u bakterii H. pylori topologia chromosomu może być również głównym czynnikiem regulującym aktywność poszczególnych genów zależnie od fazy wzrostu bakterii. Zwłaszcza, że u Helico­bacter liczba zidentyfikowanych białek regulatorowych jest zdecydowanie niższa w porównaniu z innymi bakteriami [3]. Relaksacja chromosomu, spowodowana działaniem nowobiocyny inhibitora gyrazy, wpływała u H. pylori na ekspresję puli genów związanych z odpowiedzią na stres środowiskowy (hspA, hspB, dnaK) oraz genów umiejsco­wionych w regionie cag (pathogenicity island) i związanych z wirulencją [92]. Zauważono, że niektóre geny opisane jako niezbędne do bytowania H. pylori w żołądku, znajdu­ją się w bliskim sąsiedztwie genów związanych z regulacją topologii chromosomu. Jednym z czynników, związanych z adaptacją bakterii H. pylori do bytowania w organizmie gospodarza, jest wytwarzanie rzęsek [45,79] zbudowa­nych z białek zwanych flagelinami - produktów genów flaA oraz flaB. Nie zidentyfikowano jednak żadnego nad­rzędnego regulatora, który łączyłby (podobnie do genów flhBC u Enterobacteriaceae) ekspresję obu genów flagelin z cyklem komórkowym [56]. Region promotorowy genu flaB pokrywa się z regionem promotorowym genu topA, przy czym ekspresja obu genów przebiega w przeciwnych kierunkach. U H. pylori aranżacja genów na chromosomie jest wysoce zmienna, jednak wykazano, że u 15 badanych, chorobotwórczych szczepów lokalizacja obu genów jest zachowawcza, a odległość między miejscami startu trans­krypcji jest mniej więcej stała [80]. Co ciekawe, promotor genu kodującego drugi wariant flageliny (flaA) charakte­ryzuje się nietypową budową; odległość między -10 oraz -35 jest skrócona w porównaniu z typowymi promotorami bakteryjnymi i wynosi 13 pz. Sugeruje się, że ze względu na odmienną sekwencję promotora, istotną rolę w jego aktywności może odgrywać topologia chromosomu [88]. Dodatkowo wykazano, że gen flhR, kodujący białko regula­torowe związane z ekspresją flagelin, znajduje się w jednym operonie z genem kodującym podjednostkę A gyrazy [57].
Liczne, uzyskane dane, sugerują zależność ekspresji genów kodujących czynniki wirulencji od topologii chromosomu oraz udział samych topoizomeraz w procesie adaptacji chorobotwórczych mikroorganizmów do warunków pa­nujących w ludzkim organizmie.
Bakteryjna topoizomeraza I jako cel dla antybiotyków
Do tej pory uwaga badaczy poszukujących celów dla sub­stancji przeciwbakteryjnych zwrócona była głównie w kie­runku topoizomeraz typu II. Dla tych białek zidentyfiko­wano wiele swoistych związków, takich jak fluorochinolony (ciprofloksacyna, kwas nalidiksowy) oraz nowobiocyna. Bakteriobójczy charakter fluorochinolonów nie przejawia się jednak w hamowaniu aktywności enzymatycznej same­go białka, natomiast prowadzi do stabilizacji kowalencyj­nego kompleksu przejściowego topoizomeraza:DNA [47]. Związki te, określane mianem „topoisomerase poisons", prowadzą w efekcie to zahamowania procesów replikacji chromosomów oraz ich segregacji do potomnych komó­rek. Poszukiwanie związków, które w sposób selektywny wiązałyby się z białkiem TopA (na podobnej zasadzie jak fluorochinolony), hamując jej aktywność na etapie religa­cji wiązania fosfodiestrowego i prowadząc do akumulacji szkodliwych dla komórki intermediatów reakcji, wydaje się jedną z bardziej obiecujących strategii. Nowe nadzie­je w poszukiwaniu tego typu inhibitorów topoizomerazy I budzi technika opracowana przez Tsai i wsp. [83]. Wy­korzystując powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR - surface plasmon resonanse) i immobilizowane białko TopA z M. tuberculosis zidentyfikowali przeciwciała, które w sposób selektywny hamowały aktywność enzymatyczną białka. Wydaje się, że technika ta może być również z po­wodzeniem stosowana do wstępnego poszukiwania mniej­szych cząsteczek o charakterze inhibitorów i w przyszłości stanowiących nową klasę antybiotyków.
