Postepy Hig Med Dosw. (online), 2012; 66: 452-460
Review
Full Text PDF  

Metody wykrywania wybranych wirusów wywołujących zakażenia układu oddechowego
Methods of detection of selected respiratory viruses
Ilona Stefańska1,2  , Magdalena Romanowska1  , Lidia B. Brydak1,3  
1Zakład Badania Wirusów Grypy. Krajowy Ośrodek ds. Grypy, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego – Państwowy Zakład Higieny w Warszawie
2Zakład Technologii Fermentacji, Instytut Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego, Warszawa
3Katedra Mikrobiologii i Immunologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Szczeciński
Adres do korespondencji
dr n. wet. Ilona Stefańska, Zakład Badania Wirusów Grypy, Krajowy Ośrodek ds. Grypy, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego – Państwowy Zakład Higieny, ul Chocimska 24, 00-791 Warszawa; e-mail: i.stefanska@gmail.com

Otrzymano:  2011.12.16
Zaakceptowano:  2012.04.25
Opublikowano:  2012.06.28

Streszczenie
Wirusy wywołujące zakażenia układu oddechowego są istotną przyczyną zachorowań i zgonów u osób zdrowych, jak i tych z obniżoną odpornością oraz pociągają za sobą znaczące koszty eko­nomiczne w systemie opieki zdrowotnej. Podobne objawy kliniczne w przebiegu różnych zaka­żeń układu oddechowego o etiologii wirusowej i bakteryjnej sprawiają, że postawienie właściwej diagnozy jest trudne. Trafna i szybka diagnostyka ma podstawowe znaczenie w kontroli zakażeń i podjęcia decyzji odnośnie postępowania z pacjentem, a zwłaszcza zastosowania odpowiedniej terapii przeciwbakteryjnej lub przeciwwirusowej oraz hospitalizacji. Ponadto identyfikacja czyn­nika etiologicznego choroby pozwala wyeliminować niemające uzasadnienia użycie antybioty­ków, a także obniżyć koszty opieki medycznej.
W przypadku wykrywania wirusów odpowiedzialnych za zakażenia układu oddechowego zasto­sowanie ma wiele różnych procedur diagnostycznych. Przez wiele lat podstawowymi metodami używanymi w rutynowej diagnostyce było wykrywanie antygenów wirusa oraz izolacja wirusa w hodowli komórkowej. Niemniej jednak w ostatnim czasie techniki amplifikacji kwasów nu­kleinowych zaczęły być szeroko stosowane, przy czym znacząco poprawiły czułość wykrywa­nia wirusów w próbkach klinicznych. Testy diagnostyczne oparte na biologii molekularnej przy­czyniły się tym samym do lepszego wykrywania koinfekcji (reakcje multiplex) oraz umożliwiły wykrywanie wirusów trudnych do namnażania w hodowlach.
W artykule omówiono wiele technicznych aspektów obecnie używanych technik, ich podstawo­we zasady, zalety, wartość diagnostyczną, ale również pewne ograniczenia.
Słowa kluczowe: diagnostyka • PCR • wirus • wirusowe zakażenie układu oddechowego


Summary
Respiratory viruses contribute to significant morbidity and mortality in healthy and immuno­compromised individuals and are considered as a significant economic burden in the healthca­re system. The similar clinical symptoms in the course of different viral and bacterial respirato­ry infections make the proper diagnosis difficult. An accurate and prompt diagnostics is crucial for infection control and patient management decisions, especially regarding the use of antibac­terial or antiviral therapy and hospitalization. Moreover, the identification of the causative agent eliminates inappropriate use of antibiotics and may reduce the cost of healthcare.
A wide variety of diagnostic procedures is applied for the detection of viral agents responsible for respiratory tract infections. For many years, the viral antigen detection and standard isolation technique in cell culture was the main method used in routine diagnostics. However, in recent years the nucleic acid amplification techniques have become widely used and have significan­tly improved the sensitivity of viral detection in clinical specimens. Molecular diagnostic assays have contributed to revealing high rates of co-infection (multiplex reactions) and allow identifi­cation of agents that are difficult to culture.
This paper discusses a number of technical aspects of the current most commonly used techniqu­es, their general principles, main benefits and diagnostic value, but also some of their limitations.
Key words: diagnostics • PCR • virus • viral respiratory tract infection




Wstęp
Wirusy wywołujące zakażenia układu oddechowego są jedną z najczęstszych przyczyn zachorowań u ludzi. Do najważniejszych i najbardziej rozpowszechnionych należą m.in. wirus grypy A i B (IV-A, -B), wirus RS typu A i B (RSV-A, -B), wirus paragrypy 1, 2, 3 i 4 (PIV-1, -2, -3, -4), metapneumowirusy (hMPV), adenowirusy (hAdV), koronawirusy (hCoV), rinowirusy (hRV), enterowirusy (EV) oraz bokawirus (hBoV) [12,23,32]. Wirusy te cha­rakteryzuje duża chorobotwórczość oraz łatwa transmisja, dzięki czemu mogą szybko rozprzestrzeniać się, zwłasz­cza w miejscach o znacznym zagęszczeniu ludzi, takich jak środki lokomocji, urzędy, szkoły czy przedszkola [36]. Mimo ich powszechnego występowania i często łagodnego przebiegu zakażenia, niektóre z nich mogą stanowić poważ­ny problem zdrowotny, kończący się powikłaniami, a na­wet zgonem. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) po­daje, że zakażenia dróg oddechowych stanowią drugą, co do częstości występowania przyczyną zgonów u dzieci do 5 roku życia [33]. Corocznie z powodu grypy choruje na świecie od 330 mln do 1575 mld, a umiera od 0,5 mln do miliona osób [6]. Przypadki ciężkich zakażeń występują najczęściej u osób z grup wysokiego ryzyka bez wzglę­du na wiek, dzieci do 24 miesiąca, a także osoby starsze. Ponadto osłabiony zakażeniem wirusowym organizm staje się podatny na inwazję innymi patogenami, co może pro­wadzić do różnego rodzaju zakażeń wtórnych.
Zakażenia wirusami atakującymi drogi oddechowe koń­czące się zgonem występują nie tylko u osób z grup wyso­kiego ryzyka. Sytuacja taka dotyczy wyjątkowo patogen­nych wirusów, do których należy wirus grypy. Dobrym przykładem obrazującym skalę problemu może być pan­demia z 1918 roku zwana „hiszpanką", która jak się sza­cuje spowodowała w tamtym okresie zgon 50-100 milio­nów osób [25]. Obecnie coraz częściej pojawia się problem ptasiej grypy wywołanej głównie przez wysoce patogen­ny podtyp wirusa A/H5N1 (highly pathogenic avian influ­enza - HPAI), który (wg raportu WHO z dn. 29.11.2011) z niemal 60% śmiertelnością spowodował zgon 335 osób.
Z kolei koronawirus SARS (SARS-CoV), wywołujący ze­spół ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej (SARS - se­vere acute respiratory syndrome), spowodował zakażenie u ponad 8000 osób, w tym 774 zgony (wg raportu WHO z dn. 21.04.2004).
Poważnym zagrożeniem dla zdrowia i życia człowieka są różnego rodzaju powikłania wynikające nie tylko z działa­nia samego wirusa, lecz mogące powstawać na skutek re­akcji układu immunologicznego gospodarza oraz zakażeń wtórnych. Do najczęstszych powikłań należą: zapalenie płuc i oskrzeli (w tym wywołane wtórnymi zakażeniami wiruso­wymi bądź bakteryjnymi np. przez Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Mycoplasma pneumoniae, Legionella sp.), zwłóknienie płuc, zapalenie oskrzelików płucnych u niemowląt i u dzie­ci, zapalenie mięśnia serca i osierdzia, odrzuty przeszcze­pów, zapalenie ucha środkowego, zapalenie mięśni, a tak­że powikłania ze strony układu nerwowego i moczowego itp. [6,21,22].
Diagnostyka wirusologiczna zakażeń układu oddechowego
Trudności w różnicowaniu klinicznym chorób o etiologii wirusowej i bakteryjnej prowadzą często do nieuzasadnio­nego stosowania antybiotyków. Przy zakażeniach układu oddechowego wywołanych przez różne wirusy mogą wystę­pować podobne i mało swoiste objawy kliniczne, co utrud­nia rozpoznanie na ich podstawie czynnika etiologicznego i postawienie właściwej diagnozy. Jednocześnie zakażenia wywołane tym samym wirusem mogą prowadzić do wy­stąpienia zróżnicowanych objawów, w zależności np. od wieku czy kondycji pacjenta. Z tego powodu rozpoznanie i leczenie nie powinno opierać się jedynie na obrazie kli­nicznym choroby. Bardzo ważna jest diagnostyka labora­toryjna pozwalająca na dokładną identyfikację patogenu wywołującego chorobę i umożliwiająca podjęcie właści­wej decyzji o sposobie leczenia chorego.
Ukierunkowane leczenie możliwe jest w przypadku zaka­żeń dróg oddechowych wywołanych tylko przez niektóre wirusy. W leczeniu grypy z powodzeniem stosowane są inhibitory neuraminidazy, takie jak oseltamiwir bądź za­namiwir. Leki te są nieskuteczne w przypadku zakażeń wywołanych przez inne wirusy atakujące układ oddecho­wy. Badania dotyczące leczenia pacjentów oseltamiwi­rem i zanamiwirem wykazały, że niemal u 50% osób nie było wskazań medycznych do podania leku, gdyż zakaże­nie nie było wywołane przez wirus grypy [7]. Innymi le­kami przeciwgrypowymi, jednak obecnie mniej skutecz­nymi, ze względu na powszechne występowanie oporności wśród krążących szczepów oraz wywołującymi działania niepożądane, są amantadyna i rymantadyna. Leki te cha­rakteryzuje duża wybiórczość, gdyż celem ich działania jest białko M2, obecne jedynie w strukturze wirusa gry­py A [7]. Dodatkowo wszystkie te leki, aby wykazały sku­teczność muszą zostać podane nie później niż 36 godz. od wystąpienia pierwszych objawów. W przypadku innych wcześniej wymienionych wirusów wywołujących zaka­żenia układu oddechowego nie ma żadnych swoistych le­ków przeciwwirusowych.
Postawienie trafnej diagnozy w krótkim czasie pozwala uniknąć niepotrzebnej, często wyniszczającej organizm i mogącej wywoływać działania niepożądane, terapii le­kami antywirusowymi, a w razie uzyskania wyniku po­twierdzającego obecność patogenu umożliwia zastoso­wanie celowanej terapii przeciwwirusowej. Racjonalne, właściwie wdrożone i podjęte w odpowiednim czasie le­czenie obniża niebezpieczeństwo pojawienia się ukierun­kowanych mutacji prowadzących do oporności na stoso­wany lek, skraca czas pobytu pacjenta w szpitalu, obniża koszty leczenia i hospitalizacji, a także zapobiega szerze­niu się zakażenia wśród ludzi [5]. Istotne znaczenie w za­pobieganiu zakażeń wirusem grypy może mieć wdrożenie celowanej terapii przeciwwirusowej nie tylko u chorych, ale i u członków rodziny i innych osób mających kontakt z chorymi. Problematyka ta jest ściśle związana także z kontrolą i zapobieganiem zakażeniom szpitalnym, da­jąc możliwość ograniczenia szerzenia się zakażenia z pa­cjenta na pacjenta oraz na pracowników służby zdrowia.
W przypadku wirusa grypy szczegółowa i dokładna diagno­styka niesie za sobą jeszcze inny ogromnie ważny aspekt. Dane dotyczące właściwości antygenowych szczepów izo­lowanych w różnych miejscach na świecie, prowadzą do ustalenia odpowiedniego składu szczepionki przeciwgry­powej na dany sezon epidemiczny, co w efekcie prowadzi do jej zwiększonej skuteczności. Oprócz oznaczeń prowa­dzonych tzw. testami przyłóżkowymi, umożliwiającymi szybkie wykrycie wirusa grypy, niezwykle ważne są wy­sokospecjalistyczne badania jakie oferują Krajowe Ośrodki ds. Grypy. Analizy te obejmują m.in. diagnostykę mole­kularną, połączoną z kolekcjonowaniem szczepów krążą­cych w populacji w kolejnych sezonach.
Metody wykrywania wirusówwywołujących zakażenia układu oddechowego
Do tradycyjnych metod diagnostycznych mających na celu identyfikację wirusów wywołujących zakażenia układu od­dechowego w materiale pobranym od pacjenta należą testy, których zasada polega na wykrywaniu antygenów wiruso­wych, w tym testy immunofluorescencyjne, immunoenzy­matyczne np. test ELISA i immunochromatograficzne oraz metody oparte na uzyskaniu hodowli wirusa (z wykorzysta­niem zarodków ptasich lub hodowli tkankowych). Analizy serologiczne są znacznie szybsze i mniej kosztowne, jed­nak często charakteryzuje je mniejsza czułość i swoistość w porównaniu z metodami izolacji w hodowli.
Wykrywanie antygenów wirusowych
Jednym z najczęściej stosowanych testów umożliwiają­cych wykazanie obecności antygenów określonego wirusa w próbkach klinicznych, takich jak np. popłuczyny oskrze­lowo-pęcherzykowe (BAL), aspiraty nosowo-gardłowe, wy­mazy z nosa i gardła są testy immunofluorescencyjne (IF). W metodzie tej można wykorzystywać swoiste przeciwciała skoniugowane bezpośrednio z fluorochromem (fluoresce­iną) i skierowane przeciwko określonym antygenom danego wirusa (metoda bezpośrednia) lub niewyznakowane swo­iste przeciwciała, a następnie znakowane fluorochromem przeciwciała antyglobulinowe (metoda pośrednia). Wynik reakcji uzyskuje się w postaci emitujących zielone świa­tło kompleksów powstałych w miejscu związania wyzna­kowanego fluoresceiną przeciwciała z antygenem wiruso­wym lub kompleksem antygen-przeciwciało, widocznych na tle kontrastowo wybarwionych komórek ludzkiego na­błonka (odczyt w mikroskopie fluorescencyjnym).
Immunofluorescencja bezpośrednia (DIF) jest metodą szyb­szą, ale mniej czułą. Wykorzystanie w teście IF przeciw­ciał monoklonalnych umożliwia nie tylko wykrycie dane­go patogenu, ale także pozwala na określenie jego typu, co może mieć ważne znaczenie w przypadku badań epi­demiologicznych, a także aspekt terapeutyczny (leki prze­ciwwirusowe działające swoiście na określony typ wirusa, jak wspomniana wcześniej amantadyna i rymantadyna). W ciągu ostatnich lat przeciwciała monoklonalne oraz go­towe zestawy IF umożliwiające wykrywanie antygenów najbardziej istotnych klinicznie wirusów stały się dostęp­ne i powszechnie stosowane w diagnostyce zakażeń układu oddechowego. Należy jednak podkreślić, że analiza i inter­pretacja wyników uzyskanych metodą IF jest często żmud­na i subiektywna, zależna w dużym stopniu od doświad­czenia i kompetencji osoby badającej. Niewielkie stężenie cząstek wirusowych w drogach oddechowych i w pobra­nym materiale oraz duża ilość śluzu, a przede wszystkim brak lub niewielka liczba nienaruszonych komórek w ba­danym materiale mogą prowadzić do fałszywie ujemnych wyników. Próbki do badań IF muszą być transportowane i przechowywane w odpowiednich warunkach, w niskiej temperaturze, ale bez mrożenia, a badanie należy wykonać jak najszybciej od pobrania próbki, aby zapobiec uszkodze­niu komórek. Jedynie test IF pozwala na ocenę jakościową próbki, gdyż uwidoczniona zostaje liczba komórek obec­nych w pobranym materiale. Należy także zaznaczyć, że obraz uzyskany tą metodą jest bardzo nietrwały, gdyż flu­orochromy ulegają szybkiemu rozkładowi pod wpływem światła. Obraz fluorescencji może różnić się w zależno­ści od typu mikroskopu czy źródła zastosowanego światła.