Rolę topoizomerazy I w prawidłowym funkcjonowaniu komórki należy rozpatrywać na kilku płaszczyznach. Po­tencjalne antybiotyki celujące w topoizomerazę I dzia­łałyby również na kilku poziomach. Działając globalnie, zmieniałyby topologię chromosomu i zaburzały profil ekspresji jednocześnie wielu genów. Hamowałyby rów­nież namnażanie się patogennych mikroorganizmów (blokując proces replikacji DNA) oraz uniemożliwia­łyby adaptację do warunków panujących w organizmie gospodarza w czasie infekcji (zmieniając ekspresję czyn­ników zjadliwości). Funkcja topoizomerazy I w proce­sach replikacji i transkrypcji polega przede wszystkim na usuwaniu negatywnych superskrętów powstających w efekcie przemieszczania się wzdłuż nici DNA odpo­wiednio kompleksu replikacyjnego i transkrypcyjnego. Przemieszczanie polimerazy DNA w trakcie replikacji wymaga rozplecenia cząsteczki DNA na dużym obsza­rze, co powoduje powstawanie przeszkód topologicznych w postaci superskrętów. U Mycobacterium zidentyfiko­wano zależność między topoizomerazą I a replikacyj­nym białkiem SSB (single strand binding protein). Biał­ko SSB stymuluje aktywność topoizomerazową białka TopA. W ten sposób w regionie tworzenia się komplek­sów replikacyjnych (tzw. primosomów), aktywność białka TopA jest podwyższona [73]. Natomiast u E. coli białko TopA jest wprowadzane do kompleksu transkrypcyjne­go przez oddziaływanie z beta-podjednostką polimerazy RNA (RpoB) [22]. Dodatkowo wpływ topoizomera­zy I na replikację i transkrypcję jest efektem regulacji ekspresji genów kodujących białka istotne dla obu tych procesów. W ten sposób udział topoizomeraz w wyżej wymienionych procesach jest efektem ich działania na dwóch poziomach organizacji.
Adaptacja patogennych szczepów do warunków panu­jących w komórkach gospodarza jest rezultatem odpo­wiedzi na zmieniające się warunki środowiskowe, któ­re pociągają za sobą zmiany w topologii chromosomu. W efekcie dochodzi do aktywacji genów wirulencji, któ­re warunkują przeżywalność chorobotwórczych bakterii (zob. poprzedni rozdział). W procesie adaptacji aktyw­ność topoizomerazowa jest dodatkowo modulowana na skutek oddziaływań z innymi białkami. U M. tuberculosis zidentyfikowano oddziaływanie topoizomerazy I z biał­kiem Rv1495 - homologiem białka MazF, będącego składnikiem systemu typu toksyna-antytoksyna MazEF, który warunkuje przeżywalność prątków w makrofagach [18,24]. Oddziaływanie między białkiem Rv1495 a to­poizomerazą I skutkuje obniżeniem aktywności zarówno topoizomerazowej białka TopA, jak również nukleazowej białka Rv1495 [34]. Badania pozwoliły na wyodrębnie­nie fragmentu białka Rv1495, składającego się z 28 reszt aminokwasowych, zdolnego do oddziaływania z topoizo­merazą i blokującego jej aktywność. Eksperyment z za­stosowaniem topoizomerazy I z E. coli wykazał, że uzy­skany peptyd w sposób swoisty hamował aktywność tylko białka TopA z Mycobacterium [34]. Stwarza to możliwość wykorzystania wspomnianego peptydu jako selektywnie działającego leku hamującego aktywność topoizomera­zową. Jednak dostarczenie tak dużej cząsteczki do ko­mórek Mycobacterium w miejscu infekcji (przez błonę makrofagów oraz grubą ścianę komórkową prątków), jest potencjalnie czynnikiem ograniczającym jego zastoso­wanie. Alternatywą pozostaje poszukiwanie cząsteczek blokujących samo oddziaływanie między Rv1495 a TopA, które zaburzałyby proces adaptacji prątków do warunków panujących w makrofagach, tym samym uniemożliwiając ich bytowanie wewnątrz komórek gospodarza.