Warunki oraz czas transportu próbki mają nieco mniejszy wpływ na wynik badania przy zastosowaniu testu ELISA, gdyż w metodzie tej wykrywa się tylko antygeny wiruso­we i stopień uszkodzenia komórek nie wpływa na anali­zę tak jak w przypadku IF. Testy immunoenzymatyczne wykorzystują przeciwciała monoklonalne skoniugowane z enzymem (a nie fluorochromem). Antygen (związa­ny uprzednio przez swoiste przeciwciała opłaszczone na płytce) rozpoznawany jest bezpośrednio przez wyznako­wane przeciwciała lub pośrednio, poprzez dodanie swo­istych niewyznakowanych przeciwciał, a w drugiej kolej­ności wyznakowanych przeciwciał antyglobulinowych. Metoda ta umożliwia przeprowadzenie analizy półilościo­wej przez pomiar powstałego barwnego produktu reakcji. Dostępnych jest wiele komercyjnych testów ELISA, które są proste w wykonaniu i interpretacji, a tym samym mniej zależne od umiejętności i doświadczenia wykonującej je osoby, niż wspomniana wcześniej IF. W przypadku bra­ku komercyjnych testów ELISA dla danego patogenu, du­żym ograniczeniem może być konieczność samodzielne­go przygotowania i wyznakowania swoistych przeciwciał, co jest kosztowne i nie zawsze możliwe do wykonania.
Na rynku dostępne są także szybkie testy, tzw. testy przy­łóżkowe, oparte najczęściej na metodach immunochro­matograficznych. Pozwalają one na uzyskanie wyniku w ciągu zaledwie 15-30 min, nie wymagają specjalistycz­nego sprzętu, ani wykwalifikowanego personelu. Jednak ze względu na niską czułość tych testów (Agoritsas i wsp. 2006: 85-69% w zależności od rodzaju pobranego materia­łu; Grijalva i wsp. 2007: 63%; Uyeki i wsp. 2009: 19-32%) w przypadku uzyskania wyniku ujemnego wymagane jest potwierdzenie z wykorzystaniem innych, bardziej czułych metod diagnostycznych (np. hodowla, IF, badania mole­kularne). Ponadto szybkie testy antygenowe stosowane są powszechnie w diagnostyce tylko niektórych wirusów od­dechowych (głównie wirusa grypy A i B oraz wirusa RS, rzadziej adenowirusów i innych). Brak jest na rynku szyb­kich testów umożliwiających identyfikację określonych podtypów wirusa grypy.
Izolacja i identyfikacja wirusów w hodowlach
Wśród konwencjonalnych metod diagnostycznych za zło­ty standard uważa się metody oparte na hodowli patoge­nów. Do hodowli wirusów wywołujących zakażenia układu oddechowego najczęściej wykorzystuje się zarodki kurze (wirus grypy), pierwotne linie komórkowe wyprowadzo­ne z nerki rezusa (RhMK), a także wiele różnych ciągłych, ustalonych linii komórkowych, takich jak A549 (linia ko­mórkowa wyprowadzona z ludzkich komórek nowotworo­wych raka płuc), HEp-2 (z ludzkich komórek raka krtani), MRC5 (z tkanki płucnej 14-tygodniowego ludzkiego pło­du), MDCK (z tkanki nabłonkowej pobranej z nerki psa) czy Vero (z tkanki nabłonkowej pobranej z nerki afrykań­skiego koczkodana zielonego) [14,19]. Identyfikacja wi­rusa odbywa się na podstawie charakterystycznych zmian patologicznych w komórce (efekt cytopatyczny) oraz z za­stosowaniem metod hemoadsorpcji, immunofluorescencji lub biologii molekularnej.
Izolacja wirusa jest krokiem niezbędnym do przeprowa­dzenia dokładnej charakterystyki szczepu wirusowego, w tym określenia jego wrażliwości na leki przeciwwiru­sowe. Umożliwia potwierdzenie obecności w badanych próbkach czynników wirusowych zdolnych do replikacji. Założenie hodowli pozwala na izolację nowego wariantu wirusa, znacznie różniącego się antygenowo/genetycznie od krążących szczepów nowego wirusa, a także kilku wi­rusów z jednej próbki klinicznej w przypadku koinfekcji.
Jednak hodowla, a następnie identyfikacja wyizolowanego wirusa jest metodą kosztowną i czasochłonną, a czas ocze­kiwania na wynik jest często zbyt długi (nawet do 2 tygo­dni), co znacznie ogranicza możliwość jej wykorzystania w praktyce klinicznej. Przyczyną niepowodzeń w prowa­dzeniu hodowli jest to, że nie wszystkie wirusy mogą re­plikować się w warunkach in vitro, w kulturach komórko­wych (np. hMPV, SARS-CoV, CoV NL63, CoV HKU1, hBV) [8,20,36]. Niektóre szczepy do wzrostu wykrywal­nego poziomu w warunkach in vitro mogą wymagać dłuż­szego czasu adaptacji, przez co konieczne jest przepro­wadzenie kilku pasaży. Poszczególne wirusy wywołujące zakażenia układu oddechowego mają zróżnicowane wy­magania, co może pociągać konieczność użycia dla każdej próbki klinicznej kilku rodzajów linii komórkowych w celu wykrycia różnych wirusów, w tym zakażeń mieszanych. Zastosowanie w ostatnich latach kombinacji kilku odpo­wiednio wyselekcjonowanych linii komórkowych w poje­dynczej hodowli wyeliminowało potrzebę stosowania tych linii oddzielnie. Przykładem może być rosnąca jednowar­stwowo hodowla R-Mix (Mixed Fresh Cells), która za­wiera ludzkie komórki nowotworowe płuc (A549) i epi­telialne komórki wyprowadzone z płuc norki (Mv1Lu). Komórki Mv1Lu są bardzo wrażliwe na zakażenie wiru­sem grypy A i B, a połączenie tych komórek z linią A549 zwiększa ich wrażliwość także na inne wirusy związane z układem oddechowym, takie jak hAdV, wirus RS czy PIV-1, -3 [19]. Olbrzymią zaletą hodowli R-Mix jest nie tylko jej zwiększona czułość, ale przede wszystkim dużo szybsze wykrywanie wirusów, możliwe już w 1-3 dniu po zakażeniu. Liczne badania wykazują, że metoda ta jest istotnie bardziej czuła niż DIF i co najmniej tak samo czu­ła jak standardowe hodowle zawierające komórki tylko jed­nego rodzaju. Na przykład George i wsp. [16] wykazali, że czułość i swoistość dla hodowli R-Mix wynosiła 100%, podczas gdy dla hodowli z wykorzystaniem konwencjo­nalnych linii komórkowych odpowiednio 67 i 10%, a dla metody DIF 66 i 98%.
Ponieważ metody oparte na bezpośrednim wykrywaniu antygenów wirusowych są mniej czułe niż izolacja w ho­dowli, a hodowla jest czasochłonna, aby podwyższyć wia­rygodność wyników i skrócić czas analizy, można zasto­sować w diagnostyce obie te metody, wykrywając białka wirusowe nie w materiale bezpośrednim, ale w hodowlach komórkowych uprzednio zakażonych takim materiałem. Badanie takie wykonuje się zazwyczaj po 24-48 godz. od zakażenia, co z jednej strony opóźnia uzyskanie wyniku i postawienie diagnozy, ale z drugiej strony umożliwia wy­krycie wirusa w próbkach, w których występuje nawet nie­wielka liczba zdolnych do replikacji wirionów.
Wykrywanie kwasów nukleinowych
Niezastąpioną metodą, znajdującą coraz szersze zastoso­wanie w diagnostyce wirusów wywołujących zakażenia dróg oddechowych, wielu zakażeń wirusowych i bakte­ryjnych jest wykrywanie materiału genetycznego patoge­nów z zastosowaniem łańcuchowej reakcji polimerazy (po­lymerase chain reaction - PCR). PCR polega na wysoce swoistej amplifikacji wybranego fragmentu kwasu nukle­inowego, występującego tylko u danego wirusa i określo­nego przez sekwencję zastosowanych w reakcji starterów. Wizualizacja powstałych produktów PCR zachodzi poprzez ich elektroforezę w żelu agarozowym (rzadziej poliakryla­midowym) i wybarwieniu barwnikami fluorescencyjnymi interkalującymi w podwójną nić DNA, takimi jak bromek etydyny. Alternatywą do elektroforezy może być hybrydy­zacja produktów amplifikacji ze znakowanymi izotopowo lub enzymatycznie sondami oligonukleotydowymi, kom­plementarnymi do poszukiwanej sekwencji.
W porównaniu z wieloma innymi metodami wykorzystywa­nymi w wirusologicznej diagnostyce zakażeń układu odde­chowego, PCR jest techniką znacznie szybszą i mniej pra­cochłonną, a uzyskiwane wyniki są jednoznaczne i łatwe do interpretacji. Największą zaletą tej metody jest bardzo duża czułość, swoistość, a także uniwersalność, polegają­ca na możliwości badania różnych rodzajów materiałów pobranych od pacjenta. Ponadto reakcja łańcuchowa po­limerazy daje bezpośrednią możliwość nie tylko różnico­wania pomiędzy typami, ale również określenia podtypu wirusa czy nawet jego wariantu. Podczas ostatniej pande­mii grypy w 2009 roku diagnostyka wirusa pandemiczne­go A(H1N1)2009 opierała się głównie na metodzie PCR, która umożliwia odróżnienie tego wariantu od szczepów grypy sezonowej, w tym także A/H1N1 [43,52].
Różnicowanie podtypów wirusa ma szczególne znaczenie w przypadku wirusów ptasiej grypy w celu rozróżnienia szczepów potencjalnie wysoce patogennych (HPAI, nale­żących do podtypu H5 lub H7) od tych o niskiej patogen­ności, powszechnie występujących u ptactwa dzikiego i do­mowego. Dlatego metody oparte na łańcuchowej reakcji polimerazy wykorzystywane są do stałego monitorowania stad czy też tuszek drobiowych, jako alternatywa do cza­sochłonnych metod opartych na izolacji wirusa na zarod­kach kurzych, a następnie jego podtypowaniu testem za­hamowania hemaglutynacji [41].
Wprowadzenie do rutynowej diagnostyki technik opar­tych na amplifikacji kwasów nukleinowych stało się prze­łomem w diagnostyce wirusów wywołujących zakażenia układu oddechowego i ujawniło dużą częstość występo­wania zakażeń, które wcześniej nie były diagnozowane z powodu trudności w hodowli niektórych wirusów (np. hMPV, hRV) [2,8,36,47,54]. Metody molekularne stwier­dzające obecność materiału genetycznego wirusa umożli­wiają identyfikację patogenów, które są trudne lub wręcz niemożliwe do hodowli oraz takich, dla których nie ma ko­mercyjnie dostępnych testów opartych na wykrywaniu an­tygenów wirusowych.
Większość wirusów wywołujących zakażenia dróg odde­chowych to wirusy RNA, o informacji genetycznej zapisanej w postaci sekwencji kwasu rybonukleinowego (wyjątkiem są adenowirusy o dwuniciowym liniowym DNA). W przy­padku identyfikacji tych wirusów amplifikacja charaktery­stycznych fragmentów ich genomu musi zostać poprzedzo­na przepisaniem informacji genetycznej na sekwencję DNA (powstaje komplementarny DNA - cDNA). Modyfikacja metody PCR, poprzez dodanie etapu odwrotnej transkryp­cji, nosi nazwę RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR). RT-PCR może występować w dwóch wariantach: jednoeta­powym (one-step RT-PCR), gdy zarówno odwrotna trans­krypcja, jak i PCR przeprowadzane są w jednej probów­ce lub dwuetapowym (two-step RT-PCR), gdy przepisanie RNA na cDNA oraz amplifikacja określonych sekwencji są dwoma rozdzielonymi fizycznie etapami. Liczne bada­nia wskazują, że reakcję dwuetapową charakteryzuje lep­sza czułość niż reakcję jednoetapową [31,34,49], ponadto bufor reakcyjny optymalny dla działania odwrotnej trans­kryptazy może mieć hamujący wpływ na aktywność poli­merazy w kolejnym etapie, zmniejszając tym samym wydaj­ność PCR. One-step RT-PCR charakteryzuje się szybszym przebiegiem, a zminimalizowanie liczby etapów ogranicza ryzyko zanieczyszczenia próbki oraz zwiększa powtarzal­ność uzyskiwanych wyników.
Niewątpliwą zaletą metody PCR jest jej wyjątkowa czu­łość, gdyż w reakcji dochodzi do wielokrotnego powiele­nia wybranego odcinka kwasu nukleinowego, teoretycznie nawet około 10 mln razy. Metoda ta jest szczególnie uży­teczna, gdy w badanej próbce jest niewielkie miano wirusa lub okres jego wydalania jest krótki, co występuje często np. w przebiegu zakażenia wirusem grypy u osób powy­żej 65 roku życia. Koncentracja wirusa może szybko spa­dać w ciągu kilku pierwszych dni po zakażeniu, skutkiem tego w późnym stadium zakażenia wirus może być niewy­krywalny innymi metodami. Jednak taka czułość PCR sta­nowi niebezpieczeństwo uzyskania wyników fałszywie do­datnich w przypadku zanieczyszczenia próbki DNA/RNA pochodzącym ze środowiska, ponadto RNA jest mniej sta­bilny niż DNA, a w wyniku niewłaściwego postępowa­nia z materiałem przeznaczonym do badań PCR RNA-zy mogą doprowadzić do zdegradowania kwasu nukleinowe­go jeszcze przed wykonaniem testu i uzyskania fałszywie ujemnych wyników. Na fałszywie ujemne wyniki może wpływać nie tylko obecność w badanej próbce enzymów degradujących RNA (lub DNA), ale także fragmentacja kwasów nukleinowych, błędy w wykonaniu (np. błąd pipe­towania), mało wydajna izolacja RNA/DNA, inaktywacja enzymów, a przede wszystkim obecność w próbkach kli­nicznych inhibitorów PCR. Komórkowe kwasy nukleino­we, białka, sole i inne komórkowe zanieczyszczenia oraz różnego rodzaju pozostałości z odczynników stosowanych do oczyszczania DNA, takich jak etanol, SDS, proteina­za K, EDTA czy fenol, mogą bardzo hamować aktywność enzymatyczną polimerazy DNA. Stauffer i wsp. [42] wy­kryli obecność inhibitorów PCR w 1,9-2,5% próbek po­chodzących z dróg oddechowych. W celu wykrycia obecno­ści w badanej próbce czynników hamujących PCR można wykonać kontrolę wewnętrzną z zastosowaniem starterów komplementarnych do sekwencji genów referencyjnych, które ulegają stałej ekspresji w komórkach ludzkiego na­błonka, takich jak gen β2-mikroglobuliny, β-aktyny, γ-ak­tyny, RNA-azy P, aldolazy czy dekarboksylazy ornityny.