Badania oddziaływania białka TopA z innymi składni­kami komórkowymi sugerują także, że związki o cha­rakterze lipidowym mogłyby pełnić rolę potencjalnych antybiotyków hamujących jego aktywność. Wyniki uzy­skane przez Sekimizu i wsp. [53] sugerują wiązanie się topoizomerazy I u E. coli z wewnętrzną błoną komórko­wą i udział składników budujących błonę, jako czynni­ka mogącego regulować aktywność enzymatyczną białka TopA. Obserwowano, że ponad 30% komórkowej puli topoizomerazy I było oczyszczane jako frakcja związana z błonami komórkowymi. Wykazano również, że kardioli­pina efektywnie hamowała aktywność topoizomerazy I in vitro, podczas gdy takiego efektu nie powodował fosfa­tydyloglicerol, jeden z głównych składników bakteryjnej błony komórkowej. Wzajemną zależność między białkiem TopA oraz kardiolipiną uzupełniają badania Cozzarellego i wsp. [61]. Wykazali oni zależność ekspresji genu cls, ko­dującego syntezę kardiolipiny, od topologii chromosomu. Transport antybiotyków o charakterze hydrofobowym przez ścianę komórkową, które na podobnej zasadzie jak kardiolipina, byłyby w stanie hamować aktywność topo­izomerazy I, byłby znacznie ułatwiony. Brak jest jednak doniesień na temat badań prowadzonych nad tego typu antybiotykami.
Dużo większe nadzieje wiąże się natomiast z odkrytymi niedawno pochodnymi benzimidazoli. Wykazano wiele terapeutycznych właściwości tych związków, w tym rów­nież potencjalne ich zastosowanie jako czynników bak­teriobójczych [12]. Praca Armanda i wsp. [5] wskazuje, że związki oparte na bazie benzimidazolu koordynacyj­nie wiążące miedź, są efektywnymi inhibitorami topoizo­merazy I u E. coli i mogą mieć potencjalne zastosowanie w przyszłych terapiach skierowanych przeciwko patogen­nym bakteriom Gram-ujemnym [5]. Jednakże molekularne podstawy działania tych związków na topoizomerazy nie są jeszcze poznane.
Podsumowanie
Strukturalnie odległe od swoich eukariotycznych odpo­wiedników, bakteryjne topoizomerazy I wydają się do­skonałym celem nowego typu swoistych terapii antybak­teryjnych. Co ciekawe, wiele ludzkich patogenów ma tylko jeden enzym typu I (tabela 1), stąd wykazuje zwiększoną wrażliwość na wszelkie czynniki wpływające na jego ak­tywność. Gram-dodatnie, patogenne bakterie z rodzaju Mycobacterium - M. tuberculosis oraz M. leprae, będące czyn­nikami etiologicznymi odpowiednio gruźlicy oraz trądu, zawierają minimalny zestaw topoizomeraz - topoizomerazę I oraz gyrazę. U wielu bakterii Gram-dodatnich głównym celem dla fluorochinolonów jest topoizomeraza IV, w dru­giej kolejności dopiero bakteryjna gyraza [27,31]. Brak topoizomerazy IV u Mycobacterium sprawia, że pochod­ne fluorochinolonów nie są efektywnymi antybiotykami w walce z tymi patogenami, stąd poszukuje się nowych celów uchwytu dla leków. Ze względu na występowanie tylko jednej topoizomerazy typu I, której usunięcie jest dla Mycobacterium letalne, enzym ten wydaje się doskonałym celem dla nowych terapii przeciwko prątkom.
W kontekście rozprzestrzeniania się szczepów leko­opornych, poszukiwanie nowych antybiotyków wydaje się sprawą priorytetową. Coraz większa liczba doniesień dotyczących mechanizmów kontroli aktywności bakte­ryjnych topoizomeraz oraz rozwój technik pozwalających na identyfikowanie związków hamujących ich aktywność w niedalekiej przyszłości pozwoli na wyodrębnienie nowej klasy antybiotyków i ułatwi walkę z patogennymi mikro­organizmami. Techniki oparte o przesiewowe przeszuki­wanie bibliotek związków chemicznych lub modelowanie in silico są dodatkowo wspierane wynikami krystalogra­ficznymi. Rozwiązanie struktury przestrzennej topoizo­merazy I z E. coli [93] oraz topoizomerazy I z Thermatoga maritima [33] dostarczyło cennych informacji na temat mechanizmu wiązania oraz relaksacji DNA i stanowi do­skonały punkt wyjścia do dalszych poszukiwań.