Spośród innych czynników mogących mieć istotny wpływ na wynik badania PCR należy wymienić także dużą zmien­ność w obrębie sekwencji, do której zaprojektowano star­ter, gdyż polimeraza Taq tylko do pewnego stopnia toleru­je brak całkowitej komplementarności między sekwencją startera i matrycy. Ze względu na dużą zmienność niektó­rych wirusów (obecność typów, podtypów, wariantów), aby wykryć danego wirusa w materiale klinicznym, należy za­stosować startery i sondy komplementarne do sekwencji genów wysoce konserwatywnych i regionów charaktery­zujących się jak najmniejszą zmiennością w obrębie tych genów u poszczególnych typów czy też podtypów wiru­sa. Na przykład startery i sondy wykrywające hAdV pro­jektowane są często do regionu genu kodującego białko heksonowe o dużym stopniu homologii u wszystkich ty­pów adenowirusów [18,39], a w przypadku wirusa RS - do regionu w obrębie genu N uważanego za najbardziej kon­serwatywny dla obu typów wirusa (RSVA i RSVB) [15]. W przypadku PIV przeważnie wykrywa się gen hemaglu­tyniny-neuraminidazy, a u hRV i EV sekwencje w obrębie regionu niekodującego (5'-NCR) [29]. Natomiast w przy­padku wirusa grypy - najbardziej konserwatywnymi gena­mi są geny kodujące białko M oraz nukleoproteinę, które są najczęściej wykorzystywane do projektowania starterów/sond mających wykrywać wirusa grypy A lub B. Chcąc różnicować szczepy wirusa grypy A należy wykorzystać startery/sondy hybrydyzujące do regionów konserwatyw­nych w obrębie genu określonego typu hemaglutyniny i/lub neuraminidazy.
Istotną zaletą PCR jest możliwość sekwencjonowania uzy­skanego produktu PCR, co jest wykorzystywane w bada­niach epidemiologicznych do oceny pokrewieństwa krążą­cych w populacji wirusów (analiza filogenetyczna), pozwala na porównanie sekwencji tych szczepów z sekwencjami in­nych szczepów izolowanych w kraju i na świecie, moni­torowanie zmienności patogenów, a także umożliwia wy­krywanie różnych mutacji w genomie, związanych m.in. z opornością na leki przeciwwirusowe czy z chorobotwór­czością danego patogenu.
Jedną z często stosowanych w diagnostyce zakażeń wiru­sowych modyfikacji PCR jest nested PCR (tzw. zagnież­dżony PCR lub gniazdowy PCR), polegający na wykona­niu amplifikacji w dwóch etapach z zastosowaniem różnych par starterów (drugi etap przebiega ze starterami komple­mentarnymi do sekwencji znajdującej się wewnątrz frag­mentu powstałego w pierwszym etapie). Dwie rundy am­plifikacji i użycie w każdej z nich innej pary starterów znacznie ogranicza prawdopodobieństwo amplifikacji nie­swoistych sekwencji i sprawia, że nested PCR jest techniką bardziej czułą i swoistą niż klasyczny PCR. Jednak zwięk­szenie liczby etapów powoduje wzrost ryzyka zanieczysz­czenia krzyżowego.
Obecnie klasyczny PCR jest coraz częściej wypierany przez real-time PCR, czyli PCR z analizą przyrostu pro­duktu w czasie rzeczywistym. Metoda ta znacznie skra­ca czas potrzebny na uzyskanie wyniku i postawienie dia­gnozy, z kilku godzin w przypadku klasycznego PCR do nawet kilkudziesięciu minut w przypadku real-time PCR. Różnica polega przede wszystkim na sposobie wykrywania powstającego w reakcji produktu amplifikacji. Elektroforeza w żelu agarozowym została zastąpiona przez wykrywanie fluorescencji bezpośrednio podczas każdego cyklu reakcji, co znacznie skraca czas analizy. Zachodzi to po zastoso­waniu różnego rodzaju formatów detekcji. Najprostszym formatem jest zastosowanie barwnika SYBR Green I, któ­ry interkalując w podwójną nić DNA, przy odpowiedniej długości fali sam emituje światło, które jest mierzone po każdym cyklu amplifikacji, dzięki czemu można śledzić przyrost powstającego produktu. Po zakończonej ampli­fikacji można dodatkowo określić temperaturę topnienia powstałego produktu przez pomiary emisji energii przez barwnik w trakcie powolnego ogrzewania próbki, dzięki czemu uzyskuje się wartość swoistą dla danej sekwencji. Innym sposobem wykrywania jest zastosowanie różnego typu sond (TaqMan, Scorpions, HybProbes, Molecular Beacons). Są one znakowane florochromem i komplemen­tarne do amplifikowanego fragmentu DNA dzięki użytym w reakcji starterom, które dodatkowo zwiększają swoistość badania. Istnieje wiele prac, w których opisano metody wy­krywania różnych wirusów wywołujących zakażenia dróg oddechowych za pomocą reakcji real-time PCR, z poda­nymi sekwencjami sond i starterów [20]. W porównaniu z klasyczną metodą PCR, real-time PCR charakteryzuje się lepszą czułością i swoistością [3,11,31,48].
Pomiar przyrostu produktu amplifikacji po każdym cyklu reakcji daje możliwość określenia wyjściowej zawartości wirusowego RNA/DNA w badanych próbkach. Wartość pro­gowa CT (cycle threshold) przedstawia liczbę cykli, po któ­rych poziom fluorescencji przekracza zdefiniowaną wartość progową i w oparciu o dane krzywej wzorcowej, pozwa­la oznaczyć liczbę kopii wirusa w mieszaninie na począt­ku reakcji (ilościowy real-time PCR). Dzięki temu real-ti­me PCR jest cennym narzędziem diagnostycznym dającym możliwość przewidywania stanu zakażenia, identyfikację różnych etapów wirusowego zakażenia czy monitorowanie skuteczności zastosowanej terapii przeciwwirusowej [3,40]. Ilościowy wynik badania może być pomocny w podjęciu decyzji dotyczącej modyfikacji dawki leku przeciwwiruso­wego np. w przypadku pojawienia się skutków ubocznych lub zmianie leczenia na bardziej skuteczne.
Największą wadą technik opartych na PCR, która najczę­ściej ogranicza ich zastosowanie w rutynowej diagnostyce (jako metoda pierwszego wyboru) są duże koszty, szcze­gólnie w przypadku diagnostyki nieukierunkowanej na wykrywanie określonego patogenu, kiedy trzeba brać pod uwagę wiele różnych czynników etiologicznych. W celu usprawnienia i obniżenia kosztów badania coraz częściej wykorzystuje się zestawy starterów do identyfikacji wię­cej niż jednego wirusa w pojedynczej reakcji, tzw. multi­pleks PCR (RT-PCR). Pozwala to na uzyskanie w jednej mieszaninie reakcyjnej produktów amplifikacji nawet kil­ku różnych fragmentów DNA, z których każdy jest swoisty dla innego wirusa. Największe zalety reakcji multiplekso­wych to przede wszystkim mniejsze zużycie odczynników (a tym samym niższy koszt analizy) i matrycowego DNA lub RNA oraz oszczędność czasu, szczególnie w przypad­ku konieczności badania dużej liczby próbek. Inną niezwy­kle ważną zaletą reakcji multipleksowych jest możliwość rozpoznania koinfekcji. W przypadku pojedynczych reak­cji, po uzyskaniu pozytywnego wyniku często nie wykonu­je się dalszych badań w kierunku innych wirusów związa­nych z zakażeniami dróg oddechowych. Tymczasem liczne badania wskazują, iż mieszane wirusowe zakażenia dróg oddechowych, w tym wywołane przez trzy lub więcej wi­rusów, mogą stanowić nawet do 20-50% analiz z wyni­kiem dodatnim [8,12,27,30,35,37,38].
Reakcje multipleksowe są trudne do optymalizacji. Wśród najważniejszych czynników, które mogą obniżyć ich wydaj­ność należy wymienić zwiększone ryzyko powstawania di­merów starterów, dimerów sonda-starter lub nawet sonda­-sonda, a także kompetycję między amplikonami o różnej wielkości. Dlatego w przypadku optymalizacji takich re­akcji należy zwrócić szczególną uwagę, aby startery i son­dy wykorzystywane do identyfikacji poszczególnych wiru­sów nie tworzyły ze sobą dimerów oraz nie przyłączały się nieswoiście do sekwencji zawartych w genomach innych wirusów. Należy także pamiętać, że reakcje te powinna charakteryzować czułość porównywalna do czułości po­jedynczych reakcji, kiedy to każdy z patogenów wykrywa­ny jest w osobnej próbie. W literaturze opisano dotychczas wiele reakcji multipleksowych mających na celu wykry­cie w badanej próbce klinicznej materiału genetycznego różnych wirusów wywołujących zakażenia dróg oddecho­wych [5,10,32,53]. Dostępne są liczne komercyjne zestawy multipleks PCR przeznaczone do identyfikacji tych pato­genów [13,23,27,38].
Porównując czułość różnych metod opartych na PCR z kon­wencjonalnymi metodami wykorzystywanymi w diagnosty­ce wirusów wywołujących zakażenia układu oddechowe­go, w tym uznawaną za złoty standard metodą hodowlaną, liczne dane literaturowe wskazują na przewagę tych pierw­szych [4,9,24,28,31,37,44,46,48,53]. PCR umożliwia wy­krycie cząstek wirusa niezdolnych do replikacji, a także wymaga mniejszej liczby wirionów niż liczba niezbęd­na do wywoływania wykrywalnego poziomu hemaglu­tynacji. Richard i wsp. [37] w testach opartych o metodę amplifikacji określonych fragmentów kwasu nukleinowe­go wykryli o 83 (47,9%) próbek dodatnich więcej w po­równaniu z izolacją wirusów w hodowlach komórkowych. Najbardziej znacząca poprawa nastąpiła w przypadku wy­krywania zakażeń wywołanych hRV (21,2% próbki dodat­nie w badaniu PCR i zaledwie 2,2% w hodowli). W innych badaniach van Elden i wsp. [48] monitorowali przebieg za­każenia u sześciu pacjentów zakażonych wirusem grypy (2 IV-B i 4 IV-A (H3N2)). Pobrano 30 próbek popłuczyn z nosa w 1, 3, 7 i 14 dniu po wystąpieniu objawów grypo­podobnych. Porównując wyniki badań przeprowadzonych techniką real-time PCR z krzywą wzorcową wykonaną na podstawie wyników amplifikacji kolejnych seryjnych roz­cieńczeń szczepów wzorcowych oznaczanych z wykorzy­staniem mikroskopii elektronowej, określano liczbę kopii wirusowego RNA w analizowanych próbkach. W przy­padku real-time PCR u czterech pacjentów wykryto wirus grypy jeszcze 7 dnia po pojawieniu się objawów, podczas gdy hodowla w tym dniu była pozytywna tylko w jednym przypadku. Ponadto autorzy badając 98 próbek klinicz­nych w kierunku IV-A i IV-B wykazali, że czułość osią­gnięta dzięki zastosowaniu metody real-time PCR wyno­siła 66%, a dla hodowli wirusa jedynie 35%. W innych badaniach [46] real-time PCR zwiększył wykrywalność wirusów wywołujących zakażenia układu oddechowego z 24 na 43% w przypadku próbek pochodzących od dzie­ci i z 3,5 na 36% w przypadku próbek pobranych od doro­słych. Natomiast Wu i wsp. [53] analizując 189 materiałów klinicznych uzyskali 81 wyników dodatnich (42,9%) w PCR i jedynie 46 dodatnich (24,3%) w hodowli. Kuypers i wsp. [24] porównywali czułość metody IF z techniką real-time PCR przy wykrywaniu wirusa RS, IV-A, PIV-1, -2 i -3 oraz hAdV. Co najmniej jeden z tych wirusów został wykryty w 436 próbkach (38,3%) badanych metodą IF oraz w 550 próbkach (48,3%) badanych metodą PCR. Średnia liczba kopii wirusa w próbkach pozytywnych w obu badaniach była istotnie statystycznie wyższa (6,7×107 kopi/ml) w po­równaniu z próbkami pozytywnymi tylko w badaniu PCR (4,1×104 kopi/ml) (P<0,001). Przy zastosowaniu IF wy­kryto obecność wirusów tylko w 19% próbek (37 ze 194) z liczbą kopii wirusa <106/ml, ponadto z 52 próbek, któ­re nie nadawały się do badania IF ze względu na niewiel­ką liczbę komórek w pobranym materiale, 13 (25%) było pozytywnych w badaniu PCR. Mentel i wsp. [31] badając 71 aspiratów z jamy nosowo-gardłowej pobranych od dzie­ci hospitalizowanych podczas epidemii wirusa RS wykaza­li, że metoda real-time PCR była o 25% czulsza niż nested PCR i aż o 60% bardziej czuła niż test ELISA.
Bredius i wsp. [4] wykazali zależność między wartością CT, a wyjściowym stężeniem cząstek wirusa w materiale. Wszystkie próbki, dla których uzyskano wartość CT rów­ną 27-42 były ujemne w hodowli i DIF. W innych bada­niach Templeton i wsp. [44] dla 67 próbek dodatnich w ho­dowli i real-time PCR dla IV-A, IV-B, RSV, PIV-1, -2, -3, -4, uzyskali średnią wartość CT równą 26, natomiast dla 20 próbek ujemnych w hodowli a dodatnich w real-time PCR średnia wartość CT była znacząco wyższa i wynosi­ła 37,5 (P<0,001).
Obecnie w rutynowej diagnostyce wirusologicznej za­każeń dróg oddechowych znalazły zastosowanie także metody oparte na amplifikacji RNA, przede wszystkim NASBA (nucleic acid sequenced based amplification) [20,26]. W przeciwieństwie do PCR w NASBA matrycą jest RNA, a produktem amplifikacji jednoniciowe RNA o przeciwnym kierunku od wyjściowej matrycy. Reakcja jest izotermiczna i przebiega bez cyklicznych zmian tem­peratury (42°C). Ponadto jest znacznie bardziej złożo­na biochemicznie, wykorzystuje trzy różne enzymy: od­wrotną transkryptazę (RT), RN-azę H i polimerazę RNA faga T7 oraz dwa rodzaje starterów, z których jeden za­wiera na końcu 5' promotor rozpoznawany przez polime­razę RNA faga T7. Starter ten hybrydyzuje z docelowym RNA, następnie za pomocą enzymu RT następuje przepi­sanie sekwencji na sekwencję cDNA. Z powstałej hybry­dy RNA-cDNA, RNA jest hydrolizowany przez RN-azę H. W dalszym etapie reakcji do jednoniciowego cDNA przyłą­cza się drugi starter, a enzym RT syntetyzuje komplemen­tarną nić. Powstała w ten sposób cząsteczka dsDNA za­wierająca promotor rozpoznawany przez polimerazę RNA faga T7 jest matrycą dla syntezy RNA.
Podsumowanie
Trafna i szybka diagnostyka wirusowych zakażeń układu oddechowego umożliwia podjęcie właściwej decyzji o spo­sobie leczenia chorego, pozwala uniknąć nieuzasadnionej antybiotykoterapii i wdrożyć w odpowiednim czasie sku­teczną terapię przeciwwirusową. Ma także ważny aspekt ekonomiczny, gdyż niejednokrotnie skraca czas pobytu pa­cjenta w szpitalu, obniża koszty leczenia i hospitalizacji, zapobiega szerzeniu się zakażeń w społeczeństwie, a tak­że zakażeń szpitalnych.
W ostatnich latach dokonał się ogromny postęp w diagno­styce wirusowych zakażeń układu oddechowego, co wiąże się przede wszystkim z wprowadzeniem i coraz częstszym wykorzystaniem metod opartych na amplifikacji kwasów nukleinowych. Największą zaletą tych technik jest ich wy­soka czułość i swoistość, znacznie wyższa w porównaniu z konwencjonalnymi metodami laboratoryjnymi. Należy jednak pamiętać, iż niezależnie od zastosowanej metody wiele czynników, takich jak okres od wystąpienia objawów choroby do pobrania materiału klinicznego czy sposób po­brania i przechowywania próbki do czasu analizy, ma fun­damentalny wpływ na uzyskiwane wyniki. W przypadku diagnostyki wirusowych zakażeń układu oddechowego największą wartość kliniczną mają próbki pobrane z miej­sca zakażenia w czasie szczytu namnażania się wirusa. Wyniki badań powinny być zawsze analizowane i inter­pretowane w powiązaniu z różnymi informacjami, danymi epidemiologicznymi i klinicznymi o pacjencie, czy wynika­mi dostępnymi z innych testów diagnostycznych. Zarówno zła jakość próbki, jak i źle dobrana metoda powodują iż ujemny wynik badania nie pozwala na wykluczenie po­dejrzewanego zakażenia wirusowego.