PIŚMIENNICTWO
[1] Ahumada A., Tse-Dinh Y.C.: The role of the Zn(II) binding domain in the mechanism of E. coli DNA topoisomerase I. BMC Biochem., 2002; 3: 13
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[2] Allardet-Servent A., Michaux-Charachon S., Jumas-Bilak E., Karayan L., Ramuz M.: Presence of one linear and one circular chromosome in the Agrobacterium tumefaciens C58 genome. J. Bacteriol., 1993; 175: 7869-7874
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[3] Alm R.A., Trust T.J.: Analysis of the genetic diversity of Helicobacter pylori: the tale of two genomes. J. Mol. Med., 1999; 77: 834-846
[PubMed]  
[4] Aravind L., Leipe D.D., Koonin E.V.: Toprim - a conserved catalytic domain in type IA and II topoisomerases, DnaG-type primases, OLD family nucleases and RecR proteins. Nucleic Acids Res., 1998; 26: 4205-4213
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[5] Arjmand F., Parveen S., Afzal M., Shahid M.: Synthesis, characterization, biological studies (DNA binding, cleavage, antibacterial and topoisomerase I) and molecular docking of copper(II) benzimidazole complexes. J. Photochem. Photobiol. B, 2012; 114: 15-26
[PubMed]  
[6] Azam T.A., Ishihama A.: Twelve species of the nucleoid-associated protein from Escherichia coli. Sequence recognition specificity and DNA binding affinity. J. Biol. Chem., 1999; 274: 33105-33113
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[7] Bao K., Cohen S.N.: Reverse transcriptase activity innate to DNA polymerase I and DNA topoisomerase I proteins of Streptomyces telomere complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004; 101: 14361-14366
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[8] Bauer W.R., Ressner E.C., Kates J., Patzke J.V.: A DNA nicking-closing enzyme encapsidated in vaccinia virus: partial purification and properties. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977; 74: 1841-1845
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[9] Belova G.I., Prasad R., Kozyavkin S.A., Lake J.A., Wilson S.H., Slesarev A.I.: A type IB topoisomerase with DNA repair activities. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001; 98: 6015-6020
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[10] Benarroch D., Claverie J.M., Raoult D., Shuman S.: Characterization of mimivirus DNA topoisomerase IB suggests horizontal gene transfer between eukaryal viruses and bacteria. J. Virol., 2006; 80: 314-321
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[11] Bhaduri T., Nagaraja V.: DNA topoisomerase I from Mycobacterium smegmatis. Indian J. Biochem. Biophys., 1994; 31: 339-343
[PubMed]  
[12] Bürli R.W., McMinn D., Kaizerman J.A., Hu W., Ge Y., Pack Q., Jiang V., Gross M., Garcia M., Tanaka R., Moser H.E.: DNA binding ligands targeting drug-resistant Gram-positive bacteria. Part 1: Internal benzimidazole derivatives. Bioorg. Med. Chem. Lett., 2004; 14: 1253-1257
[PubMed]  
[13] Cheng B., Rui S., Ji C., Gong V.W., Van Dyk T.K., Drolet M., Tse-Dinh Y.C.: RNase H overproduction allows the expression of stress-induced genes in the absence of topoisomerase I. FEMS Microbiol. Lett., 2003; 221: 237-242
[PubMed]  
[14] Cróinin O.T., Carroll R.K., Kelly A., Dorman C.J.: Roles for DNA supercoiling and the Fis protein in modulating expression of virulence genes during intracellular growth of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Mol. Microbiol., 2006; 62: 869-882
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[15] Dame R.T.: The role of nucleoid-associated proteins in the organization and compaction of bacterial chromatin. Mol. Microbiol., 2005; 56: 858-870
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[16] Dekker N.H., Rybenkov V.V., Duguet M., Crisona N.J., Cozzarelli N.R., Bensimon D., Croquette V.: The mechanism of type IA topoisomerases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002; 99: 12126-12131
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[17] Delius H., Worcel A.: Electron microscopic studies on the folded chromosome of Escherichia coli. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 1974; 38: 53-58
[PubMed]  
[18] Diaz R., Siddigi N., Rubin E.J.: Detecting genetic variability among different Mycobacterium tuberculosis strains using DNA microarrays technology. Tuberculosis, 2006; 86: 314-318
[PubMed]  
[19] DiNardo S., Voelkel K.A., Sternglanz R., Reynolds A.E., Wright A.: Escherichia coli DNA topoisomerase I mutants have compensatory mutations in DNA gyrase genes. Cell, 1982; 31: 43-51
[PubMed]  
[20] Donczew R., Weigel C., Lurz R., Zakrzewska-Czerwinska J., Zawilak-Pawlik A.: Helicobacter pylori oriC - the first bipartite origin of chromosome replication in Gram-negative bacteria. Nucleic Acids Res., 2012; 40: 9647-9660
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[21] Dorman C.J.: DNA supercoiling and environmental regulation of gene expression in pathogenic bacteria. Infect. Immun., 1991; 59: 745-749
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[22] Drolet M., Bi X., Liu L.F.: Hypernegative supercoiling of the DNA template during transcription elongation in vitro. J. Biol. Chem., 1994; 269: 2068-2074
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[23] Ebersbach G., Jacobs-Wagner C.: Exploration into the spatial and temporal mechanisms of bacterial polarity. Trends Microbiol., 2007; 15: 101-108
[PubMed]  
[24] Engelberg-Kulka H., Hazan R., Amitai S.: mazEF: a chromosomal toxin-antitoxin module that triggers programmed cell death in bacteria. J. Cell Sci., 2005; 118: 4327-4332
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[25] Espeli O., Mercier R., Boccard F.: DNA dynamics vary according to macrodomain topography in the E. coli chromosome. Mol. Microbiol., 2008; 68: 1418-1427
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[26] Ferdows M.S., Barbour A.G.: Megabase-sized linear DNA in the bacterium Borrelia burgdorferi, the Lyme disease agent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989; 86: 5969-5973
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[27] Fernandez-Moreira E., Balas D., Gonzalez I., de la Campa A.G.: Fluoroquinolones inhibit preferentially Streptococcus pneumoniae DNA topoisomerase IV than DNA gyrase native proteins. Microb. Drug Resist., 2000; 6: 259-267
[PubMed]  
[28] Forterre P., Gribaldo S., Gadelle D., Serre M.C.: Origin and evolution of DNA topoisomerases. Biochimie, 2007; 89: 427-446
[PubMed]  
[29] Fournier B., Klier A.: Protein A gene expression is regulated by DNA supercoiling which is modified by the ArlS-ArlR two-component system of Staphylococcus aureus. Microbiology, 2004; 150: 3807-3819
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[30] Galán J.E., Curtiss R. 3rd: Expression of Salmonella typhimurium genes required for invasion is regulated by changes in DNA supercoiling. Infect. Immun., 1990; 58: 1879-1885
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[31] Garcia M.T., Blázquez M.A., Ferrándiz M.J., Sanz M.J., Silva-Martin N., Hermoso J.A., de la Campa A.G.: New alkaloid antibiotics that target the DNA topoisomerase I of Streptococcus pneumoniae. J. Biol. Chem., 2011; 286: 6402-6413
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[32] Hammond G.G., Cassidy P.J., Overbye K.M.: Novobiocin-dependent topA deletion mutants of Escherichia coli. J. Bacteriol., 1991; 173: 5564-5567
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[33] Hansen G., Harrenga A., Wieland B., Schomburg D., Reinemer P.: Crystal structure of full length topoisomerase I from Thermotoga maritima. J. Mol. Biol., 2006; 358: 1328-1340
[PubMed]  
[34] Huang F., He Z.G.: Characterization of an interplay between a Mycobacterium tuberculosis MazF homolog, Rv1495 and its sole DNA topoisomerase I. Nucleic Acids Res., 2010; 38: 8219-8230
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[35] Huber R., Kurr M., Jannasch H.W., Stetter K.O.: A novel group of abyssal methanogenic archaebacteria (Methanopyrus) growing at 110°C. Nature, 1989; 342: 833-834
[Abstract]  
[36] Hwang Y., Park M., Fischer W.H., Burgin A. Jr., Bushman F.: DNA contacts by protein domains of the molluscum contagiosum virus type-1B topoisomerase. Virology, 1999; 262: 479-491
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[37] Hwang Y., Wang B., Bushman F.D.: Molluscum contagiosum virus topoisomerase: purification, activities, and response to inhibitors. J. Virol., 1998; 72: 3401-3406
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[38] Jain T., Roper B.J., Grove A.: A functional type I topoisomerase from Pseudomonas aeruginosa. BMC Mol. Biol., 2009; 10: 23
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[39] Janakiraman A., Goldberg M.B.: Recent advances on the development of bacterial poles. Trends Microbiol., 2004; 12: 518-525
[PubMed]  
[40] Keane O.M., Dorman C.J.: The gyr genes of Salmonella enterica serovar Typhimurium are repressed by the factor for inversion stimulation, Fis. Mol. Genet. Genomics, 2003; 270: 56-65
[PubMed]  
[41] Kelly A., Conway C., Cróinin T., Smith S.G., Dorman C.J.: DNA supercoiling and the Lrp protein determine the directionality of fim switch DNA inversion in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol., 2006; 188: 5356-5363
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[42] Kieser H.M., Kieser T., Hopwood D.A.: A combined genetic and physical map of the Streptomyces coelicolor A3(2) chromosome. J. Bacteriol., 1992; 174: 5496-5507
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[43] Kois A., Świątek M., Zakrzewska-Czerwińska J.: Structure of bacterial chromosome. Postępy Hig. Med. Dośw., 2007; 61: 534-540
[PubMed]  [Full Text PDF]  [Full Text PDF]  
[44] Krogh B.O., Shuman S.: A poxvirus-like type IB topoisomerase family in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002; 99: 1853-1858
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[45] Labigne A., de Reuse H.: Determinants of Helicobacter pylori pathogenicity. Infect. Agents Dis., 1996; 5: 191-202
[PubMed]  
[46] Lesley S.A., Jovanovich S.B., Tse-Dinh Y.C., Burgess R.R.: Identification of a heat shock promoter in the topA gene of Escherichia coli. J. Bacteriol., 1990; 172: 6871-6874
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[47] Levine C., Hiasa H., Marians K.J.: DNA gyrase and topoisomerase IV: biochemical activities, physiological roles during chromosome replication, and drug sensitivities. Biochim. Biophys. Acta, 1998; 1400: 29-43
[PubMed]  
[48] Luijsterburg M.S., Noom M.C., Wuite G.J., Dame R.T.: The architectural role of nucleoid-associated proteins in the organization of bacterial chromatin: a molecular perspective. J. Struct. Biol., 2006; 156: 262-272
[PubMed]  
[49] Macvanin M., Adhya S.: Architectural organization in E. coli nucleoid. Biochim. Biophys. Acta, 2012; 1819: 830-835
[PubMed]  
[50] McFarland K.A., Lucchini S., Hinton J.C., Dorman C.J.: The leucine-responsive regulatory protein, Lrp, activates transcription of the fim operon in Salmonella enterica serovar typhimurium via the fimZ regulatory gene. J. Bacteriol., 2008; 190: 602-612
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[51] Minkah N., Hwang Y., Perry K., Van Duyne G.D., Hendrickson R., Lefkowitz E.J., Hannenhalli S., Bushman F.D.: Variola virus topoisomerase: DNA cleavage specificity and distribution of sites in Poxvirus genomes. Virology, 2007; 365: 60-69
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[52] Mirkin S.M.: DNA topology: fundamentals. Encyclopedia of Life Sciences. Nature Publishing Group., 2001
[53] Mizushima T., Natori S., Sekimizu K.: Inhibition of Escherichia coli DNA topoisomerase I activity by phospholipids. Biochem. J., 1992; 285: 503-506
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[54] Murphy L.D., Zimmerman S.B.: Condensation and cohesion of lambda DNA in cell extracts and other media: implications for the structure and function of DNA in prokaryotes. Biophys. Chem., 1995; 57: 71-92
[PubMed]  
[55] Ni Bhriain N., Dorman C.J.: Isolation and characterization of a topA mutant of Shigella flexneri. Mol. Microbiol., 1993; 7: 351-358
[PubMed]  
[56] Niehus E., Gressmann H., Ye F., Schlapbach R., Dehio M., Dehio C., Stack A., Meyer T.F., Suerbaum S., Josenhans C.: Genome-wide analysis of transcriptional hierarchy and feedback regulation in the flagellar system of Helicobacter pylori. Mol. Microbiol., 2004; 52: 947-961
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[57] Niehus E., Ye F., Suerbaum S., Josenhans C.: Growth phase-dependent and differential transcriptional control of flagellar genes in Helicobacter pylori. Microbiology, 2002; 148: 3827-3837
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[58] Nurse P., Levine C., Hassing H., Marians K.J.: Topoisomerase III can serve as the cellular decatenase in Escherichia coli. J. Biol. Chem., 2003; 278: 8653-8660
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[59] Pavlov A.R., Belova G.I., Kozyavkin S.A., Slesarev A.I.: Helix-hairpin-helix motifs confer salt resistance and processivity on chimeric DNA polymerases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002; 99: 13510-13515
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[60] Perugino G., Valenti A., D'amaro A., Rossi M., Ciaramella M.: Reverse gyrase and genome stability in hyperthermophilic organisms. Biochem. Soc. Trans., 2009; 37: 69-73
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[61] Peter B.J., Arsuaga J., Breier A.M., Khodursky A.B., Brown P.O., Cozzarelli N.R.: Genomic transcriptional response to loss of chromosomal supercoiling in Escherichia coli. Genome Biol., 2004; 5: R87
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[62] Postow L., Crisona N.J., Peter B.J., Hardy C.D., Cozzarelli N.R.: Topological challenges to DNA replication: conformations at the fork. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001; 98: 8219-8226
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[63] Postow L., Hardy C.D., Arsuaga J., Cozzarelli N.R.: Topological domain structure of the Escherichia coli chromosome. Genes Dev., 2004; 18: 1766-1779
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[64] Pruss G.J., Manes S.H., Drlica K.: Escherichia coli DNA topoisomerase I mutants: increased supercoiling is corrected by mutations near gyrase genes. Cell, 1982; 31: 35-42
[PubMed]  
[65] Raoult D., Audic S., Robert C., Abergel C., Renesto P., Ogata H., La Scola B., Suzan M., Claverie J.M.: The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus. Science, 2004; 306: 1344-1350
[PubMed]  
[66] Rochman M., Aviv M., Glaser G., Muskhelishvili G.: Promoter protection by a transcription factor acting as a local topological homeostat. EMBO Rep., 2002; 3: 355-360
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[67] Rohde J.R., Luan X.S., Rohde H., Fox J.M., Minnich S.A.: The Yersinia enterocolitica pYV virulence plasmid contains multiple intrinsic DNA bends which melt at 37°C. J. Bacteriol., 1999; 181: 4198-4204
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[68] Rui S., Tse-Dinh YC.: Topoisomerase function during bacterial responses to environmental challenge. Front. Biosci., 2003; 8: d256-d263
[PubMed]  
[69] Sassetti C.M., Rubin E.J.: Genetic requirements for mycobacterial survival during infection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003; 100: 12989-12994
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[70] Schneider R., Travers A., Muskhelishvili G.: The expression of the Escherichia coli fis gene is strongly dependent on the superhelical density of DNA. Mol. Microbiol., 2000; 38: 167-175
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[71] Schofield M.A., Agbunag R., Michaels M.L., Miller J.H.: Cloning and sequencing of Escherichia coli mutR shows its identity to topB, encoding topoisomerase III. J. Bacteriol., 1992; 174: 5168-5170
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[72] Shapiro L., McAdams H.H., Losick R.: Why and how bacteria localize proteins. Science, 2009; 326: 1225-1228
[PubMed]  
[73] Sikder D., Unniraman S., Bhaduri T., Nagaraja V.: Functional cooperation between topoisomerase I and single strand DNA-binding protein. J. Mol. Biol., 2001; 306: 669-679
[PubMed]  
[74] Sinden R.R.: DNA structure and function. Academic Press. San Diego USA, 1994
[75] Sinden R.R., Pettijohn D.E.: Chromosomes in living Escherichia coli cells are segregated into domains of supercoiling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981; 78: 224-228
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[76] Slesarev A.I., Mezhevaya K.V., Makarova K.S., Polushin N.N., Shcherbinina O.V., Shakhova V.V., Belova G.I., Aravind L., Natale D.A., Rogozin I.B., Tatusov R.L., Wolf Y.I., Stetter K.O., Malykh A.G., Koonin E.V., Kozyavkin S.A.: The complete genome of hyperthermophile Methanopyrus kandleri AV19 and monophyly of archaeal methanogens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002; 99: 4644-4649
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[77] Slesarev A.I., Stetter K.O., Lake J.A., Gellert M., Krah R., Kozyavkin S.A.: DNA topoisomerase V is a relative of eukaryotic topoisomerase I from a hyperthermophilic prokaryote. Nature, 1993; 364: 735-737
[PubMed]  
[78] Stupina V.A., Wang J.C.: Viability of Escherichia coli topA mutants lacking DNA topoisomerase I. J. Biol. Chem., 2005; 280: 355-360
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[79] Suerbaum S.: The complex flagella of gastric Helicobacter species. Trends Microbiol., 1995; 3: 168-170
[PubMed]  
[80] Suerbaum S., Brauer-Steppkes T., Labigne A., Cameron B., Drlica K.: Topoisomerase I of Helicobacter pylori: juxtaposition with a flagellin gene (flaB) and functional requirement of a fourth zinc finger motif. Gene, 1998; 210: 151-161
[PubMed]  
[81] Taneja B., Schnurr B., Slesarev A., Marko J.F., Mondragón A.: Topoisomerase V relaxes supercoiled DNA by a constrained swiveling mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007; 104: 14670-14675
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[82] Trucksis M., Michalski J., Deng Y.K., Kaper J.B.: The Vibrio cholerae genome contains two unique circular chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998; 95: 14464-14469
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[83] Tsai H.P., Lin L.W., Lai Z.Y., Wu J.Y., Chen C.E., Hwang J., Chen C.S., Lin C.M.: Immobilizing topoisomerase I on a surface plasmon resonance biosensor chip to screen for inhibitors. J. Biomed. Sci., 2010; 17: 49
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[84] Viard T., Cossard R., Duguet M., de La Tour C.B.: Thermotoga maritima-Escherichia coli chimeric topoisomerases. Answers about involvement of the carboxyl-terminal domain in DNA topoisomerase I-mediated catalysis. J. Biol. Chem., 2004; 279: 30073-30080
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[85] Wang H., Di Gate R.J., Seeman N.C.: An RNA topoisomerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996; 93: 9477-9482
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[86] Wang J.C.: Interaction between DNA and an Escherichia coli protein omega. J. Mol. Biol., 1971; 55: 523-533
[PubMed]  
[87] Wang J.C., Caron P.R., Kim R.A.: The role of DNA topoisomerases in recombination and genome stability: a double-edged sword? Cell, 1990; 62: 403-406
[PubMed]  
[88] Wang J.Y., Syvanen M.: DNA twist as a transcriptional sensor for environmental changes. Mol. Microbiol., 1992; 6: 1861-1866
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[89] Weinstein-Fischer D., Altuvia S.: Differential regulation of Escherichia coli topoisomerase I by Fis. Mol. Microbiol., 2007; 63: 1131-1144
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[90] Wu H.Y., Shyy S.H., Wang J.C., Liu L.F.: Transcription generates positively and negatively supercoiled domains in the template. Cell, 1988; 53: 433-440
[PubMed]  
[91] Yang W.: Topoisomerases and site-specific recombinases: similarities in structure and mechanism. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 2010; 45: 520-534
[PubMed]  
[92] Ye F., Brauer T., Niehus E., Drlica K., Josenhans C., Suerbaum S.: Flagellar and global gene regulation in Helicobacter pylori modulated by changes in DNA supercoiling. Int. J. Med. Microbiol., 2007; 297: 65-68
[PubMed]  
[93] Zhang Z., Cheng B., Tse-Dinh Y.C.: Crystal structure of a covalent intermediate in DNA cleavage and rejoining by Escherichia coli DNA topoisomerase I. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011; 108: 6939-6944
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[94] Zhu C.X., Roche C.J., Tse-Dinh Y.C.: Effect of Mg(II) binding on the structure and activity of Escherichia coli DNA topoisomerase I. J. Biol. Chem., 1997; 272: 16206-16210
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[95] Zimmerman S.B.: Cooperative transitions of isolated Escherichia coli nucleoids: implications for the nucleoid as a cellular phase. J. Struct. Biol., 2006; 153: 160-175
[PubMed]  
Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.