PIŚMIENNICTWO
[1] Agoritsas K., Mack K., Bonsu B.K., Goodman D., Salamon D., Marcon M.J.: Evaluation of the Quidel QuickVue Test for the detection of influenza A and B viruses in the pediatric emergency medicine setting by use of three specimen collection methods. J. Clin. Microbiol., 2006; 44: 2638-2641
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[2] Billaud G., Peny S., Legay V., Lina B., Valette M.: Detection of rhinovirus and enterovirus in upper respiratory tract samples using a multiplex nested PCR. J. Virol. Methods, 2003; 108: 223-228
[PubMed]  
[3] Borg I., Rohde G., Löseke S., Bittscheidt J., Schultze-Werninghaus G., Stephan V., Bufe A.: Evaluation of a quantitative real-time PCR for the detection of respiratory syncytial virus in pulmonary disease. Eur. Respir. J., 2003; 21: 944-951
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[4] Bredius R.G., Templeton K.E., Scheltinga S.A., Claas E.C., Kroes A.C., Vossen J.M.: Prospective study of respiratory viral infections in pediatric hemopoietic stem cell transplantation patients. Pediatr. Infect. Dis. J., 2004; 23: 518-522
[PubMed]  
[5] Brittain-Long R., Nord S., Olofsson S., Westin J., Anderson L.M., Lindh M.: Multiplex real-time PCR for detection of respiratory tract infections. J. Clin. Virol., 2008; 41: 53-56
[PubMed]  
[6] Brydak L.B.: Pandemia grypy, mit czy realne zagrożenie?. Oficyna Wydawnicza Rytm, Warszawa 2008
[7] Brydak L.B., Machała M.: Inhibitory neuraminidazy wirusa grypy. Przewodnik Lekarza, 2001; 4: 55-60
[8] Calvo C., García-García M.L., Blanco C., Vázquez M.C., Frías M.E., Pérez-Brena P., Casas I.: Multiple simultaneous viral infections in infants with acute respiratory tract infections in Spain. J. Clin. Virol., 2008; 42: 268-272
[PubMed]  
[9] Caram L.B., Chen J., Taggart E.W., Hillyard D.R., She R., Polage C.R., Twersky J. Schmader K., Petti C.A., Woods C.W.: Respiratory syncytial virus outbreak in a long-term care facility detected using reverse transcriptase polymerase chain reaction: an argument for real-time detection methods. J. Am. Geriatr. Soc., 2009; 57: 482-485
[PubMed]  
[10] Chang H.K., Park J.H., Song M.S., Oh T.K., Kim S.Y., Kim C.J., Kim H., Sung M.H., Han H.S., Hahn Y.S., Choi Y.K.: Development of multiplex rt-PCR assays for rapid detection and subtyping of influenza type A viruses from clinical specimens. J. Microbiol. Biotechnol., 2008; 18: 1164-1169
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[11] Dagher H., Donninger H., Hutchinson P., Ghildyal R., Bardin P.: Rhinovirus detection: comparison of real-time and conventional PCR. J. Virol. Methods, 2004; 117: 113-121
[PubMed]  
[12] Do A.H.L., van Doorn H.R., Nghiem M.N., Bryant J.E., Hoang T.H., Do Q.H., Van T.L., Tran T.T., Wills B., Nguyen V.C., Vo M.H., Vo C.K., Nguyen M.D., Farrar J., Tran T.H., de Jong M.D.: Viral etiologies of acute respiratory infections among hospitalized Vietnamese children in Ho Chi Minh City, 2004-2008. PLoS One, 2011; 6: e18176
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[13] Drews S.J., Blair J., Lombos E., DeLima C., Burton L., Mazzulli T., Low D.E.: Use of the Seeplex RV Detection Kit for surveillance of respiratory viral outbreaks in Toronto, Ontario, Canada. Ann. Clin. Lab. Sci., 2008; 38: 376-379
[PubMed]  
[14] Fong C.K.Y., Lee M.K., Griffith B.P.: Evaluation of R-Mix fresh cells in shell vials for detection of respiratory viruses. J. Clin. Microbiol., 2000; 38: 4660-4662
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[15] Freymuth F., Eugene E., Vabret A., Petitjean J., Gennetay E., Brouard J., Duhamel J.F., Guillois B.: Detection of respiratory syncytial virus by reverse transcription-PCR and hybridization with a DNA enzyme immunoassay. J. Clin. Microbial., 1995; 33: 3352-3355
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[16] George K.S. Patel N.M., Hartwig R.A., Scholl D.R., Jollick J.A., Kauffmann L.M., Evans M.R., Rinaldo C.R.: Rapid and sensitive detection of respiratory virus infections for direct antiviral treatment using R-Mix Cultures. J. Clin. Virol., 2002; 24: 107-115
[PubMed]  
[17] Grijalva C.G., Poehling K.A., Edwards K.M., Weinberg G.A., Staat M.A., Iwane M.K., Schaffner W., Griffin M.R.: Accuracy and interpretation of rapid influenza tests in children. Pediatrics, 2007; 119: e6-e11
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[18] Hierholzer J.C., Halonen P.E., Dahlen P.O., Bingham P.G., McDonough M.M.: Detection of adenowirus in clinical specimens by polymerase chain reaction and liquid-phase hybridization quantitated by time-resolved fluorometry. J. Clin. Microbiol., 1993; 31: 1886-1891
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[19] Huang Y.T., Turchek B.M.: Mink lung cells and mixed mink lung and A549 cells for rapid detection of influenza virus and other respiratory viruses. J. Clin. Microbiol., 2000; 38: 422-423
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[20] Ieven M.: Currently used nucleic acid amplification tests for the detection of viruses and atypicals in acute respiratory infections. J. Clin. Virol., 2007; 40: 259-276
[PubMed]  
[21] Kearney M.T., Cotton J.M., Richardson P.J., Shah A.M.: Viral myocarditis and dilated cardiomyopathy: mechanisms, manifestations and management. Postgrad. Med. J., 2001; 77: 4-10
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[22] Kim S.R., Ki C.S., Lee N.Y.: Rapid detection and identification of 12 respiratory viruses using dual priming oligonucleotide system-based multiplex PCR assay. J. Virol. Methods, 2009; 156: 111-116
[PubMed]  
[23] Kuypers J., Wright N., Ferrenberg J., Huang M.L., Cent A., Corey L., Morrow R.: Comparison of real-time PCR assays with fluorescent-antibody assays for diagnosis of respiratory virus infections in children. J. Clin. Microbiol., 2006; 44: 2382-2388
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[24] Langford C.: The age pattern of mortality in the 1918-19 influenza pandemic: an attempted explanation based on data for England and Wales. Med. His., 2002; 46: 1-20
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[25] Lau L.T., Feng X.Y., Lam T.Y., Hui H.K., Yu A.C.: Development of multiplex nucleic acid sequence-based amplification for detection of human respiratory tract viruses. J. Virol. Methods, 2010; 168: 251-254
[PubMed]  
[26] Lee J.H., Chun J.K., Kim D.S., Park Y., Choi J.R., Kim H.S.: Identification of adenovirus, influenza virus, parainfluenza virus, and respiratory syncytial virus by two kinds of multiplex polymerase chain reaction (PCR) and shell vial culture in pediatric patients with viral pneumonia. Yonsei Med. J., 2010; 51: 761-767
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[27] Liao R.S., Tomalty L.L., Majury A., Zoutman D.E.: Comparison of viral isolation and multiplexs real-time reverse transcription-PCR for confirmation of respiratory syncytial virus and influenza virus detection by antigen immunoassays. J. Clin. Microbiol., 2009; 47: 527-532
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[28] Mahony J.B.: Detection of respiratory viruses by molecular methods. Clin. Microbiol. Rev., 2008; 21: 716-747
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[29] Meerhoff T.J., Houben M.L., Coenjaerts F.E., Kimpen J.L., Hofland R.W., Schellevis F., Bont L.J.: Detection of multiple respiratory pathogens during primary respiratory infection: nasal swab versus nosopharyngeal aspirate using real-time polymerase chain reaction. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 2010; 29: 365-371
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[30] Mentel R., Wegner U., Bruns R., Gürtler L.: Real-time PCR to improve the diagnosis of respiratory syncytial virus infection. J. Med. Microbiol., 2003; 52: 893-896
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[31] Molenkamp R., van der Ham A., Schinkel J., Beld M.: Simultaneous detection of five different DNA targets by real-time Taqman PCR using the Roche LightCycler480: application in viral molecular diagnostics. J. Virol. Methods, 2007; 141: 205-211
[PubMed]  
[32] Murray C.J., Lopez A.D., Mathers C.D., Stein C.: The Global Burden of Disease 2000 project: aims, methods and data sources. Global Programme on Evidence for Health Policy Discussion Paper no. 36 (14.10.2011)
http://www.who.int/healthinfo/paper36.pdf
[33] Nakamura S., Katamine S., Yamamoto T., Foung S.K., Kurata T., Hirabayashi Y., Shimada K., Hino S., Miyamoto T.: Amplification and detection of a single molecule of human immunodeficiency virus RNA. Virus Genes, 1993; 7: 325-338
[PubMed]  
[34] Nascimento M., Souza A.V., Ferreira A.V., Rodrigues J.C., Abramovici S., Silva Filho L.V.: High rate of viral identification and coinfections in infants with acute bronchiolitis. Clinics (Sao Paulo), 2010; 65: 1133-1137
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[35] Paranhos-Baccala G., Komurian-Pradel F., Richard N., Vernet G., Lina B., Floret D.: Mixed respiratory virus infections. J. Clin. Virol., 2008; 43: 407-410
[PubMed]  
[36] Richard N., Komurian-Pradel F., Javouhey E., Perret M., Rajoharison A., Bagnaud A., Billaud G., Vernet G., Lina B., Floret D., Paranhos-Baccala G.: The impact of dual viral infection in infants admitted to a pediatric intensive care unit associated with severe bronchiolitis. Pediatr. Infect. Dis. J., 2008; 27: 213-217
[PubMed]  
[37] Jones S.R.: Potential complications of influenza A infections. West. J. Med, 1976; 125: 341-346
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[38] Roh K.H., Kim J., Nam M.H., Yoon S., Lee C.K., Lee K., Yoo Y., Kim M.J., Cho Y.: Comparison of the seeplex reverse transcription PCR assay with the R-mix viral culture and immunofluorescence techniques for detection of eight respiratory viruses. Ann. Clin. Lab. Sci., 2008; 38: 41-46
[PubMed]  
[39] Rola A., Przybylski M., Dzieciątkowski T., Turowska A., Łuczak M.: Zastosowanie metody real-time PCR z zastosowaniem sond TaqMan do wykrywania zakażeń adenowirusami człowieka. Med. Dośw. Mikrobiol., 2007; 59: 371-377
[PubMed]  
[40] Rynans S., Dzieciątkowski T., Krenke R., Grabczak M., Kołkowska-Leśniak A., Przybylski M., Sulowska A., Chazan R., Warzocha K., Młynarczyk G.: Wykorzystanie ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym do wykrywania zakażeń dolnych dróg oddechowych wywołanych adenowirusami u osób z chorobami nowotworowymi układu krwiotwórczego. Przegl. Epidemiol., 2011; 65: 333-338
[PubMed]  [Full Text PDF]  
[41] Spackman E., Senne D.A., Myers T.J., Bulaga L.L., Garber L.P., Perdue M.L., Lohman K., Daum L.T., Suarez D.L.: Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J. Clin. Microbiol., 2002; 40: 3256-3260
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[42] Stauffer F., Haber H., Rieger A., Mutschlechner R., Hasenberger P., Tevere V.J., Young K.K.: Genus level identification of mycobacteria from clinical specimens by using an easy-to-handle Mycobacterium-specific PCR assay. J. Clin. Microbiol., 1998; 36: 614-617
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[43] Stefańska I., Romanowska M., Donevski S., Nowak I., Brydak L.B.: Molecular detection of influenza during pandemic A/H1N1/v in Poland. Konferencja naukowa: Options for the Control of Influenza VII, 3-7.09. 2010, Hong Kong SAR, Chiny
[44] Templeton K.E., Scheltinga S.A., Beersma M.F., Kroes A.C., Claas E.C.: Rapid and sensitive method using multiplex real-time PCR for diagnosis of infections by influenza A and B viruses, respiratory syncytial virus, and parainfluenza viruses 1, 2, 3, and 4. J. Clin. Microbiol., 2004; 42: 1564-1569
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[45] Uyeki T.M., Prasad R., Vukotich C., Stebbins S., Rinaldo C.R., Ferng Y., Morse S.S., Larson E.L., Aiello A.E., Davis B., Monto A.S.: Low sensitivity of rapid diagnostic test for influenza. Clin. Infect. Dis., 2009; 48: e89-e92
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[46] van de Pol A.C., van Loon A.M., Wolfs T.F., Jansen N.J., Nijhuis M., Breteler E.K., Schuurman R., Rossen J.W.: Increased detection of respiratory syncytial virus, influenza viruses, parainfluenza viruses, and adenoviruses with real-time PCR in samples from patients with respiratory symptoms. J. Clin. Microbiol., 2007; 45: 2260-2262
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[47] van den Hoogen B.G., van Doornum G.J., Fockens J.C., Cornelissen J.J., Beyer W.E., de Groot R., Osterhaus A.D., Fouchier R.A.: Prevalence and clinical symptoms of human metapneumovirus infection in hospitalized patients. J. Infect. Dis., 2003; 188: 1571-1577
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[48] van Elden L.J., Nijhuis M., Schipper P., Schuurman R., Loon A.M.: Simultaneous detection of influenza viruses A and B using real-time quantitative PCR. J. Clin. Microbiol., 2001; 39: 196-200
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[49] Whiley D.M., Syrmis M.W., Mackay I.M., Sloots T.P.: Detection of human respiratory syncytial virus in respiratory samples by LightCycler Reverse Transcriptase PCR. J. Clin. Microbiol., 2002; 40: 4418-4422
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  
[50] WHO: Cumulative number of confirmed human cases for avian influenza A(H5N1) reported to WHO, 2003-2011 (12.12.2011)
http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/EN_GIP_20111129CumulativeNumberH5N1cases.pdf
[51] WHO: Summary of probable SARS cases with onset of illness from 1 November 2002 to 31 July 2003 (12.12.2011)
http://www.who.int/csr/sars/country/table2004_04_21/en/index.html
[52] WHO: WHO information for laboratory diagnosis of pandemic (H1N1) 2009 virus in humans - revised (12.12.2011)
http://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/WHO_Diagnostic_RecommendationsH1N1_20090521.pdf
[53] Wu C., Cheng X., He J., Lv X., Wang J., Deng R., Long Q., Wang X.: A multiplex real-time RT-PCR for detection and identification of influenza viruses A and B and subtypes H5 and N1. J. Virol. Methods, 2008, 148: 81-88
[PubMed]  
[54] Xepapadaki P., Psarras S., Bossios A., Tsolia M., Gourgiotis D., Liapi-Adamidou G., Constantopoulos A.G., Kafetzis D., Papadopoulos N.G.: Human metapneumovirus as a causative agent of acute bronchiolitis in infants. J. Clin. Virol., 2004; 30: 267-270
[PubMed]  
Autorki deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów